Summary
El uso de dos métodos para estimar la expresión génica en las principales apéndices gustativas de Aedes aegypti, hemos identificado el conjunto de genes supuestamente subyacentes a las respuestas neuronales a compuestos amargos y repulsivas, como se determina por examen electrofisiológico.
Introduction
Compuestos como DEET, Picaridin, citronelal y IR3535 se ha demostrado eficaz para repeler mosquitos, incluyendo las importantes vectores de enfermedades Aedes aegypti 1,2. Registramos los potenciales de acción de las neuronas sensoriales asociadas con sensilla gustativo específico para determinar las células involucradas con la repelencia de mosquitos. Junto con la secuenciación de aguas abajo de los genes expresados en estos tejidos, podemos identificar los genes más probable que median las respuestas de estas células con el fin de cribar nuevos compuestos para la mejora de las capacidades de repelencia.
RNA-seq es una herramienta poderosa, convirtiéndose rápidamente en estándar para el seguimiento de los cambios temporales y espaciales en la expresión génica. Análisis de RNA-seq de apéndices quimiosensoriales de insectos y los órganos se han utilizado para descubrir receptores moleculares en varias especies de insectos 3-5, mejorando en gran medida de gen convencional búsquedas basado en la PCR-6 por el gen. Los insectos representan la clase de animales más diverso, presenta muchas oportunidades para estudiar la relación entre los genes y fenotipos únicos. Tecnología de RNA-seq se puede emplear en cualquier tejido de insectos que viven. Asimismo, el registro electrofisiológico de las células sensoriales dentro de sensilla gustativa uniporous se puede lograr en muchas especies de insectos diferentes. El emparejamiento de estas dos técnicas permite a los investigadores Para limitar los genes que participan en conjunto un fenotipo observado quimiosensorial. Las diferentes especies presentarán desafíos específicos, pero pueden informar a la conexión entre los genes de los receptores quimiosensoriales y una adaptación quimiosensorial. El tamaño y la morfología de sensilla quimiosensorial es variable y pueden requerir extensa resolución de problemas durante la grabación de los potenciales de acción para reducir el ruido e identificar señales repetibles. Las disecciones de los órganos quimiosensoriales pueden ser triviales o delicada y requiere mucho tiempo, dependiendo de la morfología y el tamaño del insecto. La recuperación de ARN de alta calidad puede requerir alguna solución de problemas, así como evitar ciertos pigmentos durantela recogida de tejidos.
Al tiempo que demuestran los efectos de los compuestos repelentes a través de ensayos de comportamiento es directa e informativo, este enfoque es intensiva en tiempo y amplia con respecto a mecanismo de acción. Electrofisiología junto con RNA-seq permite análisis más específicos de lo que impulsa a comportamientos de evitación en los insectos. Una vez que el "kit de herramientas" de la discriminación químico ha sido identificado en una especie de insecto, los intentos más específicas para mejorar en los repelentes conocidos son posibles. Los receptores y proteínas asociadas en las células sensoriales responsables de estos comportamientos pueden ser expresados de forma heteróloga para la detección química directa. Además, el modelado molecular puede predecir que los productos químicos se provocar respuestas fuertes de estos receptores 7.
La instantánea de todos los genes activos en un conjunto limitado de tejidos quimiosensoriales también puede ser útil en la identificación de genes similares en otras especies. Usando homología de secuencia y si la expresiónmilarities, los investigadores pueden formar conjuntos de receptores moleculares más probable que median las respuestas a los repelentes que son ampliamente eficaces en insectos. Presentamos el siguiente protocolo para ayudar a los investigadores en la deconstrucción de las vías chemosensory insectos y persuadir más que ahondar en la neuroetología de la no-modelo y los insectos de importancia económica.
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Protocol
1. Crianza Ae. adultos aegypti
- Los huevos eclosionan en aproximadamente ¾ de pulgada de agua en la bandeja poco profunda. El hacinamiento reducirá el tamaño de los adultos.
- Larvas posterior a 25 ° C (12 hL: 12-HD) y alimentarlos con comida para peces suelo.
