The main adherent cell types derived from human muscle are myogenic cells and fibroblasts. Here, cell populations are enriched using magnetic-activated cell sorting based on the CD56 antigen. Subsequent immunolabelling with specific antibodies and use of image analysis techniques allows quantification of cytoplasmic and nuclear characteristics in individual cells.
Reparation och förnyelse av skelettmuskulatur kräver verkan av satellitceller, som är de bosatta muskelstamceller. Dessa kan isoleras från mänsklig muskelbiopsiprover med enzymatisk nedbrytning och deras myogena egenskaper som studerats i kulturen. Kvantitativt de två huvud vidhäftande celltyper som erhållits från enzymatisk nedbrytning är: (i) satellitceller (benämnda myogena celler eller muskel prekursorceller), identifierade ursprungligen som CD56 + och senare som CD56 + / desmin + celler och (ii) muskel- härledda fibroblaster, som identifierats som CD56 – och TE-7 +. Fibroblaster föröka mycket effektivt i kulturen och i blandade cellpopulationer dessa celler kan överskridande myogena celler att dominera kulturen. Isoleringen och reningen av olika celltyper från människans muskler är därför en viktig metodologisk övervägande när man försöker utreda medfödda beteende antingen celltyp i kultur. Här Descr viIbe ett system för sortering baserad på den milda enzymatisk nedbrytning av celler med användning av kollagenas och dispas följt av magnetisk aktiverad cellsortering (MACS) som ger både en hög renhet (> 95% myogena celler) och gott utbyte (~ 2,8 x 10 6 ± 8,87 x 10 5 celler / g vävnad efter 7 dagar in vitro) för försök i odling. Detta synsätt bygger på inkubering av blandade muskel-härledda cellpopulation med magnetiska mikrokulor kulor konjugerade till en antikropp mot CD56 och därefter passerar celler men ett magnetfält. CD56 + celler bundna till mikropärlor behålls av området medan CD56 – celler passerar obehindrat genom kolonnen. Cellsuspensioner från något skede av sorteringsprocessen kan pläteras och odlas. Efter en given ingripande, cellmorfologin, och uttrycket och lokalisering av proteiner, inklusive kärntranskriptionsfaktorer kan kvantifieras med hjälp av immunofluorescens märkning med specifika antikroppar och en bild processing och analyspaketet.
Reparation och förnyelse av skelettmuskulatur kräver åtgärd av satellit celler 1, de myogena stamceller 2,3. In vivo dessa celler finns i ett reversibelt vilotillstånd belägen mellan sarcolemma och basala lamina varje myofibre, men att aktiveras för att föröka sig, säkring och differentiera som muskelvävnad är skadad, repareras och regener 3. Satellit celler kan isoleras från unga och äldre människans muskelbiopsiprover med enzymatisk spjälkning 4 och deras myogena egenskaper kan därefter studeras i primär kultur 5. Effektiviteten i denna isolering process när det gäller både utbytet och renheten av cellpopulationen beror på vilka metoder som används och kan variera från prov till prov. De två viktigaste vidhäftande celltyper som erhållits från enzymatisk nedbrytning är satellitceller (numera benämnda myogena celler eller muskel prekursorceller), identifierade ursprungligen som CD56 + / desmin celler och muscle-härledda fibroblaster, som identifierats som CD56 – och TE7 + celler 5. Fibroblaster har en snabb proliferativ takt och inte genomgår irreversibel tillväxt gripande och terminal differentiering vid cell-cellkontakt som myogena celler; alltså i blandade populationer, kan fibroblaster överskridande myogena celler att dominera kulturen.
Fibroblaster har ofta setts som en irritation för muskel biologer, men det finns nu ett växande intresse för fibroblaster som celler värdig studien i sin egen rätt, särskilt som de har visat sig ha en samarbetsvillig roll med myogena celler under muskel reparation 6 . Isoleringen och reningen av olika celltyper från människans muskler är därför en viktig metodologisk övervägande när man försöker utreda medfödda beteende båda celltyperna i kultur. Fluorescens-aktiverad cellsortering (FACS) är en metod genom vilken celler kan sorteras för vidare studier och / eller räknas ochanalyseras. FACS har visat sig tillförlitligt berika mänskliga myogena celler, men utbytet av celler för efterföljande kultur har hittills inte varit hög 7. Med tanke på den begränsade efterföljare av somatiska celler som satellit cell härledda myogena celler och de mycket fattiga proliferation och differentiering i samband med åldrande 4, är mer skonsam metoder krävs. Enstaka muskelfiberkulturer erbjuder en annan, mindre aggressiv, innebär att erhålla murina satellitceller fortfarande bosatt i deras sublaminal nisch och efter deras aktivering i kultur 8,9. Detta är emellertid ofta inte möjligt från human muskelbiopsimaterial (eftersom fibrer kan sällan erhållas från senan till senan) vilket innebär att denna teknik inte kan vara tillgänglig för många forskningslaboratorier intresserade av att studera humana muskelhärledda celler. Dessutom ger den enda fiber tekniken endast mycket begränsat antal cell.
