Summary
L'utilisation de deux méthodes pour estimer l'expression des gènes dans les grands appendices gustatives de Aedes aegypti, nous avons identifié l'ensemble des gènes sous-jacents supposément les réponses neuronales à des composés amers et de répulsion, comme déterminé par l'examen électrophysiologique.
Introduction
Il a été démontré composés comme DEET, Picaridin, Citronellal et IR3535 pour repousser efficacement les moustiques, y compris les vecteurs de maladies importantes Aedes aegypti 1,2. Nous enregistrons des potentiels d'action des neurones sensoriels associés à gustative sensilles spécifique pour déterminer les cellules impliquées avec moustiquaire répulsion. Couplé avec le séquençage aval des gènes exprimés dans ces tissus, nous pouvons identifier les gènes les plus susceptibles médiation des réponses de ces cellules afin de dépister de nouveaux composés pour l'amélioration des capacités de répulsion.
ARN-Seq est un outil puissant, devient rapidement la norme pour le suivi des changements temporels et spatiaux de l'expression génique. Analyse de l'ARN-seq appendices chimiosensoriels insectes et les organes ont été utilisées pour découvrir des récepteurs moléculaires dans plusieurs espèces d'insectes 5.3, ce qui améliore grandement le gène par PCR conventionnelle basée recherches par le gène 6. Les insectes représentent la classe des animaux les plus divers, présentant de nombreuses occasions d'étudier le lien entre les gènes et les phénotypes uniques. la technologie de l'ARN-seq peut être utilisé sur ne importe quel tissu insecte vivant. De même, l'enregistrement électrophysiologique à l'intérieur de cellules sensorielles sensilla uniporous gustative peut être réalisée dans de nombreuses espèces d'insectes. Le couplage de ces deux techniques permet aux chercheurs de réduire l'ensemble des gènes impliqués dans le phénotype observé chimiosensorielle. Différentes espèces présenter des défis spécifiques, mais peuvent informer la connexion entre les gènes des récepteurs chimiosensoriels et une adaptation chimiosensorielle. La taille et la morphologie des chimiosensorielle sensilles est variable et peut exiger énormément de dépannage lors de l'enregistrement des potentiels d'action pour réduire le bruit et d'identifier les signaux reproductibles. Les dissections des organes chimiosensoriels peuvent être trivial ou délicate et longue, en fonction de la morphologie et la taille de l'insecte. Récupération de l'ARN de haute qualité peut exiger un peu de dépannage ainsi, comme éviter certains pigments courscollecte de tissu.
Tout en montrant les effets de composés répulsifs par des essais de comportement est directe et informative, cette approche exige beaucoup de temps et de large par rapport au mécanisme d'action. Électrophysiologie couplé avec l'ARN-seq permet des analyses plus spécifiques de ce qui motive les comportements d'évitement chez les insectes. Une fois que la "boîte à outils" de la discrimination chimique a été identifiée dans une espèce d'insecte, des tentatives plus spécifiques visant à améliorer le répulsifs connus sont possibles. Récepteurs et des protéines associées dans les cellules sensorielles responsables de ces comportements peuvent être exprimées de manière hétérologue pour le dépistage chimique directe. En outre, la modélisation moléculaire peut prédire quels produits chimiques seront obtenir de fortes réponses de ces récepteurs 7.
L'instantané de tous les gènes actifs dans un ensemble restreint de tissus chimiosensoriels peut également être utile dans l'identification des gènes similaires dans d'autres espèces. Utilisation homologie de séquence et d'expression similarities, les chercheurs peuvent former des ensembles de récepteurs moléculaires les plus susceptibles de médiation réponses aux répulsifs qui sont largement efficaces sur les insectes. Nous présentons le protocole suivant pour aider les chercheurs à déconstruire voies chimiosensoriels insectes et de convaincre plus de se plonger dans l'neuroéthologie de non-modèle et les insectes économiquement importants.
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Protocol
1. Elevage Ae. aegypti adultes
- Les œufs éclosent en environ ¾ pouce d'eau dans le bac peu profond. La surpopulation va réduire la taille des adultes.
- Larves arrière à 25 ° C (12 hl: 12-HD) et nourrir avec de la nourriture du poisson de fond.
