Summary
Anvendelse af to metoder til at estimere genekspression i de store smagsmæssige vedhæng af Aedes aegypti, har vi identificeret sæt gener putativt underliggende neuronale reaktioner på bitre og frastødende forbindelser, som bestemt ved elektrofysiologiske undersøgelse.
Introduction
Forbindelser som DEET, Picaridin, Citronellal og IR3535 har vist til effektivt at frastøde myg, herunder vigtig sygdom vektor Aedes aegypti 1,2. Vi registrerer aktionspotentialer fra sensoriske neuroner, der er forbundet med særlig gustatoriske sensilla at bestemme de involverede med myg frastødning celler. Kombineret med nedstrøms sekventering af udtrykte gener i disse væv, kan vi identificere de gener sandsynligvis mediere responser i disse celler for at screene nye forbindelser for forbedrede skyende kapaciteter.
RNA-seq er et kraftfuldt værktøj, hurtigt at blive standard for sporing tidsmæssige og rumlige ændringer i genekspression. RNA-seq analyser af insekt chemosensory lemmer og organer er blevet anvendt til at afdække molekylære receptorer i flere insektarter 3-5, i høj grad forbedre på konventionel PCR-baserede søgninger genet ved gen 6. Insekter repræsenterer de mest forskelligartede dyr klasse, presenterer mange muligheder for at studere sammenhængen mellem gener og unikke fænotyper. RNA-seq teknologi kan anvendes på et hvilket som helst levende insekt væv. På samme måde kan elektrofysiologiske optagelse fra sanseceller inden uniporous gustatory sensilla opnås på mange forskellige insektarter. Parringen af disse to teknikker giver forskerne at indsnævre de opstillede gener involveret i en observeret chemosensory fænotype. Forskellige arter vil indebære særlige udfordringer, men kan oplyse sammenhængen mellem chemosensory receptor gener og en chemosensory tilpasning. Størrelsen og morfologi chemosensory sensilla er variabel og kan kræve omfattende fejlfinding, når du optager aktionspotentialer at reducere støj og identificere gentagne signaler. Dissektioner af chemosensory organer kan være triviel eller delikat og tidskrævende afhængigt af morfologi og størrelse af insekt. Inddrivelse af høj kvalitet RNA kan kræve en vis fejlfinding samt, såsom at undgå visse pigmenter undervæv samling.
Mens demonstrere virkningerne af frastødende forbindelser gennem adfærdsmæssige forsøg er direkte og informativ, denne metode er tidskrævende og bredt med hensyn til virkningsmekanisme. Elektrofysiologi kombineret med RNA-seq giver mulighed for mere specifikke analyser af, hvad der driver undgåelse adfærd i insekter. Når "værktøjskasse" af kemisk forskelsbehandling er blevet identificeret i en insektarter, at mere specifikke forsøg forbedre kendte afskrækningsmidler er mulige. Receptorer og tilhørende proteiner i sanseceller, der er ansvarlige for disse adfærdsmønstre kan udtrykkes heterologt til direkte kemisk screening. Desuden kan molekylær modellering forudsige, hvilke kemikalier vil fremkalde stærke reaktioner fra disse receptorer 7.
Et snapshot af alle aktive gener i en smal sæt chemosensory væv kan også være nyttige til at identificere lignende gener i andre arter. Brug sekvenshomologi og ekspression similarities, kan forskerne danne sæt molekylære receptorer sandsynligvis medierende svar på afskrækningsmidler, der stort set effektive på insekter. Vi præsenterer følgende protokol for at hjælpe forskere med at dekonstruere insekt chemosensory veje og overtale mere at dykke ned i Neuroetologi af ikke-model og økonomisk vigtige insekter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Opdræt Ae. aegypti voksne
- Hatch æg i ca. ¾ tommer vand i lavvandede bakke. Overbelægning vil reducere størrelsen af voksne.
- Rear larver ved 25 ° C (12-hL: 12-HD) og foder med jorden fiskefoder.
