Summary
Met twee methodologie om genexpressie in grote smaak aanhangsels van Aedes aegypti, hebben we de set genen vermoedelijk onderliggende neuronale reacties op bitter en afstotende verbindingen geïdentificeerd, zoals bepaald door elektrofysiologische onderzoeken.
Introduction
Verbindingen zoals DEET, picaridin, Citronellal en IR3535 is aangetoond effectief af te weren muggen, waaronder de belangrijke ziekte vector Aedes aegypti 1,2. We nemen actiepotentialen van sensorische neuronen geassocieerd met specifieke smaak sensilla aan de betrokken met mug afstotende cellen te bepalen. Gekoppeld aan sequentie stroomafwaarts van uitgedrukte genen in deze weefsels kunnen we de genen waarschijnlijk medieert de respons van deze cellen om nieuwe verbindingen op verbeterde waterafstotendheid mogelijkheden screenen identificeren.
RNA-seq is een krachtig hulpmiddel, in snel tempo standaard voor het bijhouden van ruimtelijke en temporele veranderingen in genexpressie. RNA-seq analyses van insecten chemosensory appendages en organen zijn gebruikt om moleculaire receptoren ontdekken in verschillende insectensoorten 3-5, sterk verbeteren van conventionele PCR zoekopdrachten gen door gen 6. Insecten vormen de meest diverse dier klasse, prewoordigd veel mogelijkheden om de verbinding tussen genen en unieke fenotypes bestuderen. RNA-seq technologie kan worden ingezet op een levend insect weefsel. Evenzo kan elektrofysiologische opname van zintuigcellen binnen uniporous gustatory sensilla worden bereikt in veel verschillende insectensoorten. De koppeling van deze twee technieken stelt onderzoekers in staat om de set genen die betrokken zijn in een waargenomen chemosensory fenotype versmallen. Verschillende soorten zullen een bijzondere uitdaging vormen, maar kan de verbinding tussen chemosensory receptor genen en een chemosensory aanpassing op de hoogte. De grootte en morfologie van chemosensory sensilla is variabel en kunnen uitgebreide probleemoplossing vereisen bij het opnemen van actiepotentialen om ruis te verminderen en te identificeren herhaalbare signalen. Dissectie van chemosensory organen kunnen onbeduidend of delicaat en tijdrovend, afhankelijk morfologie en grootte van de insecten. Herstel van hoge kwaliteit RNA kan wat het oplossen van problemen vereisen ook, zoals het vermijden van bepaalde pigmenten tijdensweefsel collectie.
Demonstreert het effect van afstotende verbindingen door gedrags- beproevingen is direct en informatief, deze benadering is tijdsintensief en breed met betrekking tot werkingsmechanisme. Elektrofysiologie in combinatie met RNA-seq zorgt voor meer specifieke analyses van wat drijft vermijdingsgedrag bij insecten. Zodra de "toolkit" chemische discriminatie geïdentificeerd in een insectensoorten, specifieker pogingen verbeteren bekende insectenwerende mogelijk. Receptoren en geassocieerde eiwitten in sensorische cellen die verantwoordelijk zijn voor deze gedragingen kunnen heteroloog tot expressie worden gebracht voor directe chemische screening. Bovendien kunnen moleculaire modellering voorspellen welke chemicaliën sterke reacties zal uitlokken van deze receptoren 7.
De momentopname van alle actieve genen in een smalle reeks van chemosensory weefsels kan ook nuttig zijn bij het identificeren van gelijkaardige genen in andere soorten. Met behulp van homologie en expressie similarities, onderzoekers kunnen sets van de moleculaire receptoren hoogstwaarschijnlijk bemiddelen reacties op insectenwerende middelen die zijn grotendeels effectief op insecten te vormen. We presenteren de volgende protocol om onderzoekers te helpen bij het deconstrueren insect chemosensory paden en om meer te overtuigen om zich te verdiepen in de neuroethology van niet-model en economisch belangrijke insecten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Het grootbrengen Ae. aegypti volwassenen
- Hatch eieren in ongeveer ¾ inch water in ondiepe lade. Overbevolking zal de omvang van de volwassenen te verminderen.
- Achterste larven bij 25 ° C (12-hl: 12-HD) en voeden met gemalen vis eten.