NOTA: La sobrealimentación puede reducir las tasas de supervivencia. - Retire pupas individualmente por pipeta Pasteur diario y transferir a los platos de plástico (9 cm x 5,5 cm) dentro de pequeños cubos de contención con tapas de malla fina, estableciendo así 24 grupos de edad hr.
- Alimentación mosquitos adultos 10% de solución de sacarosa por bola de algodón colocado en las paredes de pantalla de una carcasa de la jaula de los mosquitos en una cámara ambiental a 27 ° C y humedad relativa del 70% bajo el mismo fotoperiodo como larvas.
- Para electrofisiología, utilice 5-10 días los animales viejos. En general, los animales más grandes producirán mejores resultados. Para el aislamiento de ARN, utilizar animales que están dentro de un mismo grupo de edad de 24 horas en el rango de edad 5-10 días.
- Determinar una concentración adecuada de electrolito (por ejemplo, 1-10 mM) que provoca una mínima actividad de las neuronas sensoriales seleccionados. NaCl 10 mM o 1 mM KCl son electrolitos razonables para poner a prueba la actividad basal al comenzar un experimento.
- Disolver cada producto químico experimental en un disolvente apropiado (si no el agua, utilizar etanol o DMSO) que tiene poco o ningún efecto sobre la actividad de pico en comparación con electrolito solo. Las concentraciones finales de etanol al 10% o 1% de DMSO son concentraciones de partida razonables.
- Seleccionar apropiado (por ejemplo la quinina por amargo o sacarosa para dulces) productos químicos de control que están bien descritos disuasorias de la alimentación o estimulantes en los insectos.
3. Electrofisiología (grabación punta 8. La figura 1)
- Electrodos de vidrio Forma tirando mecánicamente capilares de vidrio. Optimizar calor y tire ajustes para tirar de vidrio para formar recordi forma apropiadaelectrodos NG. Romper con cuidado extremo del electrodo de vidrio usando pinzas bajo un microscopio de disección para crear electrodo de punta abertura que es lo suficientemente amplia como para envolver sensillum objetivo, pero lo suficientemente pequeño para evitar el contacto con las estructuras vecinas.
- Bajo el microscopio, identificar visualmente por la morfología y la posición del objetivo sensilla / sensillum para asegurar la repetibilidad de grabación punta. Animales de preparación para permitir el libre acceso a sensilla de ángulo de entrada del electrodo.
- Insectos anestesiar adultos fríos en el congelador a -20 ° C. Evitar daños a las neuronas periféricas por la sobreexposición a las bajas temperaturas. Cortar tiras angostas de cinta de celofán con hoja de afeitar en portaobjetos de vidrio. Inmovilizar todo insecto en un portaobjetos de vidrio utilizando tiras estrechas.
- Insertar un alambre de tungsteno afilado químicamente en el tórax dorsal o el ojo para servir como el electrodo (tierra) indiferente.
- Rellene electrodo de vidrio realizada en el paso 3.1 con una solución estimulante de interés. Usando una jeringa insertada, la tapa de llenadoIllary desde finales tirado al extremo romo. Flick a cabo todas las burbujas de aire, la celebración de fin derribado. Inserte un alambre de plata (cloruración opcional) en el electrodo de vidrio realizada en el paso 3.1 para servir como registro y electrodo de estimulación.
- Conectar los electrodos a un preamplificador que está diseñado para grabaciones de contacto quimiorreceptora sensilla en los insectos. Este preamplificador (300 Hz-3 filtro de banda kHz) reducirá el tiempo de establecimiento para capturar la actividad neuronal tan cerca a los estímulos introducción posible. Recoger, almacenar y analizar las señales eléctricas utilizando un microordenador equipado con software de grabación de espiga.
NOTA: Conexión a tierra del sistema de grabación correctamente puede mejorar drásticamente la relación señal-ruido. - Estimular sensilla con una solución de control (sólo electrolito) para asegurar la funcionalidad. Cuente picos a partir de 200 ms siguientes el artefacto de estímulo para todas las preparaciones.