BEMÆRK: overfodring kan reducere overlevelsesrater. - Fjern pupper individuelt ved Pasteur-pipette dagligt og overføre til plast retter (9 cm × 5,5 cm) inde små indeslutning spande med fine mesh låg og dermed skaber 24 timers alder grupperinger.
- Feed voksne myg 10% sucrose opløsning ved vat placeres på skærmen vægge af et bur indkapsling myg i en miljømæssig kammer ved 27 ° C og 70% relativ fugtighed under samme fotoperiode som larver.
- For elektrofysiologi, bruge 5-10 dage gamle dyr. Generelt vil større dyr producere bedre resultater. For RNA isolering, anvender dyr, der er inden for en enkelt 24 timers alder gruppering i 5-10 dage gamle rækkevidde.
- Bestem en passende koncentration af elektrolyt (f.eks 1-10 mM), som fremkalder minimal aktivitet fra udvalgte sensoriske neuroner. 10 mM NaCl eller 1 mM KCl er rimelig elektrolytter at teste baseline aktivitet, når der begynder et eksperiment.
- Opløs hver forsøgsgruppe kemikalie i passende opløsningsmiddel (hvis ikke vand, bruge ethanol eller DMSO), der har ringe eller ingen virkning på spike aktivitet, når sammenlignet med elektrolyt alene. Endelige koncentrationer på 10% ethanol eller 1% DMSO er rimelig udgangsmaterialer koncentrationer.
- Vælg passende (f.eks kinin for bitter eller saccharose for søde) kontrol kemikalier, der velbeskrevne fodring afskrækkende eller stimulanser i insekter.
3. Elektrofysiologi (tip optagelse 8; figur 1)
- Form glaselektroder ved mekanisk at trække glaskapillarer. Optimer varme og træk indstillinger til at trække glas til dannelse af passende formet RECORDIng elektroder. Bryde forsigtigt enden af glas elektrode med pincet under et dissektionsmikroskop for at skabe elektrodespids åbning, der er bred nok til at kuvert target sensillum, men lille nok til at undgå kontakt med tilstødende strukturer.
- Under et mikroskop, visuelt identificere ved morfologi og placer målet sensilla / sensillum at sikre repeterbarhed spids optagelse. Prep dyrene, så fri adgang til sensilla fra vinkel elektrode indrejse.
- Kolde bedøve voksne insekter i fryseren ved -20 ° C. Undgå skader på perifere neuroner ved overeksponering for kolde temperaturer. Klip smalle strimler af cellofan tape med barberblad på objektglas. Immobilisere hele insekt på en glasplade ved hjælp smalle strimler.
- Indsæt en kemisk skærpet wolfram ledning i den dorsale thorax eller øje at tjene som ligeglade (jorden) elektrode.
- Fyld glasset elektrode fremstillet i trin 3.1 med en stimulerende opløsning af interesse. Ved hjælp af en indsat sprøjte, fylde hættenIllary fra trak ende til stump ende. Svirp alle luftbobler, holde trukket ende ned. Indsæt en sølvtråd (chloriding valgfrit) i glasset elektrode fremstillet i trin 3.1 til at tjene som optagelse og stimulerende elektrode.
- Tilslut elektroderne til en forforstærker, der er designet til optagelser fra kontakt chemoreceptive sensilla i insekter. Denne forforstærker (300 Hz-3 kHz båndpasfilter) vil reducere indsvingningstid at fange neuronal aktivitet så tæt på stimulus introduktion som muligt. Indsamle, lagre og analysere elektriske signaler ved hjælp af en mikrocomputer udstyret med spike optagelse software.
BEMÆRK: Jordforbindelse setup optagelse korrekt kan drastisk forbedre signal-støj-forhold. - Stimulere sensilla med en kontrol-opløsning (kun elektrolyt) for at sikre funktionaliteten. Tæl pigge starter 200 ms efter stimulus artefakt for alle præparater.