NOTE: La suralimentation peut réduire les taux de survie. - Retirer pupes individuellement par pipette Pasteur quotidienne et transfert à des plats en plastique (9 cm x 5,5 cm) à l'intérieur de petits seaux de confinement avec de fines couvercles de maille, établissant ainsi 24 groupes d'âge h.
- moustiques adultes Feed solution à 10% de saccharose par le coton balle placée sur les murs d'écran d'un boîtier de la cage les moustiques dans une chambre de l'environnement à 27 ° C et 70% d'humidité relative dans les mêmes photopériode sous forme de larves.
- Pour électrophysiologie, utiliser 5-10 jours vieux animaux. En général, les grands animaux produisent de meilleurs résultats. Pour l'isolement de l'ARN, utiliser des animaux qui se trouvent dans un seul 24 hr âge regroupement dans l'ancienne gamme de 5-10 jours.
- Déterminer une concentration appropriée de l'électrolyte (par exemple 1-10 mM) qui provoque une activité minimale de neurones sensoriels sélectionnés. 10 mM de NaCl ou 1 mM KCl sont des électrolytes raisonnables pour tester l'activité de base lorsque l'on commence une expérience.
- Dissoudre chaque produit chimique expérimentale dans un solvant approprié (si ce ne est l'eau, utiliser de l'éthanol ou le DMSO) qui a peu ou pas d'effet sur l'activité de pointe par rapport à l'électrolyte seul. Les concentrations finales de 10% d'éthanol ou 1% de DMSO sont les concentrations de départ raisonnables.
- Sélectionnez approprié (par exemple la quinine en amertume ou le saccharose pour Sweet) de contrôle des produits chimiques qui sont bien décrits dissuasion d'alimentation ou de stimulants chez les insectes.
3. électrophysiologie (enregistrement de la pointe 8; Figure 1)
- électrodes de verre de forme en tirant mécaniquement capillaires en verre. Optimiser la chaleur et tirez réglages pour tirer verre pour former recordi forme appropriéeélectrodes Ng. Rompre avec précaution extrémité de l'électrode de verre en utilisant une pince sous un microscope de dissection pour créer pointe de l'électrode ouverture qui est assez large pour envelopper cible sensille, mais assez petit pour éviter tout contact avec les structures voisines.
- Sous un microscope, identifier visuellement par la morphologie et la position de la cible sensilles / sensille pour assurer la répétabilité de l'enregistrement de la pointe. Prep animaux afin de permettre le libre accès aux sensilles partir de l'angle d'entrée de l'électrode.
- Froids insectes Anesthetize adultes dans le congélateur à -20 ° C. Eviter les dommages aux neurones périphériques par une surexposition à des températures froides. Découper des bandes étroites de ruban adhésif avec une lame de rasoir sur lame de verre. Immobiliser insectes tout sur une lame de verre en utilisant des bandes étroites.
- Insérez un fil de tungstène chimiquement affilée dans le thorax dorsal ou les yeux pour servir les indifférents (sol) électrode.
- Remplissez électrode de verre faite à l'étape 3.1 avec une solution stimulant d'intérêt. Utilisation d'une seringue insérée, le bouchon de remplissageIllary de bout tiré Blunt fin. Flick toutes les bulles d'air, tenant fin tiré vers le bas. Insérez un fil d'argent (chlorurant en option) dans l'électrode de verre faite à l'étape 3.1 pour servir enregistrement et électrode de stimulation.
- Connecter les électrodes à un préamplificateur qui est conçu pour des enregistrements de contacts chimioréceptifs sensilla chez les insectes. Ce préamplificateur (300 Hz-3 kHz filtre passe-bande) permettra de réduire le temps de stabilisation de l'activité neuronale capturer aussi près que possible l'introduction du stimulus. Collecter, stocker et analyser les signaux électriques en utilisant un micro-ordinateur équipé d'un logiciel d'enregistrement de pointe.
REMARQUE: la terre la configuration d'enregistrement correctement peut considérablement améliorer le rapport signal-sur-bruit. - Stimuler sensilles avec une solution de contrôle (électrolyte seulement) pour assurer la fonctionnalité. Comptez pointes à partir de 200 msec suivants l'artefact de stimulation pour toutes les préparations.