OPMERKING: Overvoeren kan overlevingskansen verminderen. - Verwijder poppen individueel door Pasteur pipet dagelijks en over te dragen aan plastic schaaltjes (9 cm x 5,5 cm) in kleine insluiting emmers met fijn gaas deksels, dus tot oprichting van 24 uur leeftijdsgroepen.
- Feed volwassen muskieten 10% sucrose oplossing watje geplaatst op het scherm wanden van een kooihouderij de muggen in een klimaatkamer bij 27 ° C en 70% relatieve vochtigheid onder dezelfde fotoperiode larven.
- Voor elektrofysiologie, gebruiken 5-10 dagen oude dieren. In het algemeen zullen grotere dieren betere resultaten. Voor RNA-isolatie, gebruiken dieren die binnen een enkele 24 hr leeftijd groepering in de 5-10 dagen oude range.
- Bepaal een geschikte concentratie elektrolyt (bijvoorbeeld 1-10 mM) dat minimale activiteit ontlokt geselecteerde sensorische neuronen. 10 mM NaCl of KCl 1mM redelijk zijn elektrolyten met baseline activiteit te testen bij het begin van een experiment.
- Los elke experimentele chemische stof in geschikt oplosmiddel (indien geen water gebruikt ethanol of DMSO) die weinig of geen effect heeft op spike activiteit wanneer vergeleken met alleen elektrolyt. Eindconcentraties van 10% ethanol en 1% DMSO redelijk uitgangsconcentraties.
- Kies de juiste (bv kinine voor bitter of sucrose voor zoet) controle chemische stoffen die zijn goed beschreven voeden afschrikmiddelen of stimulerende middelen bij insecten.
3. Electrofysiologie (tip opname 8; figuur 1)
- Vorm glaselektroden door mechanisch trekken glas haarvaten. Optimaliseren van warmte en trek instellingen glas trekken om geschikt gevormde recordi vormenng elektroden. Breek voorzichtig einde van glas elektrode behulp van een tang onder een dissectiemicroscoop om elektrode tip opening die groot genoeg is om het doel sensillum envelop, maar klein genoeg om contact met naburige structuren te vermijden creëren.
- Onder een microscoop, visueel te identificeren door de morfologie en de positie van het doel sensilla / sensillum om herhaalbaarheid van tip opname te verzekeren. Prep dieren vrije toegang tot sensilla uit hoek van de elektrode toe te laten.
- Koude Verdoven volwassen insecten in de vriezer bij -20 ° C. Voorkom schade aan perifere neuronen door blootstelling aan koude temperaturen. Snij smalle stroken plakband met een scheermesje op glasplaatje. Immobiliseren hele insect op een glasplaatje met behulp van smalle stroken.
- Plaats een chemisch geslepen wolfraam draad in de dorsale thorax of het oog om te dienen als de onverschillige (grond) elektrode.
- Vul het glas elektrode gemaakt in stap 3.1 met een stimulerende oplossing van belang. Met behulp van een injectiespuit ingebracht, vuldopIllary uit trok begin tot eind af te stompen. Schud alle luchtbellen, houdt trok eind naar beneden. Plaats een zilveren draad (chloriding optioneel) in de glazen elektrode gemaakt in stap 3.1 om te dienen als opname en stimulerende elektrode.
- Verbinding elektroden een voorversterker die is ontworpen voor opnamen van contact chemoreceptive sensilla bij insecten. Deze voorversterker (300 Hz-3 kHz bandfilter) zal de afwikkeling van de tijd aan de neuronale activiteit zo dicht mogelijk bij introductie stimulus mogelijk vast te leggen verminderen. Verzamelen, opslaan en elektrische signalen met behulp van een microcomputer uitgerust met spike opname software te analyseren.
OPMERKING: Aarding de opname juist ingesteld drastisch verbeteren signaal-ruisverhouding. - Stimuleer sensilla met een controle-oplossing (alleen elektrolyt) om functionaliteit te waarborgen. Count spikes beginnend 200 msec na de stimulus artefact voor alle voorbereidingen.