- Tilfældig rækkefølgen af testkemikalier for alle eksperimenter, bortset fra dosis-respons-undersøgelser,at eliminere bias. For dosis-respons studier udsætte sensilla til stigende koncentrationer af den eksperimentelle kemikalie. Tillad mindst 3 min mellem stimulationer for at sikre tilstrækkelig genopretning.
BEMÆRK: Dette krav kan variere insekt og sensilla. Threshold er defineret som den koncentration, for hvilken standard fejl ikke overlapper med standardafvigelsen for den laveste koncentration.
4. RNA Isolation og sekventering (figur 2)
- Forbered tætsluttende RNAse-fri pestles ved afkøling dem på tøris før væv disruption.Prepare ledsager RNase-fri pestles der passer snap cap rør stramt. Hold indsamling rør lukket medmindre aktivt dissekere at undgå overskydende kondens.
- Brug filtreret emhætte, placere 30 til 40 kolde-bedøvet myg (15 sek i -20 ° C fryser) på kold scene og sortere efter køn. Placer dyr dorsal nedad, gribe vinger til ikke skade smag vedhæng.
- Brug to par fine tænger, dissekere parret Labella eller tarsi fra mænd eller kvinder under et dissektionsmikroskop og begrænse inddragelse af tilstødende væv.
BEMÆRK: 500 parret Labella giver ca. 800-1.000 nanogram af total mRNA. 400 individuelle tarsi (5 segmenter hver) Udbytte 1,200-1,800 ng af total mRNA. - Med et par af gispende-pincet, let forstå myg snabel lige proksimalt til Labella udsætter indre stiletter. Brug af andet par indsamling-pincet, fjern Labella og tilføje væv til side af kulde samling rør.
- Med et par tænger, let forstå myg ben ved krydset af skinneben og først tarsal segment. Brug af andet par pincet, fjern tarsi og tilføje væv til side af kulde samling rør.
BEMÆRK: Tag hensyn til de celletyper ved grænsefladen mellem ønsket og uønsket væv. Selv om det er vigtigt at begrænse optagelsen af nabolandet væv, er det lige så vigtigt at ikke udelade dele af det ønskede væv. Den final prøve skal præcist repræsentere hele organet af interesse. Opret en præcis afgrænsning med gribetænger sådan, at indsamling pincet præcist kan frigøre ved skrabning eller snuppe kun det ønskede væv. - Med jævne mellemrum spin ned opsamlingsrør kortvarigt i 0 ° C centrifuge ved 9.000 xg til at holde væv i bunden af røret. Hvis fugt akkumuleres i opsamlingsrør under dissektion, tilsættes 50 pi kold Trizol-reagens til at dække indsamlede væv.
- Brug af anti-plamage lab markør, klart mærke en RNase-fri 1,5 ml snap cap rør for hver vævstype til afhentning. Brug 1,5 ml rør rack og flydende nitrogen, frys derefter male væv ind fint pulver (fine stykker hvis i Trizol). Gentag en gang. Bring samlede volumen af Trizol til 1 ml og resuspender jorden væv ved hvirvelbehandling.
- Tilføj 200 ul chloroform og blandes. Efter 5 minutter ved stuetemperatur, spin ned i centrifuge ved 4 ° C og 11.000 x g i 15 min. Omhyggeligttilføje vandige lag direkte til et genomisk DNA filter kolonne. Spin ned ved 11000 x g i 5 minutter. Tilføj lige volumen af RNase-fri 70% ethanol til gennemstrømning og blandes med pipette. Overførsel væske til en RNA samling søjle og fortsætte RNA ekstraktion pr instruktionerne.
- Kvantificere og vurdere renheden af total RNA på en præcision spektrofotometer og fortsætte med enhver standard RNA sekventering metode.
5. Kvantitativ RT-PCR Validering af RNA sekventering (figur 3)
- Vælg så mange gener som muligt at sammenligne de relative genekspressionsniveauer over et dynamikområde, både i forudsagt sekvens overflod og formodede chemosensory genfunktion.
