Abstract
Mirna क्लोनिंग और उच्च throughput अनुक्रमण, मीर Seq, एकल nucleotide संकल्प के साथ miRNAs यों एक transcriptome चौड़ा दृष्टिकोण के रूप में अकेला खड़ा करार दिया. इस तकनीक miRNA के अणुओं को 3 'और 5' oligonucleotide एडाप्टर संलग्न द्वारा miRNAs कब्जा है और नए सिरे से miRNA खोज की अनुमति देता है. शक्तिशाली अगली पीढ़ी के अनुक्रमण प्लेटफार्म के साथ युग्मन, मीर Seq miRNA के जीव विज्ञान के अध्ययन में महत्वपूर्ण भूमिका निभाई है. हालांकि, oligonucleotide बंधाव कदम द्वारा शुरू की महत्वपूर्ण पूर्वाग्रहों एक सटीक quantitation के उपकरण के रूप में नियोजित किया जा रहा से मीर Seq रोका. पिछले अध्ययनों वर्तमान मीर Seq तरीकों में पूर्वाग्रहों अक्सर कुछ miRNAs 1,2 के लिए 1,000 गुना तक का त्रुटियों के साथ गलत miRNA मात्रा का ठहराव के लिए नेतृत्व कि प्रदर्शित करता है. शाही सेना बंधाव द्वारा दिया इन पूर्वाग्रहों को हल करने के लिए, हम दोनों '3 और 5' बंधाव कदम के लिए 95% से अधिक की बंधाव क्षमता में यह परिणाम है कि एक छोटे आरएनए बंधाव तरीका विकसित किया है. इस आईएम बेंचमार्किंगलगातार उम्मीद मूल्य से कम से कम दो गुना विचलन के साथ नंबर पढ़ता पैदावार, equimolar या विभिन्न मिश्रित सिंथेटिक miRNAs का उपयोग पुस्तकालय निर्माण विधि साबित कर दिया. इसके अलावा, यह उच्च दक्षता मीर Seq विधि में विवो कुल शाही सेना के नमूने 2 से सटीक जीनोम चौड़ा miRNA रूपरेखा देता है.
Introduction
उच्च throughput अनुक्रमण आधारित तरीके में व्यापक रूप से काफी जैविक प्रणालियों 3,4 की आणविक जटिलता के बारे में हमारी समझ को विस्तार हाल के वर्षों में कई जैविक नमूने के लिए लागू किया गया है. हालांकि, उच्च throughput अनुक्रमण के लिए शाही सेना के नमूने की तैयारी अक्सर इन शक्तिशाली तकनीक के संभावित उपयोगिता सीमित नियोजित कार्यप्रणाली के लिए निहित विशिष्ट पूर्वाग्रहों, प्रदान करता है. ये विधि विशिष्ट पूर्वाग्रहों अच्छी तरह बंधाव आधारित, छोटे-शाही सेना पुस्तकालय तैयारी 1,2,5,6 के लिए प्रलेखित किया गया है. इन पूर्वाग्रहों 1,000 गुना विभिन्नता में बेतहाशा चर और त्रुटि प्रवण अनुक्रमण डेटा से miRNA बहुतायत का अनुमान है, जिससे equimolar सिंथेटिक miRNAs के लिए संख्या पढ़ता परिणाम.
फेज-व्युत्पन्न टी -4 आरएनए ligases के गुणों पर ध्यान केंद्रित अध्ययन एंजाइमों उच्च throughput अनुक्रमण प्रयोगों में के रूप में पक्षपाती पुस्तकालयों प्रकट जो न्यूक्लियोटाइड आधारित वरीयताओं 7, प्रदर्शन है कि दस्तावेज है
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Protocol
नोट: यह पूरी प्रक्रिया के दौरान RNase मुक्त स्थिति बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण है.