- Willekeurige volgorde testchemicaliën voor alle experimenten, behalve dosis-respons studiesbias elimineren. Bij dosis-respons studies blootstellen sensilla toenemende concentraties van de experimentele chemicaliën. Laat een minimum van 3 minuten tussen prikkels om voldoende herstel te garanderen.
OPMERKING: Deze eis kan variëren, afhankelijk van insecten en sensilla. Drempel wordt gedefinieerd als die concentratie waarbij standaardfout niet overlappen met de standaardfout voor de laagste geteste concentratie.
4. RNA isolatie en sequentiebepaling (figuur 2)
- Bereid de nauwsluitende-RNAse vrij stampers door afkoeling ze op droog ijs voordat weefsel disruption.Prepare bijbehorende RNase vrij stampers dat snap cap buizen past strak. Houd verzameling buizen gesloten, tenzij actief ontleden om het overtollige condensvorming te voorkomen.
- Met behulp van gefilterde aspirator, plaatsen 30 tot 40 koud-verdoofd muggen (15 sec in de -20 ° C vriezer) op koude fase en sorteer op seks. Plaats dieren dorsale kant naar beneden, grijpen vleugels om niet smaak aanhangsels beschadigen.
- Gebruik van twee paar fijne tang, ontleden gepaarde labella of tarsi van mannen of vrouwen onder een dissectiemicroscoop en integratie van aangrenzende weefsels te beperken.
OPMERKING: 500 gepaarde labella levert ongeveer 800-1000 nanogram totaal mRNA. 400 individuele tarsi (5 segmenten elk) opleveren 1,200-1,800 nanogram totaal mRNA. - Met een paar van hijgend-tang, licht begrijpen mosquito slurf net proximaal van labella bloot innerlijke stiletten. Het gebruik van andere paar collectie-tang, verwijder labella en voeg weefsel kant van inzameling koude buis.
- Met een pincet, licht begrijpen mosquito been op het knooppunt van de tibia en de eerste tarsal segment. Het gebruik van andere pincet, verwijder tarsi en voeg weefsel naar de andere kant van inzameling koude buis.
OPMERKING: Houd rekening met de celtypes op het snijvlak van gewenste en ongewenste weefsel. Hoewel het belangrijk is om de opname van naburig weefsel te beperken, is het even belangrijk om niet gewenste delen van weefsel weg te laten. De final monster moet nauwkeurig het gehele orgaan van belang vertegenwoordigen. Maak een precieze grens met de grijptangen zodanig dat de collectie tang precies kan bevrijden door schrapen of grijpen alleen de gewenste weefsel. - Periodiek, spin down collectie buis kort in 0 ° C centrifuge bij 9000 xg om weefsel aan de onderkant van de buis te houden. Als er vocht ophoopt in de collectie buizen tijdens dissectie, voeg 50 ul van koude Trizol reagens om verzamelde weefsel te dekken.
- Met behulp van anti-smudge lab marker, een duidelijk label one-RNase vrij 1,5 ml snap cap buis voor elk type weefsel voor de collectie. Met behulp van 1,5 ml buis rek en vloeibare stikstof, vries dan vermalen weefsel tot fijn poeder (fijne stukjes als in Trizol). Herhaal een keer. Breng totale volume van Trizol tot 1 ml en opnieuw in suspensie gemalen weefsel door vortexen.
- Voeg 200 ul van chloroform en meng goed. Na 5 minuten bij kamertemperatuur, het afsluiten van centrifuge bij 4 ° C en 11.000 g gedurende 15 min. Voorzichtigvoeg waterige laag direct op een genomisch DNA filterkolom. Spin down bij 11.000 x g gedurende 5 min. Voeg gelijk volume RNase-free 70% ethanol doorstroom en meng door pipet. Transfer vloeistof aan een RNA collectie kolom en verder RNA-extractie volgens de instructies verstrekt.
- Kwantificeren en de zuiverheid van totaal RNA te beoordelen op een precisie-spectrofotometer en doorgaan met elke standaard RNA-sequencing methode.
5. Kwantitatieve RT-PCR Validatie RNA Sequencing (figuur 3)
- Selecteer zoveel genen mogelijk relatieve genexpressie niveaus vergelijken over een dynamisch bereik, zowel voorspelde sequentie overvloed en veronderstelde chemosensory genfunctie.