- Design primerpar for hver målgen at amplificere en specifik 100-180 basepar PCR-produkt. Udelukke ikke-specifik gDNA amplifikation ved at sikre mindst én primer pr sæt spænder en intron grænse. Alternativt kan du bruge DNase behandling for at reducere genomisk forurening.
- Samlinsekt væv som beskrevet i forrige afsnit. Beregn hvor meget væv er forpligtet til at give nok RNA at afslutte alle qRT-PCR-reaktioner.
BEMÆRK: Biologisk tre eksemplarer og tekniske tredobbelte reaktioner vil give maksimal tillid til resultaterne. - Beregn relativ gen kvantitativ X mål - (Ct [mål] -Ct [reference]) for hvert mål gen og gennemsnit for hver kopiere, både biologisk og teknisk. Brug housekeeping-genet (s) at normalisere Ct-værdier mellem biologiske gentagelser og at udrydde Y-aksen målestok sammenligninger af relative ekspression.
- Vurderingen af ligheden mellem RNA-seq og qRT-PCR datasæt ved hjælp af regression-baseret, bootstrap ækvivalens procedure 9, iterativt anvendes, med data fra hvert væv.
BEMÆRK: Denne procedure identificerer mindste "region af lighed", der kan være konstrueret omkring den observerede RNA-seq og QRT-PCR data, og tillade den relative genekspression målt ved qRT-PCR skal betragtes statistisk svarende til måling af relativ genekspression ved RNA-seq.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De spor optagelser af aktionspotentialer fra Ae. aegypti gustatory sensilla (figur 1) demonstrere effektiviteten af direkte stimulering med en række kemikalier. Denne teknik kan anvendes til at kvantificere responser til de stimulerende kemisk ved at tælle pigge af en given amplitude og varighed over et rimeligt tidsrum (generelt mindre end 500 ms). Trace optagelser skal være let at reproducere under et bestemt sæt af eksperimentelle betingelser. Ellers kan de observerede fysiologiske reaktioner repræsentere ualmindelige fænotyper blandt individer i den undersøgte art.
Rå RNA-seq data kræver filtrering og præcis kortlægning, inden de præsenteres som afrundet RPKM (antallet af kortlagt læser pr kilobase længde udskrift per million læser kortlagt) eller FPKM (antallet af læste fragmenter pr kilobase længde udskrift per million læser kortlagt) numeriske værdier (Figur 2). Sondringen mellemdisse to RNA-seq normaliserings- metoder er blevet beskrevet i to skelsættende værker 10,11. En fordel ved den samlede mRNA sekventering er evnen til at detektere ekspressionen af store genfamilier samtidigt. Den visuelle præsentation af ekspressionen af mange gener på en gang giver mulighed for en entydig forståelse af den molekylære værktøjssæt til en givet væv. Sammenligninger mellem kønnene, udviklingsstadier eller vævstyper kan gøres hurtigt.
Biologiske gentagelser for RNA-seq datasæt kan være begrænset af omkostningerne eller vanskelighederne ved væv samling. QRT-PCR giver mulighed for at validere små undergrupper af total genekspression med færre omkostninger og kræver mindre kilde RNA. Side om side sammenligningen (figur 3A) give mulighed for større tillid til RNA-seq resultater, som de to metoder er afhængige af forskellige kemier for gen overflod estimering. Statistiske ækvivalensforhold funktioner (figur 3B) viser grænserne for sikkerhed i hvert tilfælde.
Figur 1: Elektrofysiologiske optagelser fra en mellemstor sensillum på labellum af Ae. aegypti hundyr, modificeret fra citerede arbejde 12. Traces viser respons på 100 mM NaCI, 100 mM sucrose, 1 mM kinin, 0,8% DEET, 0,8% Picaridin, 0,8% Citronellal og 0,8% IR3535. De tre spikes med forskellige amplituder og figurer er mærket A, B eller C. Disse tre spikes svarer til tre sensoriske neuron undertyper med forskellige følsomheder: salt, sukker og bitter hhv.