3 'linker के 1. Adenylation
- Nuclease मुक्त एच 2 ओ में 100 माइक्रोन के लिए 3 'बंधाव प्रतिक्रियाओं के लिए बनाया गया डीएनए oligonucleotide पतला
नोट: oligonucleotide एक 5 'फॉस्फेट समूह, 5 में एक यादृच्छिक डाईन्यूक्लियोटाइड' अंत, और एक 3 'dideoxycytosine होना चाहिए. 5 adenylation 10 'फॉस्फेट समूह कुशल 5 के लिए महीना एंजाइम की आवश्यकता है'. फॉस्फेट सीधे संशोधन के साथ एक polynucleotide kinase साथ oligonucleotide के पूर्व उपचार से जोड़ा, या आदेश दिया जा सकता है. 5 'अंत में बेतरतीब डाईन्यूक्लियोटाइड जो निश्चित अंत-अंत दूसरों पर 6 प्रतिक्रियाओं में शामिल होने के लिए शाही सेना ligases प्रदर्शनी अनुक्रम वरीयता कम करने के लिए महत्वपूर्ण है. 3 oligonucleotide टी का अंत 'dideoxycytosine 3 में एक अवरुद्ध तत्व देता है'ओ बाद बंधाव चरणों के दौरान संयोजक-संयोजक concatamers के गठन को बाधित और भी बंधाव प्रतिक्रिया 11 3 '3 के अंत में गठित miRNA linker के अणु का अंत' ब्लॉक करने के लिए कार्य करता है. निम्नानुसार निष्पक्ष मीर Seq विधि के लिए चुना oligonucleotide संयोजक अनुक्रम है: 5'PO 4 NNTGGAATTCTCGGGTGCCAAGG-dideoxyC3 '. - 200 pmol 3 'लिंकर oligonucleotide, 4 μl 10x 5' डीएनए adenylation बफर, 4 μl 1 मिमी एटीपी, 4 μl महीना आरएनए ligase, nuclease मुक्त एच 2 हे 40 μl के अंतिम मात्रा को: निम्नलिखित adenylation प्रतिक्रिया इकट्ठे.
- 1 घंटे के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर प्रतिक्रिया सेते हैं. 5 मिनट के लिए 85 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करने से प्रतिक्रिया को समाप्त.
- अवशिष्ट एटीपी को दूर करने और भविष्य प्रतिक्रियाओं में अप्रत्याशित ligations को रोकने के लिए 100% इथेनॉल के 2.5 संस्करणों और 10 एम अमोनियम एसीटेट की 1/3 मात्रा के अलावा द्वारा adenylated संयोजक वेग.
- संक्षेप में, अल मिश्रणअल्कोहल, नमक, और 20 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर एक microcentrifuge में पूरी रफ्तार से कताई एकरूपता को oligo समाधान, (~ 15,000 XG). Adenylated oligo के 50-100 माइक्रोन उपज nuclease मुक्त एच 2 ओ की उचित मात्रा में 70% इथेनॉल, शुष्क हवा, और resuspend में गोली धो लें.
- एक 18% polyacrylamide जेल चलाकर adenylation की पुष्टि करें.
- एक साथ निम्नलिखित मिश्रण से जेल तैयार: 6.3 जी यूरिया, 40% acrylamide का 6.75 मिलीलीटर, और 10x TBE के 1.5 मिलीलीटर. एच 2 ओ से 15 मिलीलीटर जोड़ें.
- यूरिया पूरी तरह भंग है जब तक मिश्रण और अमोनियम persulfate (ए पी) और 15 μl tetramethlyethylenediamine (TEMED) (w / v) 150 μl 10% जोड़ें.
- जेल 1x TBE कमरे के तापमान पर बफर चलाने के साथ जेल चौड़ाई की 24 वी / सेमी पर 30 मिनट के लिए, पूर्व-रन रखा है एक बार. बफर चलाने के साथ 30 मिनट तक है एक बार फ्लश कुओं.