- Ontwerp primerparen voor elk doelwitgen aan een specifieke 100-180 baseparen PCR product amplificeren. Exclusief niet-specifieke gDNA versterking door te zorgen voor ten minste één primer per set overspant een intron grens. U kunt ook gebruik maken van DNase behandeling om genomische besmetting te verminderen.
- Verzameleninsect weefsel zoals beschreven in voorgaande paragraaf. Bereken hoeveel weefsel moet voldoende RNA aan alle qRT-PCR reacties te voltooien.
OPMERKING: Biologische drievoud en technische drievoud reacties zullen maximaal vertrouwen in de resultaten. - Bereken relatieve gen kwantificering X doelgroep - (Ct [doel] -ct [referentie]) voor elk target-gen en het gemiddelde voor elke repliceren, zowel biologische en technische. Gebruik huishoud-gen (en) Ct-waarden normaliseren tussen biologische replicaten en de Y-as schaal wortel in vergelijkingen van relatieve expressieniveaus.
- Beoordeel de gelijkenis van RNA-seq en qRT-PCR datasets met de regressie gebaseerde, bootstrap gelijkwaardigheidsprocedure 9 iteratief toegepast op de gegevens van elk weefsel.
OPMERKING: Deze procedure identificeert de kleinste "regio van overeenkomst" die kunnen worden opgebouwd rond de waargenomen RNA-seq en qRT-PCR data, en laat de relatieve genexpressie zoals gemeten door qRT-PCR geacht statistisch gelijkwaardig aan het meten van relatieve genexpressie door RNA-seq.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het spoor opnames van actiepotentialen van Ae. aegypti smaak sensilla (figuur 1) tonen de doeltreffendheid van directe stimulatie met diverse chemicaliën. Deze techniek kan worden gebruikt om reacties op elk stimuleren chemische gekwantificeerd door het tellen pieken van een gegeven amplitude en duur in een redelijke tijdspanne (over het algemeen minder dan 500 ms). Trace opnames moeten gemakkelijk reproduceerbaar onder een bepaalde set van experimentele omstandigheden zijn. Anders kan de waargenomen fysiologische reacties ongewoon fenotypes tussen individuen van de geteste soort vertegenwoordigen.
Raw RNA-seq data vereist filtratie en nauwkeurige kartering voordat gepresenteerd als afgeronde RPKM (het aantal toegewezen leest per kilobase lengte transcript per miljoen leest mapped) of FPKM (het aantal gelezen fragmenten per kilobasen lang transcript per miljoen leest afgebeeld) getalswaarden (figuur 2). Het onderscheid tussenDeze twee RNA-seq normalisatie werkwijzen beschreven in twee rudimentaire werken 10,11. Een voordeel van totaal mRNA sequentie is de mogelijkheid om de expressie van grote genfamilies simultaan. De visuele weergave van de expressie van vele genen tegelijk zorgt voor een uniek begrip van de moleculaire werkset voor een bepaald weefsel. Vergelijkingen tussen de seksen, ontwikkelingsstadia of soorten weefsel kunnen snel worden gemaakt.
Biologische herhalingen voor RNA-seq datasets kan worden beperkt door de kosten of moeilijkheden voor het weefsel collectie. qRT-PCR biedt de mogelijkheid om kleine subsets van totale genexpressie bevestig tegen lagere kosten en vereist minder bron RNA. Side by side gegevens vergelijkingen (figuur 3A) zorgen voor meer vertrouwen in de RNA-seq resultaten, als de twee methoden rekenen op andere chemische eigenschappen voor gen overvloed schatting. Statistische gelijkwaardigheid functies (figuur 3B) tonen de grenzen van zekerheid deelneemt.
Figuur 1: elektrofysiologische registraties van een middelgrote sensillum op de labellum van Ae. aegypti vrouwtjes, gewijzigd vanaf geciteerde werk 12. Sporen tonen reacties op 100 mM NaCl, 100 mM sucrose, 1 mM kinine, 0,8% DEET, 0,8% picaridin, 0,8% Citronellal en 0,8% IR3535. De drie spikes met verschillende amplitudes of vormen zijn gelabeld a, b of c. Deze drie spikes corresponderen met drie sensorische neuron subtypen met verschillende gevoeligheden: zout, suiker, en bitter, respectievelijk.