Figur 2:. Tabel over gustatory receptor genekspression som bestemt ved RNA-seq til 8 vævsprøver, modificeret fra citeret arbejde 13 individuelle celler rapporterer RPKM værdier forhver gustatory gen annotation, mandlige væv (til venstre) og kvindelige væv (til højre). Numeriske værdier er afrundet til nærmeste tiendedel. Heat-map farveintensiteten er begrænset til højest RPKM og midtpunktet er skaleret for hvert gen familie individuelt. Der er kun ét gen familie vist i denne sag. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 3:. Sammenligning af QRT-PCR data og RNA-seq data, modificerede fra citerede arbejde 13 (A) Hvert chemoreception gen af den horisontale akse er repræsenteret af data to kolonner. Den venstre kolonne repræsenterer relative ekspression som bestemt ved RNA-seq; RPKM værdier af chemoreception gener blev divideret med den for husholdning gen Aaeg LAsP at generere numeriske proportioner i dette væv. Den rigtigekolonne repræsenterer relative ekspression som bestemt ved QRT-PCR. Først blev biologisk replikat Ct-værdier for Labella gener normaliseret hjælp Aaeg LAsP som standard. For det andet, replikere Ct-værdier for hvert gen blev anvendt til at beregne relative ekspressionsniveauer værdier (E target - (Ct [target] -Ct [reference])). Fejlsøjlerne angiver standardafvigelsen af individuelt beregnede relative ekspression værdier. (B) RNA-seq og qRT-PCR datasæt blev sammenlignet i en særskilt analyse. De lodrette akser repræsenterer relative gen overflod som påvist ved RNA-seq data, med en værdi på 1, anvendes til husholdning gen Aaeg LAsP og alle andre genekspression rapporteres i forhold til denne værdi. De vandrette akser repræsenterer relative gen overflod som forudsagt af QRT-PCR, med en værdi på 1, anvendes til husholdning gen Aaeg LAsP og alle andre genekspression rapporteres i forhold til denne værdi. Røde linjer repræsenterer nøjagtig ækvivalens. Stiplede linjer repræsenterer grænserne for det "region af lighed« for hældning, beregnet af den statistiske ækvivalens algoritme 9. Solid sorte linje viser den mindste kvadraters regression af QRT-PCR ækvivalens til RNA-seq kvantificering for de 12 målgener og Aaeg LAsP husholdning gen, hver repræsenteret ved cirkel datapunkt. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det mest udfordrende aspekt af optagelse aktionspotentialer fra gustatory sensilla er at beslutte hvilke svar er "normal". Når ansætte enkelt gustatory sensillum tip optagelse første gang for en given insektarter, det samlede antal og følsomhed smagssansen receptor neuroner (GRNs) er sandsynligvis ukendt. Mange indledende optagelser først skal tage stilling området og koncentrationer af kemikalier for at teste. I dette tilfælde, vi begyndte med observationen af, at en enkelt GRN reageret for lave koncentrationer af DEET (figur 1). Efterfølgende undersøgte vi svar inden for samme sensillum til en række koncentrationer af kemikalier kendt for at være bitter eller generende for andre insekter og observeret en lignende spike form og amplitude (figur 1). Disse observationer tydede på, at en enkelt GRN subtype reagerer på disse afskrækningsmidler forbindelser. Til sammenligning, vi testede sukkerholdige stoffer, der vides at stimulere fodring i MOSQUitoes at se, om en lignende spike indtraf. Vi observerede en anden, større spike i dette tilfælde. Ligeledes observerede vi en tredje, mellemliggende størrelse stigning i respons på salt stimulation, hvilket bringer det samlede GRN subtype tæller til tre.
Elektrofysiologiske optagelse præparater i insekter i sagens natur er variabel. Target gustatory sensilla er typisk meget små og skal placeres på et passende vinkel for at få adgang til optagelsen elektroden uden at røre glasset til neglebånd. At etablere en ledende bro til gustatoriske neuroner, skal terminalen pore af sensillum være åbent for indeholdte lymfe til at etablere direkte kontakt med indspilning elektrodens elektrolyt. Vi har observeret blokering af sensilla åbninger enten ved fremmedlegemer eller udskilt og tørret materiale fra inden for målet sensillum. For at undgå disse hindringer, skal der udvises forsigtighed ved opdræt og håndtering insekter at undgå kontakt med målet sensilla. Ud over Choosynge ubeskadigede, sunde test insekter, biologiske faktorer som alder, fodring tilstand, parring stat og zeitgeber tid bør overvejes, når oprettelse kontrol for at reducere variation i optagelser.