- Aléatoire l'ordre de produits chimiques d'essai pour toutes les expériences, à l'exception des études dose-réponse,pour éliminer les préjugés. Pour les études dose-réponse, exposer sensilles à des concentrations de la substance chimique expérimentale croissante. Laisser un minimum de 3 minutes entre les stimulations pour assurer une récupération adéquate.
NOTE: Cette exigence peut varier en fonction des insectes et sensilles. Seuil est défini comme étant la concentration pour laquelle l'erreur standard ne chevauche pas l'erreur-type pour la plus faible concentration testée.
4. Isolement et séquençage de l'ARN (figure 2)
- Préparer les pilons libre de RNAse-étanches en les refroidissant sur de la glace sèche avant tissus disruption.Prepare accompagnant pilons RNase-free qui correspondent à des tubes à bouchon de pression hermétiquement. Garder les tubes de collecte fermés à moins dissection activement pour éviter l'excès de condensation.
- Utilisation de l'aspirateur filtrée, placez 30-40 moustiques froides anesthésiés (15 sec à -20 ° C congélateur) sur scène froide et trier par sexe. La place animaux dorsale vers le bas, saisir ailes pour ne pas endommager les appendices gustatives.
- L'utilisation de deux paires de pinces fines, disséquer labella apparié ou tarses des mâles ou des femelles sous un microscope de dissection et de limiter l'inclusion des tissus adjacents.
REMARQUE: 500 labella jumelé donne environ 800-1000 nanogrammes d'ARNm total. 400 tarses individuelle (5 segments chacun) donnent 1,200-1,800 nanogrammes d'ARNm total. - Avec une paire de halètement-pince, saisir la légère trompe moustiques juste en amont de labella exposer stylets internes. Utiliser autre paire de collecte-pince, retirer et ajouter labella tissu à côté du tube de collecte froid.
- Avec une paire de pinces, saisir légèrement la jambe de moustiques à la jonction du tibia et du premier segment du tarse. Utilisation d'un autre paire de pinces, retirez tarses et ajouter tissu à côté du tube de collecte froid.
NOTE: Prendre en compte les types de cellules à l'interface de tissu voulu et non désirées. Se il est important de limiter l'insertion du tissu voisin, il est tout aussi important de ne pas omettre des parties de tissu souhaitée. La fiéchantillon final doit représenter avec précision l'organe entier d'intérêt. Créer une limite précise avec la pince de préhension tels que le forceps de collecte peuvent précisément libérer en grattant ou en saisissant seulement le tissu désiré. - Périodiquement, spin down tube de collecte brièvement 0 ° C centrifuger à 9000 xg pour maintenir le tissu au fond du tube. Si l'humidité se accumule dans des tubes de collecte lors de la dissection, ajouter 50 pi de réactif Trizol froide pour couvrir des tissus prélevés.
- En utilisant le marqueur de laboratoire anti-maculage, étiqueter clairement une RNase-free 1,5 ml enclenchent tube à bouchon pour chaque type de tissu pour la collecte. Utiliser 1,5 ml rack tube et de l'azote liquide, de geler puis poncer tissus en poudre fine (de belles pièces en cas de Trizol). Répéter une fois. Amener le volume total de 1 ml Trizol et remettre le tissu du sol au vortex.
- Ajouter 200 ul de chloroforme et bien mélanger. Après 5 min à température ambiante, tourner dans la centrifugeuse à 4 ° C et 11 000 g pendant 15 min. Soigneusementajouter couche aqueuse directement sur une colonne de filtration de l'ADN génomique. Isoler à 11 000 x g pendant 5 min. Ajouter volume égal de RNase éthanol à 70% accréditives et mélanger à la pipette. Transfert de liquide à une colonne de collecte de l'ARN et poursuivre l'extraction de l'ARN selon les instructions fournies.
- Quantifier et d'évaluer la pureté de l'ARN total sur un spectrophotomètre de précision et de procéder à toute méthode de séquençage de l'ARN standard.