Figuur 2:. Tabel smaak receptor genexpressie zoals bepaald met RNA-seq 8 weefselmonsters, gewijzigd vanaf beschreven werk 13 individuele cellen bericht RPKM waardenelke smaak gen annotatie, mannelijke weefsels (links) en vrouwelijke weefsels (rechts). Numerieke waarden worden afgerond op de dichtstbijzijnde tiende. Warmte-kaart kleurintensiteit wordt afgetopt op hoogste RPKM en het middelpunt wordt geschaald voor elk gen familie individueel. Er is slechts één gen familie getoond in dit geval. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3:. Vergelijking van qRT-PCR data en RNA-seq data, gewijzigd vanaf beschreven werk 13 (A) Elk chemoreceptie gen van de horizontale as wordt weergegeven door twee data kolommen. De linker kolom geeft relatieve expressie zoals bepaald met RNA-seq; RPKM waarden van chemoreceptie genen werden gedeeld door die van de huishouding gen Aaeg LAsP om getalsverhoudingen in dit weefsel te genereren. Het rechtkolom geeft relatieve expressie zoals bepaald door qRT-PCR. Eerst biologische repliceren Ct-waarden voor labella genen werden genormaliseerd met Aaeg LAsP als standaard. Tweede, repliceren Ct-waarden voor elk gen werden gebruikt om relatieve expressie waarden te berekenen (E doel - (Ct [doel] -ct [referentie])). De fout balken geven de standaardafwijking van individueel berekende relatieve expressie waarden. (B) RNA-seq en qRT-PCR datasets werden vergeleken in een aparte analyse. De verticale as vertegenwoordigt de relatieve abundantie gen zoals aangetoond door RNA-seq data met een waarde van 1 wordt toegekend aan huishoudgen Aaeg LAsP en alle andere genexpressie worden gerapporteerd ten opzichte van deze waarde. De horizontale as vertegenwoordigt de relatieve abundantie gen zoals voorspeld door qRT-PCR, met een waarde van 1 wordt toegekend aan huishoudgen Aaeg LAsP en alle andere genexpressie worden gerapporteerd ten opzichte van deze waarde. Rode lijnen geven exacte gelijkwaardigheid. Gestippelde lijnen geven de grenzen van de 'regio van overeenkomst' voor helling, berekend door de statistische gelijkwaardigheid algoritme 9. Stevige zwarte lijnen geven de kleinste kwadraten regressie van qRT-PCR gelijkwaardigheid met RNA-seq kwantificering voor de 12 target genen en Aaeg LAsP huishouding gen, elk vertegenwoordigd door cirkel datapunt. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De meest uitdagende aspect van de opname actiepotentialen van smaak sensilla is te beslissen welke reacties zijn "normaal". Bij toepassing van enkele smaak sensillum tip opnemen van de eerste keer voor een bepaalde insectensoorten, het totale aantal en de gevoeligheden van de smaak receptor neuronen (GRNs) zijn waarschijnlijk onbekend. Veel voorlopige opnames worden eerst nodig om het bereik en de concentraties van chemicaliën te testen beslissen. In dit geval, begonnen we met de waarneming dat één GRN reageerde op lage concentraties DEET (figuur 1). Vervolgens onderzochten we antwoorden binnen dezelfde sensillum een reeks concentraties van chemische stoffen die bitter of aversieve andere insecten en neemt een vergelijkbare piek vorm en amplitude (figuur 1). Deze waarnemingen suggereerde dat een enkele GRN subtype reageert op deze aversieve verbindingen. Ter vergelijking, we suikerachtige verbindingen bekend te voeden in mosqu stimuleren getestitoes om te zien of een vergelijkbare piek opgetreden. We hebben een andere, grotere piek in dit geval. Evenzo zagen we een derde intermediaire grootte piek in respons op stimulatie zout, waardoor het totale aantal GRN subtype drie.