Det kan være vanskeligt at opnå en responsiv præparat konsekvent. Mange forsøg kan være nødvendige for at forbedre signal-til-støj-forholdet nok til at løse individuelle pigge. Eksperimentelle variationer over de nævnte præparater kan føre til bedre resultater. Det er tilrådeligt at etablere et robust svar på din optagelse apparat til din test art efter en fælles insekt spike elicitor, ligesom saccharose eller kinin. Når en gustatoriske sensillum reagerer, bør disse reaktioner være reproducerbare. Den mindste tidsrummet mellem stimulering bør bestemmes eksperimentelt undersøge spike dynamik under forskellige tidsmæssige begrænsninger. Overdreven stimulering bør undgås for at bevare GRN sundhed og forebygge sensillum lymfeknuder nedbrydning. I tilfælde THAt svar følsomhed falder hurtigt efter første stimulation, et større antal preps skal indhentes for at give tillid til, at disse reaktioner er fysiologisk typisk for de pågældende dyrearter.
Opløseligheden af nogle test kemikalier kan skabe vanskeligheder gør stimulerende elektroder, som nogle opløsningsmidler kan påvirke GRN aktivitet, selv ved lave slutkoncentrationer. Disse overvejelser kan løses gennem trial and error og med passende kontroller. Enhver opløsningsmiddel, der anvendes, bør føjes til kontrol elektrolyt og andre test løsninger for at sikre sammenhæng i svarene. Immobilisere små insekter, hvilket giver direkte adgang til at målrette sensilla uden at beskadige skrøbelige væv, kan kræve trial and error.
Den største begrænsning af elektrofysiologi er den uheldige adskillelse af observerede neuronale reaktioner og potentielle downstream adfærdsmæssige reaktioner. Derfor er det fordelagtigt at afprøve reaktioner på kemikalier, som har de bEen vist at fremkalde specifikke adfærdsmæssige reaktioner for at drøfte betydningen af resultaterne i en økologisk sammenhæng. Tip optagelser mulighed for meget nøjagtig påvisning af cellulær aktivitet, hvilket gør denne teknik ideel til vurdering transgene dyr eller patienter, der udviser fænotypiske forskelle i adfærd. Disse optagelser tilbyder også mere information om neuronale reaktioner, såsom tidsmæssige og amplitude dynamik, end systemer, der visuelle reportere af neuronal aktivitet. I nogle tilfælde kan neurale reaktioner kvantificeres lettere end adfærdsmæssige data 12.
Tissue indsamling til RNA-seq og QRT-PCR er ligetil, men kræver løbende koncentration og opmærksomhed på at bevare cellemateriale gennem kold opbevaring og undgåelse af overskydende fugt. RNase-aktivitet kan påvirke RNA-kvalitet; derfor væv må kun kontakte rene overflader overalt indsamling og RNA-ekstraktion. Selvom fejlfinding kræves for QRT-PCR is veldokumenteret, de mest sandsynlige faldgruber forekomme tidligt i processen, når designe primere og vælge mål- og housekeeping-gener. Gener, der forudsigeligt repræsenterer jævnt fordelte punkter langs en relativ ekspressionsniveau er anvendelige til sammenligning af RNA-seq og QRT-PCR datasæt (Figur 3). For eksempel vælge gener for qPCR der viser RPKM værdier på 0, 10, 20, 30, etc., henholdsvis tilbyder en forudsigelig rækkefølge overflod skal testes.