- Selección aleatoria de la orden de sustancias químicas de prueba para todos los experimentos, excepto los estudios de dosis-respuesta,para eliminar los prejuicios. Para los estudios de dosis-respuesta, exponer sensilla a concentraciones crecientes de la sustancia química experimental. Permita un mínimo de 3 minutos entre estímulos para asegurar una adecuada recuperación.
NOTA: Este requisito puede variar dependiendo de los insectos y sensilla. Umbral se define como la concentración para la cual el error estándar no se superponga con el error estándar para la concentración más baja ensayada.
4. Aislamiento de ARN y secuenciación (Figura 2)
- Preparar las majas RNasa libre herméticamente cerradas al enfriarlos en hielo seco antes de tejido disruption.Prepare acompañan majas sin RNasa para aerosol que se ajusten a los tubos de tapa a presión con fuerza. Mantenga los tubos de recogida cerrados a menos que la disección de forma activa para evitar el exceso de condensación.
- Utilizando aspirador filtrada, colocar 30 a 40 mosquitos en frío anestesiados (15 seg en congelador a -20ºC) en el escenario frío y ordenar por sexo. Coloque los animales dorsal lado de abajo, agarrando las alas para no dañar apéndices gustativas.
- El uso de dos pares de pinzas finas, diseccionar labella emparejado o tarsos de los machos o hembras con un microscopio de disección y limitar la inclusión de los tejidos adyacentes.
NOTA: 500 labella emparejado rinde aproximadamente 800-1,000 nanogramos de mRNA total. 400 tarsos individual (5 segmentos cada uno) producen 1,200-1,800 nanogramos de mRNA total. - Con un par de fórceps-jadeantes, ligeramente captar proboscis de mosquitos justo proximal a labella exponer estiletes interiores. Uso de otro par de collection-forceps, quitar y agregar labella tejido a lado del tubo de recogida de frío.
- Con un par de fórceps, ligeramente captar la pierna mosquito en la salida de la tibia y el primer segmento tarsal. Uso de otro par de pinzas, retire tarsos y añadir tejido a lado del tubo de recogida de frío.
NOTA: Tener en cuenta los tipos de células en la superficie del tejido deseado y no deseado. Si bien es importante para limitar la inclusión de los tejidos vecinos, es igualmente importante no omitir porciones de tejido deseado. El fimuestra final debe representar con precisión todo el órgano de interés. Crear un límite preciso con las pinzas de agarre de tal manera que el fórceps de recogida pueden liberar precisamente por raspado o agarrar sólo el tejido deseado. - Periódicamente, de girar el tubo de recogida brevemente en 0 ° C centrifugar a 9000 xg para mantener el tejido en la parte inferior del tubo. Si la humedad se acumula en tubos de recogida durante la disección, añadir 50uL de reactivo Trizol fría para cubrir el tejido recogido.
- El uso de marcadores de laboratorio anti-manchas, identificándolas claramente uno-RNasa libre de 1,5 ml encajen tubo con tapa para cada tipo de tejido para su recogida. El uso de 1,5 ml Gradilla para tubos y nitrógeno líquido, por congelación luego moler tejido en polvo fino (finas piezas si en Trizol). Repetir una vez. Aumentar el volumen total de Trizol a 1 ml y resuspender tejido fundamental por agitación.
- Añadir 200 ul de cloroformo y mezclar bien. Después de 5 min a temperatura ambiente, de girar en centrífuga a 4 ° C y 11.000 xg durante 15 min. Cuidadosamenteañadir capa acuosa directamente a una columna de filtro de ADN genómico. Centrifugar a 11.000 x g durante 5 min. Añadir un volumen igual de RNasa libre de 70% de etanol a fluir a través y mezclar pipeta. Traslado líquido a una columna colección ARN y continuar la extracción de RNA según las instrucciones proporcionadas.
- Cuantificar y evaluar la pureza del ARN total en un espectrofotómetro precisión y proceder con cualquier método de secuenciación de ARN estándar.