Elektrofysiologische opname voorbereidingen bij insecten zijn inherent variabel. Target gustatory sensilla zijn meestal zeer klein en moet worden geplaatst op het juiste hoek om toegang te krijgen met de registratie-elektrode zonder het aanraken van glas om de cuticula. Om een geleidende brug naar smaak neuronen stellen, moet de terminal poriën van de sensillum open voor het bevatten lymfe om direct contact met het elektrolyt registratie-elektrode te bepalen. We hebben blokkade van sensilla openingen hetzij door buitenlandse puin waargenomen of uitgescheiden en gedroogd materiaal uit binnen de doelstelling sensillum. Om deze belemmeringen te vermijden, moet erop worden gelet bij het fokken van en omgaan met insecten om het contact met de doelgroep sensilla voorkomen. Naast Choozingen onbeschadigd, gezonde proefpersonen insecten, biologische factoren zoals leeftijd, het voeden van de staat, de paring staat en zeitgeber tijd moet worden beschouwd bij de vaststelling van controles om de variabiliteit te reduceren in de opnames.
Het kan moeilijk zijn om een responsieve preparaat consistent verkrijgen. Vele proeven kunnen nodig zijn om de signaal-ruisverhouding voldoende individuele pieken te lossen verbeteren. Experimentele variaties op bovengenoemde bereidingen leidt tot betere resultaten. Het is raadzaam om een robuuste respons op uw opname apparaat voor uw test soort, volgens een gemeenschappelijke insect spike-opwekkend, zoals sacharose of kinine te vestigen. Zodra een smaak sensillum reageert, moet deze reacties reproduceerbaar zijn. De minimale lengte van de tijd tussen prikkeling moet experimenteel worden bepaald onderzoeken spike dynamiek onder verschillende temporele beperkingen. Overmatige stimulatie moet worden vermeden om GRN gezondheid te behouden en sensillum lymfe degradatie te voorkomen. Bij that aanspreekgevoeligheid snel af na de eerste stimulering, een groter aantal PREPS worden verkregen vertrouwen dat deze reacties fysiologisch typisch voor de betrokken soort te verschaffen.
De oplosbaarheid van een aantal testchemicaliën kan moeite met het stimuleren van elektroden te creëren, zoals sommige oplosmiddelen GRN werking kan beïnvloeden, zelfs bij lage uiteindelijke concentraties. Deze overwegingen kunnen worden aangepakt door middel van trial and error en met de nodige controles. Elk oplosmiddel gebruikt, worden toegevoegd aan de controle elektrolyt en andere testoplossingen een consistente responsen waarborgen. Immobiliseren van kleine insecten, waardoor directe toegang tot sensilla richten zonder beschadiging van kwetsbare weefsels, kan vallen en opstaan nodig.
De belangrijkste beperking van elektrofysiologie is de ongelukkige scheiding van waargenomen neuronale reacties en potentiële downstream gedragsreacties. Daarom is het voordelig om reacties op chemicaliën die B-testEen aangetoond specifieke gedragsreacties wekken om de significantie van de resultaten bespreken een ecologische context. Tip opnames zorgen voor zeer nauwkeurige detectie van cellulaire activiteit, waardoor deze techniek geschikt voor het beoordelen van transgene dieren en diegenen die fenotypische verschillen in gedrag. Deze opnames bieden ook meer informatie over neuronale responsen, zoals tijdelijke en amplitude dynamiek, dan systemen met een beroep op visuele verslaggevers van neuronale activiteit. In sommige gevallen, kunnen neurale respons gemakkelijker te kwantificeren dan gedragsgegevens 12.
Weefsel collectie voor RNA-seq en qRT-PCR is eenvoudig, maar vergt een voortdurende concentratie en aandacht voor het behoud van celmateriaal door middel van koude opslag en het vermijden van overtollig vocht. RNase activiteit kan RNA kwaliteit beïnvloeden; Daarom weefsel mag alleen contact schone oppervlakken in de collectie en RNA-extractie. Hoewel de probleemoplossing vereist voor qRT-PCR is goed gedocumenteerd, de meest waarschijnlijke valkuilen ontstaan in het begin van het proces bij het ontwerpen van primers en de selectie van target en het huishouden genen. Genen die voorspelbaar vertegenwoordigen gelijkmatige afstand van elkaar op een lijn van relatieve expressieniveau bruikbaar voor het vergelijken van RNA-seq en qRT-PCR datasets (figuur 3). Bijvoorbeeld, het selecteren van genen voor qPCR die RPKM waarden van 0, 10, 20, 30, enz. Respectievelijk, hebben een voorspelbare volgorde abondanties te testen.