RNA-seq lykkedes at fremhæve ydmyge udtrykke gener i vores undersøgelse af smagsmæssige væv (figur 2). Den pålidelige gen build for Ae. aegypti (AaegL1.3, http://aaegypti.vectorbase.org/GetData/Downloads/) og før chemoreception genidentifikation 14 fremstillet lave genekspression relativt let. Til disse formål, insekter med tilgængelige gen annotationer og identificerede genfamilier af interesse er værdifulde modelsystemer. Bestemmelse en nøjagtig tærskelfor genekspression vs. baggrundsstøj er spekulativ, men metoder til bestemmelse rimelige cutoffs er tilgængelige 15-17. Her bestemmes vi en RPKM niveau af fuld tillid og et lavere RPKM niveau af nedsat selvtillid baseret på præcedens 9, som vi indrammet vores diskussion af resultater.
I fremtiden håber vi at dissekere andre chemosensory væv i både myg og andre økonomisk vigtige insekter at udvide vores viden om de gener, der medierer insekt frastødning. Vi har etableret flere kandidat gustatoriske gener, der mest sandsynligt medierende svar på afskrækningsmidler forbindelser ved at sammenligne gensekvenser arter med tilgængelige funktionelle data 13. Vi genererer transgene linjer af myg mangler disse individuelle chemosensory gener. Vi vil bruge tip optagelser til at vurdere den rolle, som disse gener på dyrets evne til at detektere kendte afskrækningsmidler og vurdere adfærdsmæssige reaktioner på disse mutanter til repEllents. I det tilfælde, at disse kandidatgener ikke i væsentlig grad påvirker frastødning, kan det være nødvendigt mere beslutning til mere præcist bestemme genekspression eller protein tilstedeværelse i en enkelt sensillum eller celle. Ydmyge udtrykt receptorer kan være kritiske mål for screening af nye insektmidler, sammen med allestedsnærværende udtrykt coreceptorer. Desværre in situ hybridisering og immunlokalisering har vist utroligt svært i insekt gustatory væv 18.
Når vi har etableret, hvilke gener medierer disse fysiologiske reaktioner og adfærd, kan vi udtrykke disse gener i celle systemer, der er modtagelige for high-throughput screening af kandidat afskrækningsmidler. In silico metoder, der anvender strukturel modellering maj 7 også være nyttig til at forudsige, hvilke typer forbindelser vil fremkalde stærke reaktioner fra specifikke receptorer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass capillary | A-M Systems | 628000 | Standard, 1.5 mm X 0.86 mm, 4" |
| Silver wire | A-M Systems | 7875 | .015" bare |
| Tungsten wire | Alfa Products | 369 | 0.127 mm diameter |
| Fine forceps | Fine Science Tools | 11252 | #5SF Inox |
| Refridgerated stage | BioQuip Products | 1429 | Chill Table |
| Preamplifier | Syntech | Taste Probe | preamplifier |
| Software for electrophysiology | Syntech | Autospike | software for electrophysiology |
| TetraMin fish food | Tetra | Tropical fish food granules | fish food ground to fine powder |
| TRIzol | Life Technologies | 15596-026 | RNA isolation reagent |
| RNeasy Plus Mini Kit | Qiagen | 74136 | includes gDNA eliminator and RNeasy spin columns |
| Nanodrop spectrophotometer | Nano Drop Products | ND-1000 | tabletop spectrometer |
| R statistics | freeware (created by Robert Gentleman and Ross Ihaka) | www.r-project.org | Use the lm function of the stats package and the equiv.boot function of the equivalence package in the R computing environment. |
| 1.5 ml tube rack | Evergreen | 240-6388-030 | Pour liquid nitrogen into a few empty wells to freeze and grind tissue. |
| 1.5 ml collection tubes with pestle | Grainger | 6HAX6 | RNase free |
| Centrifuge | Thermo Scientific | 11178160 | Spin down frozen tissue to keep at bottom of 1.5 ml tube. |
| Primer-BLAST Primer Designing tool | NCBI | n/a |
References
- Klun, J. A., Khrimian, A., Debboun, M. Repellent and deterrent effects of SS220, picaridin, and DEET suppress human blood feeding by Aedes aegypti, Anopheles stephensi, and Phlebotomus papatasi. J. Med. Entomol. 43 (1), 34-39 (2006).