5. RT-PCR cuantitativa Validación de RNA Sequencing (Figura 3)
- Seleccione tantos genes como posible comparar relativos niveles de expresión génica en un rango dinámico, tanto en abundancia predicho secuencia y función de los genes quimiosensorial presunta.
- Pares de cebadores de diseño para cada gen diana para amplificar un 100 a 180 pares de bases producto de PCR específico. Excluir amplificación gDNA no específica asegurando al menos un cebador por juego abarca un límite de intrón. También puede utilizar el tratamiento DNasa para reducir la contaminación genómica.
- Recogertejido de insectos como se describe en la sección anterior. Calcular la cantidad de tejido que se requiere para proporcionar suficiente ARN para completar todas las reacciones QRT-PCR.
NOTA: triplicado Biológica y reacciones por triplicado técnicos proporcionarán máxima confianza en los resultados. - Calcula la cuantificación relativa de genes como objetivo X - (Ct [target] -Ct [referencia]) para cada gen diana y medio para cada replicar, tanto biológica como técnico. Utilice gen (s) de limpieza para normalizar los valores de Ct entre las réplicas biológicas y erradicar la escala del eje Y en las comparaciones de expresión relativa.
- Evaluar la similitud de RNA-seq y conjuntos de datos qRT-PCR utilizando el, procedimiento de equivalencia de arranque basado en la regresión 9, iterativa aplicado, a los datos de cada tejido.
NOTA: Este procedimiento identifica la "región de similitud" más pequeño que puede ser construido en torno a los datos de RNA-seq y QRT-PCR observado, y permitir la expresión génica relativa medido por QRT-PCR para ser considerado estadísticamente equivalente a la medición de la expresión génica relativa por RNA-seq.
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Representative Results
Los registros de Trace de potenciales de acción de Ae. aegypti sensilla gustativa (Figura 1) demuestran la eficacia de la estimulación directa con una gama de productos químicos. Esta técnica se puede utilizar para cuantificar las respuestas a la estimulación de cualquier producto químico contando los picos de una amplitud y duración dada durante un intervalo de tiempo razonable (generalmente menos de 500 ms). Grabaciones de rastreo deben ser fácilmente reproducible bajo un conjunto dado de condiciones experimentales. De lo contrario, las respuestas fisiológicas observadas pueden representar fenotipos poco comunes entre los individuos de la especie estudiada.
Datos de RNA-seq Raw requiere filtración y la cartografía exacta antes de ser presentado como RPKM redondeado (el número de mapeado lee por longitud kilobases de transcripción por millón lecturas mapeadas) o FPKM (el número de fragmentos de lectura por longitud de kilobases de transcripción por millón lecturas mapeadas) valores numéricos (Figura 2). La distinción entreestos dos métodos de normalización de ARN-seq ha sido descrita en dos obras seminales 10,11. Una ventaja de secuenciación total de ARNm es la capacidad de detectar la expresión de grandes familias de genes simultáneamente. La presentación visual de la expresión de muchos genes a la vez permite una comprensión única del conjunto de herramientas moleculares para un tejido dado. Las comparaciones entre sexos, etapas de desarrollo o tipos de tejidos se pueden hacer rápidamente.
Biológica repeticiones para conjuntos de datos de RNA-seq pueden estar limitadas por coste o la dificultad de la recogida de tejidos. QRT-PCR ofrece la posibilidad de validar pequeños subgrupos de la expresión génica total a un costo menor y requiere menos ARN fuente. Lado a comparaciones de datos secundarios (Figura 3A) permitir una mayor confianza en los resultados de ARN-ss, como los dos métodos se basan en diferentes químicas para la estimación de la abundancia de genes. Funciones de equivalencia estadística (Figura 3B) demuestran los límites de la seguridad en cada caso.
Figura 1: Registros electrofisiológicos de un sensillum de tamaño mediano en el labelo de Ae. Aegypti, modificados de trabajo citado 12. Las huellas muestran respuestas a NaCl 100 mM, sacarosa 100 mM, quinina 1 mM, 0,8% de DEET, Picaridin 0,8%, 0,8% y 0,8% Citronelal IR3535. Los tres picos con diferentes amplitudes o formas se etiquetan a, b o c. Estos tres picos corresponden con tres subtipos de neuronas sensoriales con diferentes sensibilidades: sal, azúcar y amargo, respectivamente.