RNA-seq was succesvol in het benadrukken van nederige uiten van genen in onze enquête van smaak weefsels (figuur 2). De betrouwbare gen build voor Ae. aegypti (AaegL1.3, http://aaegypti.vectorbase.org/GetData/Downloads/) en voorafgaand chemoreceptie genidentificatie 14 gemaakt scoren genexpressie relatief eenvoudig. Voor deze doeleinden, insecten met beschikbare gen-annotaties en geïdentificeerd gen families van belang zijn waardevol modelsystemen. Bepalen van een nauwkeurige drempelvoor genexpressie versus achtergrondgeluid is speculatief, maar methoden voor het bepalen redelijke afgrenzingsprocedures beschikbaar 15-17. Hier bepalen we een RPKM niveau van volledige vertrouwen en een lager RPKM niveau van verminderde vertrouwen op basis van precedent 9 waarmee we ingelijst onze bespreking van de resultaten.
In de toekomst hopen we andere chemosensory weefsels in zowel de muggen en andere economisch belangrijke insecten ontleden om onze kennis van de genen die bemiddelen insect afstoting te verlengen. We hebben een aantal kandidaat-gustatory genen die het meest waarschijnlijk worden bemiddelen reacties op aversieve verbindingen door het vergelijken van gen-sequenties om soorten met beschikbare functionele gegevens 13 opgericht. We zijn het genereren van transgene lijnen van muggen ontbreekt deze individuele chemosensory genen. We gebruiken tip opnamen om de rol van deze genen beoordeelt het vermogen van het dier bekende insectenwerende detecteren en evalueren gedragsreacties van deze mutanten repellents. In het geval dat deze kandidaatgenen niet significant aantasten repellency, kan hogere resolutie nodig zijn om gen-expressie of aanwezigheid eiwit precies te bepalen in één sensillum of cel. Nederige uitgedrukt receptoren kunnen zijn kritische doelstellingen voor het screenen van nieuwe middelen, samen met de alom uitgedrukt co-receptoren. Helaas, in situ hybridisatie en immuunlokalisatie heeft in insect gustatory weefsel 18 ongelooflijk moeilijk gebleken.
Als we eenmaal vastgesteld welke genen mediëren deze fysiologische reacties en gedrag, kunnen we deze genen in celsystemen die vatbaar is voor hoge doorvoer screening van kandidaat afweermiddelen drukken. In silico benaderingen die structurele modellering 7 gebruiken kan eveneens bruikbaar zijn bij het voorspellen welke soorten verbindingen sterke reacties van specifieke receptoren wekken zijn.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass capillary | A-M Systems | 628000 | Standard, 1.5 mm X 0.86 mm, 4" |
| Silver wire | A-M Systems | 7875 | .015" bare |
| Tungsten wire | Alfa Products | 369 | 0.127 mm diameter |
| Fine forceps | Fine Science Tools | 11252 | #5SF Inox |
| Refridgerated stage | BioQuip Products | 1429 | Chill Table |
| Preamplifier | Syntech | Taste Probe | preamplifier |
| Software for electrophysiology | Syntech | Autospike | software for electrophysiology |
| TetraMin fish food | Tetra | Tropical fish food granules | fish food ground to fine powder |
| TRIzol | Life Technologies | 15596-026 | RNA isolation reagent |
| RNeasy Plus Mini Kit | Qiagen | 74136 | includes gDNA eliminator and RNeasy spin columns |
| Nanodrop spectrophotometer | Nano Drop Products | ND-1000 | tabletop spectrometer |
| R statistics | freeware (created by Robert Gentleman and Ross Ihaka) | www.r-project.org | Use the lm function of the stats package and the equiv.boot function of the equivalence package in the R computing environment. |
| 1.5 ml tube rack | Evergreen | 240-6388-030 | Pour liquid nitrogen into a few empty wells to freeze and grind tissue. |
| 1.5 ml collection tubes with pestle | Grainger | 6HAX6 | RNase free |
| Centrifuge | Thermo Scientific | 11178160 | Spin down frozen tissue to keep at bottom of 1.5 ml tube. |
| Primer-BLAST Primer Designing tool | NCBI | n/a |
References
- Klun, J. A., Khrimian, A., Debboun, M. Repellent and deterrent effects of SS220, picaridin, and DEET suppress human blood feeding by Aedes aegypti, Anopheles stephensi, and Phlebotomus papatasi. J. Med. Entomol. 43 (1), 34-39 (2006).