5. RT-PCR quantitative de l'ARN de validation de séquençage (figure 3)
- Sélectionnez autant de gènes que possible de comparer les niveaux d'expression des gènes relatifs sur une plage dynamique, à la fois l'abondance de la séquence prédite et la fonction du gène présumé chimiosensorielle.
- Conception des paires d'amorces pour chaque gène cible à amplifier un produit spécifique de 100 à 180 paires de bases par PCR. Exclure gDNA amplification non spécifique en assurant au moins une amorce par ensemble se étend sur une limite intron. Vous pouvez également utiliser le traitement DNase pour réduire la contamination génomique.
- Recueillirtissus insectes comme décrit dans la section précédente. Calculer la quantité de tissu nécessaire pour fournir suffisamment d'ARN pour compléter toutes les réactions qRT-PCR.
NOTE: triple biologique et réactions en triple techniques fourniront un maximum de confiance dans les résultats. - Calculer quantification relative du gène cible que X - (Ct [cible] -Ct [référence]) pour chaque gène cible et moyenne pour chaque répétition, à la fois biologique et technique. Utilisez gène (s) de ménage pour normaliser les valeurs de Ct entre réplicats biologiques et d'enraciner l'échelle de l'axe Y dans les comparaisons d'expression relative.
- Apprécier la similitude de l'ARN-seq et des ensembles de données qRT-PCR en utilisant les fonction de la régression, la procédure d'équivalence bootstrap 9, appliqué de manière itérative, les données de chaque tissu.
NOTE: Cette procédure identifie le plus petit «région de similitude" qui peut être construit autour de l'ARN-Seq données et qRT-PCR observée, et permettre l'expression relative de gènes tel que mesuré par qRT-PCR pour être considérée comme statistiquement équivalent à la mesure de l'expression relative des gènes par l'ARN-seq.
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Representative Results
Les enregistrements des traces de potentiels d'action Ae. aegypti sensilles gustatives (Figure 1) démontrer l'efficacité de la stimulation directe avec une gamme de produits chimiques. Cette technique peut être utilisée pour quantifier les réponses à tout produit chimique stimulant en comptant les pointes d'une amplitude et la durée donnée sur une plage de temps raisonnable (généralement moins de 500 ms). enregistrements de trace doivent être facilement reproductibles dans un ensemble donné de conditions expérimentales. Sinon, les réponses physiologiques observés peuvent représenter phénotypes rare chez les individus de l'espèce d'essai.
Les données de l'ARN-Seq Raw nécessite filtration et cartographie précise avant d'être présenté comme RPKM arrondie (le nombre de mappé lit par longueur kilobase de la transcription par million lectures mappé) ou FPKM (le nombre de fragments de lecture par longueur de kilobase de la transcription par million lectures mappés) valeurs numériques (figure 2). La distinction entreces deux méthodes de normalisation ARN-Seq a été décrit dans deux ouvrages de 10,11. Un avantage de séquençage de l'ARNm total est la capacité de détecter l'expression de la grande famille de gènes simultanément. La présentation visuelle de l'expression de nombreux gènes permet à la fois pour une compréhension unique de l'ensemble d'outils moléculaire pour un tissu donné. Les comparaisons entre les sexes, les stades de développement ou types de tissus peuvent être faites rapidement.
Répliques des ensembles de données biologiques d'ARN-seq peuvent être limitées par le coût ou la difficulté de collecte de tissu. qRT-PCR offre la possibilité de valider les petits sous-ensembles de l'expression génétique totale à moindre coût et nécessite ARN source moins. Side par la comparaison des données secondaires (figure 3A) permettre une plus grande confiance dans les résultats d'ARN-seq, que les deux méthodes sont basées sur différentes chimies de l'abondance du gène estimation. Fonctions d'équivalence statistiques (figure 3B) montrent les limites de sécurité dans chaque cas.
Figure 1: Des enregistrements électrophysiologiques d'un sensille de taille moyenne sur le labelle de Ae. femelles aegypti, modifiés du travail cité 12. traces montrent des réponses à 100 mM de NaCl, le saccharose 100 mM, la quinine 1, 0,8% de DEET, 0,8% Picaridin, 0,8% et 0,8% Citronellal IR3535. Les trois pointes avec des amplitudes ou formes différentes sont étiquetées A, B ou C. Ces trois pics correspondent aux trois sous-types de neurones sensoriels avec des sensibilités différentes: le sel, le sucre et amère, respectivement.