Figura 2:. Tabla de gustativa expresión del gen del receptor según lo determinado por la RNA-seq para 8 muestras de tejido, modificado a partir del trabajo citado 13 células individuales reportan valores RPKM paracada anotación de genes gustativa, tejidos masculinos (izquierda) y tejidos femeninos (derecha). Los valores numéricos se redondean a la décima más cercana. Heat-mapa de intensidad de color tiene un tope más alto RPKM y el punto medio se escala para cada familia de genes de forma individual. Sólo hay una familia de genes se muestra en este caso. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3:. Comparación de los datos qRT-PCR y los datos de RNA-seq, modificados de trabajo citado 13 (A) Cada gen quimiorrecepción del eje horizontal se representa por dos columnas de datos. La columna de la izquierda representa la expresión relativa tal como se determina por la RNA-seq; Valores RPKM de genes quimiorrecepción se dividieron por el de limpieza de genes Aaeg LASP para generar proporciones numéricas en este tejido. El derechocolumna representa la expresión relativa determinada por QRT-PCR. En primer lugar, los valores de Ct para biológica replicar genes Labella se normalizaron usando Aaeg LASP como un estándar. En segundo lugar, replicar los valores de Ct para cada gen se utilizaron para calcular los valores relativos de expresión (objetivo E - (Ct [target] -Ct [referencia])). Las barras de error indican la desviación estándar de los valores de expresión relativa calculados individualmente. (B) RNA-seq y QRT-PCR datos se compararon en un análisis por separado. Los ejes verticales representan la abundancia relativa de gen como se demostró por los datos de RNA-seq, con un valor de 1 se atribuye a la limpieza de genes Aaeg LASP y el resto de la expresión de genes que se informa relación a este valor. Los ejes horizontales representan la abundancia relativa de gen como se predijo por qRT-PCR, con un valor de 1 se atribuye a la limpieza de genes Aaeg LASP y el resto de la expresión de genes que se informa relación a este valor. Las líneas rojas representan equivalencia exacta. Las líneas discontinuas representan los límites de la "región de similitud 'de pendiente, calculada por el algoritmo de equivalencia estadística 9. Líneas negras representan la regresión de mínimos cuadrados de equivalencia QRT-PCR para la cuantificación de RNA-seq para los 12 genes diana y limpieza de genes Aaeg LASP, cada uno representado por punto círculo datos. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
El aspecto más difícil de potenciales de acción de grabación de sensilla gustativa es decidir qué respuestas son "normales". Cuando se emplea un solo punta sensillum gustativa grabar la primera vez que una especie de insectos dado, el número total y sensibilidades de las neuronas receptoras gustativas (GRNs) son probablemente desconocido. Muchas grabaciones preliminares primera obligados a decidir el alcance y las concentraciones de los productos químicos para probar. En este caso, empezamos con la observación de que un solo GRN respondió a bajas concentraciones de DEET (Figura 1). Posteriormente, se examinaron las respuestas dentro de la misma sensillum a un rango de concentraciones de sustancias químicas conocidas por ser amargo o aversivo a otros insectos y observamos una forma similar y pico de amplitud (Figura 1). Estas observaciones sugirieron que un único subtipo GRN responde a estos compuestos aversivos. Para la comparación, hemos probado compuestos azucarados conocidos para estimular la alimentación en Mosquitoes para ver si se ha producido un aumento similar. Se observó un pico diferente, más grande en este caso. Del mismo modo, se observó tercera espiga, de tamaño intermedio en respuesta a la estimulación sal, con lo que el recuento total de GRN subtipo a tres.