- Dickens, J. C., Bohbot, J. D. Mini review: Mode of action of mosquito repellents.Pestic. Biochem. Physiol. 106 (3), 149-155 (2013).
- Pitts, R. J., Rinker, D. C., Jones, P. L., Rokas, A., Zwiebel, L. J. Transcriptome profiling of chemosensory appendages in the malaria vector Anopheles gambiae reveals tissue- and sex-specific signatures of odor coding. BMC Genomics. 12 (271), (2011).
- Zhou, X., Slone, J. D., Rokas, A., Berger, S. L., Liebig,, et al. Phylogenetic and transcriptomic analysis of chemosensory receptors in a pair of divergent ant species reveals sex-specific signatures of odor coding. PLOS Genet. 8 (8), e1002930 (2012).
- Shiao, M., Fan, W., Fang, S., Lu, M. J., Kondo, R., Li, W. Transcriptional profiling of adult Drosophila antenna by high-throughput sequencing. Zoological Studies. 52 (42), (2013).
- Bohbot, J., Pitts, R. J., Kwon, H. W., Rützler, M., Robertson, H. M., Zwiebel, L. J. Molecular characterization of the Aedes aegypti odorant receptor gene family. Insect Mol. Biol. 16 (5), 525-537 (2007).
- Kain, P., Boyle, S. M., Tharadra, S. K., Guda, T., Pham, C., et al. Odour receptors and neurons for DEET and new insect repellents. Nature. 502 (7472), 507-512 (2013).
- Hodgson, E. S., Lettvin, J. Y., Roeder, K. D. The physiology of a primary chemoreceptor unit. Science. 122 (3166), 417-418 (1955).
- Robinson, A. P., Duursma, R. A., Marshall, J. D. A regression-based equivalence test for model validation: shifting the burden of proof. Tree Physiol. 25 (7), 903-913 (2005).
- Mortazavi, A., Williams, B. A., McCue, K., Schaeffer, L., Wold, B. Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-seq. Nat. Methods. 5 (7), 621-628 (2008).
- Trapnell, C., Williams, B. A., Pertea, G., Mortazavi, A., Kwan, G., et al. Transcript assembly and quantification by RNA-seq reveals unannotated transcripts and isoform switching during cell differentiation. Nat. Biotechnol. 28 (5), 511-515 (2010).
- Sanford, J. L., Shields, V. D. C., Dickens, J. C. Gustatory receptor neuron responds to DEET and other insect repellents in the yellow-fever mosquito, Aedes aegypti. Naturwiss. 100 (3), 269-273 (2013).
- Sparks, J. T., Vinyard, B. T., Dickens, J. C. Gustatory receptor expression in the labella and tarsi of Aedes aegypti. Insect Biochem. Mol. Biol. 43 (12), 1161-1171 (2013).
- Kent, L. B., Walden, K. K. O., Robertson, H. M. The Gr family of candidate gustatory and olfactory receptors in the yellow-fever mosquito Aedes aegypti. Chem. Senses. 33 (1), 79-93 (2008).
- Ramsköld, D., Wang, E. T., Burge, C. B., Sandberg, R. An abundance of ubiquitously expressed genes revealed by tissue transcriptome sequence data. PLoS Comput. Biol. 5 (12), e1000598 (2009).
- Wagner, G. P., Kin, K., Lynch, V. J. A model based criterion for gene expression calls using RNA-seq data. Theory Biosci. 132 (3), 159-164 (2013).
- Hart, T., Komori, H. K., LaMere, S., Podshivalova, K., Salomon, D. D. Finding active genes in deep RNA-seq gene expression studies. BMC Genomics. 14 (778), (2013).
- Isono, K., Morita, H. Molecular and cellular designs of insect taste receptor system. Front. Cellu. Neurosci. 4 (20), 1-16 (2010).