Figure 2:. Tableau de l'expression du gène du récepteur gustatif tel que déterminé par l'ARN-Seq pour 8 échantillons de tissus, modifiée du travail cité 13 cellules individuelles rapport valeurs RPKM pourchaque annotation des gènes gustative, tissus masculins (à gauche) et les tissus féminins (à droite). Les valeurs numériques sont arrondis au dixième près. Heat-carte intensité de la couleur est plafonné à plus RPKM et le milieu est mis à l'échelle pour chaque famille de gènes individuellement. Il ya une seule famille de gènes montré dans ce cas. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3:. Comparaison des données qRT-PCR et les données d'ARN-seq, modifiés de travail cité 13 (A) Chaque gène chimioréception de l'axe horizontal est représentée par deux colonnes de données. La colonne de gauche représente expression relative, tel que déterminé par l'ARN-Seq; valeurs de RPKM de gènes Chemoreception ont été divisés par celle de gène de ménage AAEG LASP pour générer proportions numériques dans ce tissu. Le droitcolonne représente expression relative déterminée par qRT-PCR. Premièrement, répétés biologique valeurs Ct pour les gènes de LaBella ont été normalisées en utilisant AAEG LASP comme un standard. Deuxièmement, répliquer les valeurs de Ct pour chaque gène ont été utilisés pour calculer les valeurs relatives d'expression (E cible - (Ct [cible] -Ct [référence])). Les barres d'erreur indiquent l'écart type des valeurs d'expression relative calculée individuellement. (B) ARN-Seq et qRT-PCR ensembles de données ont été comparées dans une analyse séparée. Les axes verticaux représentent l'abondance relative de gènes comme démontré par les données d'ARN-Seq, avec une valeur de 1 étant attribué au gène de ménage AAEG LASP et tous les autres l'expression des gènes étant signalé par rapport à cette valeur. Les axes horizontaux représentent abondance relative du gène comme prédit par qRT-PCR, avec une valeur de 1 étant attribué au gène de ménage AAEG LASP et tous les autres l'expression des gènes étant signalé par rapport à cette valeur. Les lignes rouges représentent équivalence exacte. Les lignes pointillées représentent les limites de la "région de similarité» pour pente, calculée par l'algorithme d'équivalence statistique 9. Lignes noires représentent la méthode des moindres carrés régression de l'équivalence qRT-PCR pour l'ARN-Seq quantification pour les 12 gènes cibles et gène de ménage AAEG LASP, chacun représenté par le point de données de cercle. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
L'aspect le plus difficile de potentiels d'action d'enregistrement de sensilles gustative est de décider lequel des réponses sont «normal». Lorsque l'on utilise seule pointe de sensille gustative l'enregistrement de la première fois pour une espèce d'insectes donnés, le nombre et la sensibilité des neurones récepteurs gustatifs totale (GRNS) sont probablement inconnu. De nombreux enregistrements préliminaires doivent d'abord décider de la gamme et les concentrations de produits chimiques à tester. Dans ce cas, nous avons commencé par l'observation qu'une seule GRN a répondu à de faibles concentrations de DEET (Figure 1). Par la suite, nous avons examiné les réponses dans le même sensille à une gamme de concentrations de produits chimiques connus pour être amer ou aversif à d'autres insectes et observé une forme de pic similaire et amplitude (Figure 1). Ces observations ont suggéré qu'un seul sous-type GRN répond à ces composés répulsifs. A titre de comparaison, nous avons testé des composés sucrés connus pour stimuler l'alimentation dans MOSQUitoes pour voir si un pic similaire se est produite. Nous avons observé un autre, plus grand pic dans ce cas. De même, nous avons observé une troisième pointe, de taille intermédiaire en réponse à la stimulation de sel, ce qui porte le total de nombre GRN sous-type à trois.