Preparaciones de registro electrofisiológico en los insectos son inherentemente variable. Target sensilla gustativa son típicamente muy pequeña, y debe colocarse en el ángulo correspondiente para acceder a la grabación con el electrodo de vidrio sin tocar a la cutícula. Para establecer un puente conductor a las neuronas gustativas, el poro terminal de la sensillum debe estar abierto a la linfa contenida establecer un contacto directo con el electrolito de la electrodo de registro. Hemos observado obstrucción de las aberturas sensilla, ya sea por los residuos extraños o excretado y material seco desde dentro del sensillum objetivo. Para evitar estos obstáculos, se debe tener cuidado cuando la cría y manejo de insectos para evitar el contacto con la sensilla objetivo. Además en Choocantar, insectos de ensayo sanos sin daños, factores biológicos como la edad, la alimentación de estado, el apareamiento tiempo estatal y zeitgeber se debe considerar al establecer controles para reducir la variabilidad en las grabaciones.
Puede ser difícil para obtener una preparación de respuesta consistente. Muchos ensayos pueden ser necesarios para mejorar la relación suficiente de señal a ruido para resolver los picos individuales. Variaciones experimentales sobre los preparados mencionados pueden conducir a mejores resultados. Es aconsejable establecer una respuesta contundente en su aparato de registro para sus especies de prueba utilizando un inductor pico insecto común, como la sacarosa o la quinina. Una vez que un sensillum gustativa está respondiendo, estas respuestas deben ser reproducibles. La longitud mínima de tiempo entre estimulaciones se debe determinar experimentalmente el examen de la dinámica de pico bajo diferentes restricciones temporales. La estimulación excesiva debe evitarse para preservar GRN salud y para prevenir la degradación linfático sensillum. En el caso del thasensibilidad t respuesta disminuye rápidamente después de la primera estimulación, un mayor número de preps se debe obtener para proporcionar la confianza que estas respuestas son fisiológicamente típico para la especie dada.
La solubilidad de algunas sustancias problema puede crear dificultades para hacer electrodos de estimulación, ya que algunos disolventes pueden afectar la actividad GRN, incluso a concentraciones finales bajas. Estas consideraciones pueden ser abordados a través de ensayo y error y con controles apropiados. Cualquier disolvente utilizado se debe añadir al electrolito de control y otras soluciones de prueba para garantizar la coherencia de las respuestas. Pequeños insectos de inmovilización, proporcionando así acceso directo al objetivo sensilla sin dañar los tejidos frágiles, pueden requerir de ensayo y error.
La principal limitación de electrofisiología es la desafortunada separación de las respuestas neuronales observadas y potenciales respuestas de comportamiento descendente. Por lo tanto, es ventajoso para probar las respuestas a los productos químicos que han been muestra para provocar respuestas conductuales específicos con el fin de discutir la importancia de los resultados en un contexto ecológico. Grabaciones de punta permiten la detección muy precisa de la actividad celular, por lo que esta técnica ideal para la evaluación de animales transgénicos o aquellos que presentan diferencias fenotípicas en el comportamiento. Estas grabaciones también ofrecen más información acerca de las respuestas neuronales, como la dinámica temporal y de amplitud, que los sistemas que dependen de los periodistas visuales de la actividad neuronal. En algunos casos, las respuestas neuronales se pueden cuantificar con más facilidad que los datos de comportamiento 12.
Colección de tejidos de RNA-seq y QRT-PCR es sencilla pero requiere concentración continua y atención a la preservación de material celular a través de una cámara frigorífica y evitar el exceso de humedad. Actividad de RNasa que puede afectar la calidad del ARN; por lo tanto, sólo debe ponerse en contacto con el tejido superficies limpias en toda la recolección y extracción de RNA. Aunque la solución de problemas requiere para QRT-PCR is bien documentado, los más probables trampas ocurren temprano en el proceso en el diseño de cebadores y la selección de genes diana y de limpieza. Los genes que previsiblemente representan puntos uniformemente espaciados a lo largo de una línea de nivel relativo de expresión son útiles para comparar RNA-seq y conjuntos de datos de QRT-PCR (Figura 3). Por ejemplo, la selección de genes para qPCR que muestran valores RPKM de 0, 10, 20, 30, etc., respectivamente, ofrecen un orden predecible de la abundancia para ser probado.