Här beskriver vi ett system för sortering baserad på gentle enzymatisk nedbrytning av celler med användning av kollagenas och dispas följt av två på varandra följande rundor av magnetisk aktiverad cellsortering (MACS) som ger både en hög renhet (> 95% myogena celler) och utbytet (~ 2,8 x 10 6 ± 8,87 x 10 5 celler / g vävnad) för experiment i kultur. CD56 anses vara den gyllene standarden ytan markör för identifiering av mänskliga satellitceller in situ 10 och in vitro 11 och erbjuder en idealisk ytmarkör kandidat för pärla fastsättning. I detta tillvägagångssätt CD56-antikroppar konjugerade till järnoxid och polysackarid-innehållande superparamagnetiska pärlor är bundna till celler och fick passera genom en höggradient magnetisk cellseparation kolonn placeras i ett starkt magnetfält 12,13. De separationskolonner är fyllda med en matris av ferromagnetiska stålull eller järnsfärer som tjänar till att fokusera magnetiska fältlinjer mot deras yta genererar starka magnetfält gradienter (~ 4tesla) 14. I dessa kolumner ens något magnetiska celler attraheras och adsorberas till ytan 14. Obundet (CD56 -) celler passerar genom kolonnen, medan CD56 + celler märkta med magnetiska mikropärlor behålls tills avlägsnande från magnetfältet 12,15.
Cellsuspensioner från något skede av sorteringsprocessen kan pläteras på den önskade densiteten för ytterligare experimentering. Efter en given ingripande de cellbeståndsdelar kan identifieras med hjälp av immuncytokemi, avbildas med brett fält eller konfokal fluorescensmikroskopi och analyseras kvantitativt med hjälp av en bildanalys strategi som tillåter snabb objektiv mätning av alla märkta celler i varje given bild. I vårt laboratorium har vi använt denna dubbla immunomagnetisk sorterings inflygning följd av bildanalys 16 för att visa att CD56 – mänskliga fibroblaster lätt transdifferentiera till adipocyter, medan myogena cells av satellit ursprung är mycket resistenta mot denna adipogena omvandling 5.
Vi har beskrivit ett immunomagentic sorteringsförfarande för selektiv anrikning av humana muskelhärledda prekursorer från små prov av muskelbiopsimaterial. Denna teknik har varit ovärderliga i vårt labb för att övervinna förlusten av humana muskelhärledda kulturerna till fibroblaster, men också för att förstå det unika beteendet av distinkta populationer av muskelhärledda stamceller. När renade myogena celler kan undersökas för förändringar i protein och / eller genuttryck, eller användas för expe…
The authors have nothing to disclose.
The authors wish to thank Carl Hobbs and Lindsey Majoram for their technical assistance, and Professor Pat Doherty for use of microscopy facilities. Dr. Agley was supported by a studentship from King’s College London. Funding from the Spurrell Trust is also acknowledged.
Collagenase D | Roche | 11088866001 | |
Dispase II | Sigma | D4693-1G | Must be filter sterilized before use |
Trypsin/EDTA | (Gibco) Invitrogen | 15400-054 | |
100 micron cell strainer | BD Biosciences | 352360 | |
Collagen solution ( 3 mg/ml in 0.1% acetic acid) | Sigma, Dorset, UK | C8919 | |
Minisart SRP15 syringe filter (0.2 micron) | Sartorius | 17573ACK | Polytetrafluorethylene (PTFE) membrane |
CD56 human Microbeads | Miltenyi Biotech | 130-050-401 | Be aware of the limited shelf life of microbeads |
Anti- fibroblast Microbeads, human | Miltenyi Biotech | 130-050-601 | |
40 μm Pre-separation filters | Miltenyi Biotech | 130-041-407 | |
Large Cell Collumns | Miltenyi Biotech | 130-042-202 | These columns come with a flow resistor. Use of the flow resistor is not necessary to obtain the high myogenic purities described here. |
LS columns | Miltenyi Biotech | 130-042-401 | |
MiniMacs Seperator | Miltenyi Biotech | 130-042-102 | This separator fits the large cell column but not the LS column. |
MidiMACS | Miltenyi Biotech | 130-042-302 | |
MACS multistand | Miltenyi Biotech | 130-042-303 | |
BSA | Sigma | Must be filter sterilized before use | |
Oil Red O | Sigma | O0625 | |
Triethyl phosphate | Sigma | 538728 | |
Whatman Paper | Sigma | Z241121-1PAK | No. 42, Ashless. To prepare the filter fold the circular filter paper to make a semi circle, then fold the semi-circle in half again to form a cone shape. Fit the cone into a funnel for filtering. |
ProLong Gold Antifade Reagent | Molecular Probes, Invitrogen | P36930 | This can be purchased with or without DAPI and does not quench initial fluorescence. |
AxioVision | Carl Zeiss | Contact Zeiss | |
Adobe Photoshop CS5 Extended | Adobe (purchased from Pugh Computers) | ADPH16982* |