Préparations enregistrement électrophysiologique chez les insectes sont par nature variable. Cible sensilles gustatives sont généralement très petit et doit être placé à l'angle approprié pour accéder à l'électrode d'enregistrement sans toucher le verre à la cuticule. Pour établir un pont conducteur pour les neurones gustatifs, le pore terminal de la sensille doit être ouvert à la lymphe contenue d'établir un contact direct avec l'électrolyte de l'électrode d'enregistrement. Nous avons observé le blocage des ouvertures sensilles soit par les débris étrangers ou excrété et séché à l'intérieur du matériau sensille cible. Pour éviter ces obstacles, les soins doivent être prises lors élevage et la manipulation des insectes pour éviter le contact avec le sensilles cible. En plus de Choochanter en bon état, les insectes d'essai en bonne santé, les facteurs biologiques tels que l'âge, l'alimentation Etat, accouplement Etat et zeitgeber temps doit être considéré lors de l'établissement des contrôles pour réduire la variabilité des enregistrements.
Il peut être difficile d'obtenir une préparation répondant constamment. De nombreux essais peuvent être nécessaires pour améliorer le rapport signal suffisant à bruit pour résoudre pointes individuelles. Variations expérimentales sur les préparations ci-dessus peuvent conduire à de meilleurs résultats. Il est conseillé d'établir une réponse robuste sur votre appareil d'enregistrement pour vos espèces d'essai en utilisant une pointe éliciteur insectes commune, comme le saccharose ou la quinine. Une fois sensille gustative répond, ces réponses doivent être reproductibles. La longueur minimum de temps entre les stimulations doit être déterminée expérimentalement étudier la dynamique de crampons sous différentes contraintes temporelles. Stimulation excessive doit être évitée pour préserver la santé GRN et à prévenir la dégradation de la lymphe sensille. Dans le cas that sensibilité de réaction diminue rapidement après la première stimulation, un plus grand nombre de préparations doit être obtenu pour donner l'assurance que ces réponses sont physiologiquement typique pour l'espèce donnée.
La solubilité de certains produits chimiques d'essai peut créer de la difficulté à électrodes de stimulation, comme certains solvants peuvent affecter l'activité GRN, même à des concentrations finales faibles. Ces considérations peuvent être adressées par essais et erreurs et des contrôles appropriés. Tout solvant utilisé doit être ajoutée à l'électrolyte de commande et d'autres solutions de test pour assurer la cohérence des réponses. Petits insectes immobilisation, offrant ainsi un accès direct à cibler sensilles sans endommager les tissus fragiles, peuvent nécessiter des essais et erreurs.
La principale limitation de l'électrophysiologie est la séparation malheureuse de réponses neuronales observées et les réponses comportementales potentielles en aval. Par conséquent, il est avantageux de tester les réponses à des produits chimiques qui ont Been montré pour obtenir des réponses comportementales spécifiques afin de discuter de la signification des résultats dans un contexte écologique. Astuce enregistrements permettent une détection très précise de l'activité cellulaire, ce qui rend cette technique idéal pour l'évaluation des animaux transgéniques ou ceux présentant des différences phénotypiques dans le comportement. Ces enregistrements offrent également plus d'informations sur les réponses neuronales, comme la dynamique temporelle et d'amplitude, que les systèmes reposant sur des journalistes visuels de l'activité neuronale. Dans certains cas, les réponses neurales peuvent être quantifiés plus facilement que les 12 données comportementales.
collection de tissus pour l'ARN-seq et qRT-PCR est simple, mais exige de la concentration et de l'attention continue à la préservation de matériel cellulaire par le stockage à froid et d'éviter les excès d'humidité. activité RNase peut affecter la qualité de l'ARN; tissus conséquent devra se adresser uniquement les surfaces propres à travers la collecte et l'extraction de l'ARN. Bien que le dépannage nécessaire pour qRT-PCR is bien documenté, les pièges les plus probables se produisent tôt dans le processus lors de la conception et la sélection des amorces gènes cibles et d'entretien ménager. Les gènes qui représentent prévisible des points régulièrement espacés le long d'une ligne de niveau d'expression relative sont utiles pour comparer les ARN-seq et des ensembles de données qRT-PCR (figure 3). Par exemple, la sélection de gènes pour qPCR qui montrent des valeurs de RPKM de 0, 10, 20, 30, etc., respectivement, offrent un ordre prévisible de l'abondance à tester.