RNA-seq tuvo éxito a destacar humilde expresión de genes en nuestro estudio de los tejidos gustativas (Figura 2). La acumulación de genes fiable para Ae. aegypti (AaegL1.3, http://aaegypti.vectorbase.org/GetData/Downloads/) y el gen quimiorrecepción previa identificación 14 hizo anotando la expresión de genes relativamente fácil. A estos efectos, los insectos con las anotaciones de genes disponibles y identificadas las familias de genes de interés son sistemas modelo de valor. La determinación de un umbral de precisiónpara la expresión génica contra el ruido de fondo es especulativo, pero los métodos para determinar los puntos de corte razonables están disponibles 15-17. Aquí se determinó un nivel RPKM de total confianza y un nivel más bajo de confianza RPKM disminuido basado en precedentes 9 por el que enmarcamos nuestra discusión de los resultados.
En el futuro esperamos que diseccionar otros tejidos chemosensory tanto en el mosquito y otros insectos de importancia económica para ampliar nuestro conocimiento de los genes que median la repelencia de insectos. Hemos establecido varios genes gustativas candidata que son más probable mediación de las respuestas de aversión a compuestos mediante la comparación de secuencias de genes a las especies con los datos funcionales disponibles 13. Estamos generando líneas transgénicas de mosquitos que faltan estos genes chemosensory individuales. Vamos a utilizar grabaciones de punta para evaluar el papel de estos genes en la capacidad del animal para detectar repelentes conocidos y evaluar las respuestas de comportamiento de estos mutantes a repellents. En el caso de que estos genes candidatos no afectan significativamente la repelencia, puede ser necesario más de resolución para determinar más precisamente la expresión de genes o la presencia de proteínas en una sola sensillum o célula. Lowly receptores expresados pueden ser objetivos críticos para el cribado de nuevos repelentes, además de co-receptores expresados doquier. Desafortunadamente, hibridación in situ e inmunolocalización ha demostrado ser muy difícil en el tejido gustativo de insectos 18.
Una vez que hemos establecido que los genes median estas respuestas fisiológicas y comportamientos, podemos expresar estos genes en sistemas de células que son susceptibles de cribado de alto rendimiento de los repelentes de candidatos. En silico enfoques que utilizan modelado estructural 7 también puede ser útil en la predicción de qué tipos de compuestos se provocar fuertes respuestas de receptores específicos.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass capillary | A-M Systems | 628000 | Standard, 1.5 mm X 0.86 mm, 4" |
| Silver wire | A-M Systems | 7875 | .015" bare |
| Tungsten wire | Alfa Products | 369 | 0.127 mm diameter |
| Fine forceps | Fine Science Tools | 11252 | #5SF Inox |
| Refridgerated stage | BioQuip Products | 1429 | Chill Table |
| Preamplifier | Syntech | Taste Probe | preamplifier |
| Software for electrophysiology | Syntech | Autospike | software for electrophysiology |
| TetraMin fish food | Tetra | Tropical fish food granules | fish food ground to fine powder |
| TRIzol | Life Technologies | 15596-026 | RNA isolation reagent |
| RNeasy Plus Mini Kit | Qiagen | 74136 | includes gDNA eliminator and RNeasy spin columns |
| Nanodrop spectrophotometer | Nano Drop Products | ND-1000 | tabletop spectrometer |
| R statistics | freeware (created by Robert Gentleman and Ross Ihaka) | www.r-project.org | Use the lm function of the stats package and the equiv.boot function of the equivalence package in the R computing environment. |
| 1.5 ml tube rack | Evergreen | 240-6388-030 | Pour liquid nitrogen into a few empty wells to freeze and grind tissue. |
| 1.5 ml collection tubes with pestle | Grainger | 6HAX6 | RNase free |
| Centrifuge | Thermo Scientific | 11178160 | Spin down frozen tissue to keep at bottom of 1.5 ml tube. |
| Primer-BLAST Primer Designing tool | NCBI | n/a |
References
- Klun, J. A., Khrimian, A., Debboun, M. Repellent and deterrent effects of SS220, picaridin, and DEET suppress human blood feeding by Aedes aegypti, Anopheles stephensi, and Phlebotomus papatasi. J. Med. Entomol. 43 (1), 34-39 (2006).