- Dickens, J. C., Bohbot, J. D. Mini review: Mode of action of mosquito repellents.Pestic. Biochem. Physiol. 106 (3), 149-155 (2013).
- Pitts, R. J., Rinker, D. C., Jones, P. L., Rokas, A., Zwiebel, L. J. Transcriptome profiling of chemosensory appendages in the malaria vector Anopheles gambiae reveals tissue- and sex-specific signatures of odor coding. BMC Genomics. 12 (271), (2011).
- Zhou, X., Slone, J. D., Rokas, A., Berger, S. L., Liebig,, et al. Phylogenetic and transcriptomic analysis of chemosensory receptors in a pair of divergent ant species reveals sex-specific signatures of odor coding. PLOS Genet. 8 (8), e1002930 (2012).
- Shiao, M., Fan, W., Fang, S., Lu, M. J., Kondo, R., Li, W. Transcriptional profiling of adult Drosophila antenna by high-throughput sequencing. Zoological Studies. 52 (42), (2013).
- Bohbot, J., Pitts, R. J., Kwon, H. W., Rützler, M., Robertson, H. M., Zwiebel, L. J. Molecular characterization of the Aedes aegypti odorant receptor gene family. Insect Mol. Biol. 16 (5), 525-537 (2007).
- Kain, P., Boyle, S. M., Tharadra, S. K., Guda, T., Pham, C., et al. Odour receptors and neurons for DEET and new insect repellents. Nature. 502 (7472), 507-512 (2013).
- Hodgson, E. S., Lettvin, J. Y., Roeder, K. D. The physiology of a primary chemoreceptor unit. Science. 122 (3166), 417-418 (1955).
- Robinson, A. P., Duursma, R. A., Marshall, J. D. A regression-based equivalence test for model validation: shifting the burden of proof. Tree Physiol. 25 (7), 903-913 (2005).
- Mortazavi, A., Williams, B. A., McCue, K., Schaeffer, L., Wold, B. Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-seq. Nat. Methods. 5 (7), 621-628 (2008).
- Trapnell, C., Williams, B. A., Pertea, G., Mortazavi, A., Kwan, G., et al. Transcript assembly and quantification by RNA-seq reveals unannotated transcripts and isoform switching during cell differentiation. Nat. Biotechnol. 28 (5), 511-515 (2010).
- Sanford, J. L., Shields, V. D. C., Dickens, J. C. Gustatory receptor neuron responds to DEET and other insect repellents in the yellow-fever mosquito, Aedes aegypti. Naturwiss. 100 (3), 269-273 (2013).
- Sparks, J. T., Vinyard, B. T., Dickens, J. C. Gustatory receptor expression in the labella and tarsi of Aedes aegypti. Insect Biochem. Mol. Biol. 43 (12), 1161-1171 (2013).
- Kent, L. B., Walden, K. K. O., Robertson, H. M. The Gr family of candidate gustatory and olfactory receptors in the yellow-fever mosquito Aedes aegypti. Chem. Senses. 33 (1), 79-93 (2008).
- Ramsköld, D., Wang, E. T., Burge, C. B., Sandberg, R. An abundance of ubiquitously expressed genes revealed by tissue transcriptome sequence data. PLoS Comput. Biol. 5 (12), e1000598 (2009).
- Wagner, G. P., Kin, K., Lynch, V. J. A model based criterion for gene expression calls using RNA-seq data. Theory Biosci. 132 (3), 159-164 (2013).
- Hart, T., Komori, H. K., LaMere, S., Podshivalova, K., Salomon, D. D. Finding active genes in deep RNA-seq gene expression studies. BMC Genomics. 14 (778), (2013).
- Isono, K., Morita, H. Molecular and cellular designs of insect taste receptor system. Front. Cellu. Neurosci. 4 (20), 1-16 (2010).