ARN-Seq a réussi à mettre en évidence l'expression de gènes humbles dans notre enquête sur les tissus gustatifs (Figure 2). La construction du gène fiable pour Ae. aegypti (AaegL1.3, http://aaegypti.vectorbase.org/GetData/Downloads/) et le gène de la chimioréception avant l'identification 14 fait marquant expression génique relativement facile. À ces fins, les insectes avec annotations de gènes disponibles et familles de gènes d'intérêt identifiés sont des systèmes modèles précieux. La détermination d'un seuil précispour l'expression génique contre le bruit de fond est spéculative, mais les méthodes de détermination de seuils raisonnables sont disponibles 15-17. Ici nous avons déterminé un niveau de confiance de RPKM complète et un niveau de RPKM inférieure de chute de confiance basé sur 9 précédent par lequel nous avons formulé notre discussion des résultats.
Dans l'avenir, nous espérons de disséquer autres tissus chimiosensoriels à la fois le moustique et d'autres insectes économiquement importants pour étendre notre connaissance des gènes de médiation insectes répulsion. Nous avons établi plusieurs gènes gustatives candidat qui sont les plus susceptibles à la médiation des réponses composés répulsifs en comparant les séquences de gènes pour les espèces avec des données fonctionnelles disponibles 13. Nous générons lignées transgéniques de moustiques ces gènes manquants chimiosensoriels individuels. Nous allons utiliser des enregistrements de pointe pour évaluer le rôle de ces gènes sur la capacité de l'animal pour détecter répulsifs connus et évaluer les réponses comportementales de ces mutants à Repellents. Dans le cas de ces gènes candidats ne affectent pas significativement la répulsion, et plus la résolution peut être nécessaire de déterminer plus précisément l'expression du gène ou de la présence de la protéine dans une cellule unique ou sensille. Lowly récepteurs exprimés peuvent être des cibles critiques pour le dépistage de nouveaux répulsifs, avec les co-récepteurs exprimés de manière ubiquitaire. Malheureusement, se est avéré extrêmement difficile dans un tissu gustatif insecte 18 hybridation in situ et en immunolocalisation.
Une fois que nous avons établi quels gènes médiation ces réponses physiologiques et les comportements, nous pouvons exprimer ces gènes dans des systèmes cellulaires qui se prêtent à criblage à haut débit de répulsifs candidats. Dans les approches in silico qui utilisent modélisation structurale 7 mai également être utile pour prédire quels types de composés vont induire de fortes réponses des récepteurs spécifiques.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass capillary | A-M Systems | 628000 | Standard, 1.5 mm X 0.86 mm, 4" |
| Silver wire | A-M Systems | 7875 | .015" bare |
| Tungsten wire | Alfa Products | 369 | 0.127 mm diameter |
| Fine forceps | Fine Science Tools | 11252 | #5SF Inox |
| Refridgerated stage | BioQuip Products | 1429 | Chill Table |
| Preamplifier | Syntech | Taste Probe | preamplifier |
| Software for electrophysiology | Syntech | Autospike | software for electrophysiology |
| TetraMin fish food | Tetra | Tropical fish food granules | fish food ground to fine powder |
| TRIzol | Life Technologies | 15596-026 | RNA isolation reagent |
| RNeasy Plus Mini Kit | Qiagen | 74136 | includes gDNA eliminator and RNeasy spin columns |
| Nanodrop spectrophotometer | Nano Drop Products | ND-1000 | tabletop spectrometer |
| R statistics | freeware (created by Robert Gentleman and Ross Ihaka) | www.r-project.org | Use the lm function of the stats package and the equiv.boot function of the equivalence package in the R computing environment. |
| 1.5 ml tube rack | Evergreen | 240-6388-030 | Pour liquid nitrogen into a few empty wells to freeze and grind tissue. |
| 1.5 ml collection tubes with pestle | Grainger | 6HAX6 | RNase free |
| Centrifuge | Thermo Scientific | 11178160 | Spin down frozen tissue to keep at bottom of 1.5 ml tube. |
| Primer-BLAST Primer Designing tool | NCBI | n/a |
References
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