- Dickens, J. C., Bohbot, J. D. Mini review: Mode of action of mosquito repellents.Pestic. Biochem. Physiol. 106 (3), 149-155 (2013).
- Pitts, R. J., Rinker, D. C., Jones, P. L., Rokas, A., Zwiebel, L. J. Transcriptome profiling of chemosensory appendages in the malaria vector Anopheles gambiae reveals tissue- and sex-specific signatures of odor coding. BMC Genomics. 12 (271), (2011).
- Zhou, X., Slone, J. D., Rokas, A., Berger, S. L., Liebig,, et al. Phylogenetic and transcriptomic analysis of chemosensory receptors in a pair of divergent ant species reveals sex-specific signatures of odor coding. PLOS Genet. 8 (8), e1002930 (2012).
- Shiao, M., Fan, W., Fang, S., Lu, M. J., Kondo, R., Li, W. Transcriptional profiling of adult Drosophila antenna by high-throughput sequencing. Zoological Studies. 52 (42), (2013).
- Bohbot, J., Pitts, R. J., Kwon, H. W., Rützler, M., Robertson, H. M., Zwiebel, L. J. Molecular characterization of the Aedes aegypti odorant receptor gene family. Insect Mol. Biol. 16 (5), 525-537 (2007).
- Kain, P., Boyle, S. M., Tharadra, S. K., Guda, T., Pham, C., et al. Odour receptors and neurons for DEET and new insect repellents. Nature. 502 (7472), 507-512 (2013).
- Hodgson, E. S., Lettvin, J. Y., Roeder, K. D. The physiology of a primary chemoreceptor unit. Science. 122 (3166), 417-418 (1955).
- Robinson, A. P., Duursma, R. A., Marshall, J. D. A regression-based equivalence test for model validation: shifting the burden of proof. Tree Physiol. 25 (7), 903-913 (2005).
- Mortazavi, A., Williams, B. A., McCue, K., Schaeffer, L., Wold, B. Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-seq. Nat. Methods. 5 (7), 621-628 (2008).
- Trapnell, C., Williams, B. A., Pertea, G., Mortazavi, A., Kwan, G., et al. Transcript assembly and quantification by RNA-seq reveals unannotated transcripts and isoform switching during cell differentiation. Nat. Biotechnol. 28 (5), 511-515 (2010).
- Sanford, J. L., Shields, V. D. C., Dickens, J. C. Gustatory receptor neuron responds to DEET and other insect repellents in the yellow-fever mosquito, Aedes aegypti. Naturwiss. 100 (3), 269-273 (2013).
- Sparks, J. T., Vinyard, B. T., Dickens, J. C. Gustatory receptor expression in the labella and tarsi of Aedes aegypti. Insect Biochem. Mol. Biol. 43 (12), 1161-1171 (2013).
- Kent, L. B., Walden, K. K. O., Robertson, H. M. The Gr family of candidate gustatory and olfactory receptors in the yellow-fever mosquito Aedes aegypti. Chem. Senses. 33 (1), 79-93 (2008).
- Ramsköld, D., Wang, E. T., Burge, C. B., Sandberg, R. An abundance of ubiquitously expressed genes revealed by tissue transcriptome sequence data. PLoS Comput. Biol. 5 (12), e1000598 (2009).
- Wagner, G. P., Kin, K., Lynch, V. J. A model based criterion for gene expression calls using RNA-seq data. Theory Biosci. 132 (3), 159-164 (2013).
- Hart, T., Komori, H. K., LaMere, S., Podshivalova, K., Salomon, D. D. Finding active genes in deep RNA-seq gene expression studies. BMC Genomics. 14 (778), (2013).
- Isono, K., Morita, H. Molecular and cellular designs of insect taste receptor system. Front. Cellu. Neurosci. 4 (20), 1-16 (2010).