- साथ adenylated oligonucleotides और 2x denaturing शाही सेना लोड हो रहा है बफर के बराबर मात्रा (95% (वी / वी) Formamide के 5 pmol मिक्स0.02% एसडीएस, 0.02% bromophenol नीला (V / डब्ल्यू), 0.01% (वी / डब्ल्यू) (w / वी) Xylene Cyanol, 1.0 मिमी EDTA), गर्मी संक्षिप्त करने के लिए 75 डिग्री सेल्सियस, और बर्फ पर ठंडा तस्वीर. जेल के कुएं में पूरे नमूना बांटना. इसके अलावा एक गैर adenylated नियंत्रण के समान राशि, और कम आणविक भार आकार मानकों में शामिल हैं.
- Bromophenol नीले जेल की तह तक जिस तरह की ¾ है जब तक 24 वी / सेमी में जेल चलाएँ. 1x TBE में 1x SYBR-सोने के समाधान के साथ तंत्र, पोस्ट-दाग जेल जुदा और यूवी transilluminator बॉक्स (चित्रा 2) पर कल्पना.
नोट: इनपुट शाही सेना के साथ नमूनों की तुलना में जेल "कोई इनपुट शाही सेना" नियंत्रण पीसीआर उत्पाद के एक उच्च राशि में जिसके परिणामस्वरूप कर रहे हैं अगर ऊपर वर्णित है कि इसी तरह के एक तरीके में adenylated oligo शुद्ध.
2. Linker Ligation miRNA के 3 'के अंत करने के लिए
- 3 'Ligation
- (डब्ल्यू / वी) खूंटी 8000, 0.5 और 1.0 μl 50%: सूचीबद्ध क्रम में बर्फ पर निम्नलिखित घटकों को इकट्ठा# 956; एल 10x आरएनए ligase बफर (500 मिमी Tris-एचसीएल पीएच 7.5, 100 मिमी 2 MgCl, 10 मिमी डीटीटी), 1.0 μl, 3 'Linker (100 माइक्रोन), 0.5 μl RNase अवरोध करनेवाला, 0.5-8.0 माइक्रोग्राम प्रति कुल शाही सेना adenylated 0.5 μl टी -4 आरएनए ligase 2, 5 μl के अंतिम मात्रा को nuclease मुक्त एच 2 ओ.
- समाधान भंवर को भी चिपचिपा है, के रूप में होने के कारण एक बार अच्छी तरह से मिश्रित खूंटी 8000 के उच्च एकाग्रता के लिए pipetting द्वारा प्रतिक्रिया मिश्रण एक गर्म ढक्कन के साथ एक थर्मल cycler में प्रतिक्रिया जगह. 16 डिग्री सेल्सियस ब्लॉक सेट, और 4 घंटे के लिए सेते हैं.
नोट: प्रतिक्रिया बंधाव दक्षता में बिना किसी नुकसान के 20 μl के अंतिम मात्रा को बढ़ाया जा सकता है. परिवेश के तापमान में 4 घंटे के लिए प्रतिक्रिया या रातोंरात 4 डिग्री सेल्सियस पर अनिवार्य रूप से समान बंधाव क्षमता उपज.
- जेल शुद्धि
- 3 'बंधाव के बाद, 2x शाही सेना लोड हो रहा है बफर के एक बराबर मात्रा के साथ प्रतिक्रिया मिश्रण. 5 मिनट के लिए 70 डिग्री सेल्सियस गर्मी, और बर्फ पर शांत तस्वीर. पृष्ठ शुद्धि के लिए एक 15% polyacrylamide जेल पर नमूना चलाएँ.
- कदम 1.5 में पहले से वर्णित है कि इसी तरह के एक फैशन में, 7 एम यूरिया युक्त एक 15% polyacrylamide जेल तैयार करें.
- कम से कम 30 मिनट के लिए जेल चौड़ाई की 24 वी / सेमी में जेल पूर्व चलाते हैं. पूर्व चलाने के रूप में एक ही वोल्टेज में बिजली की आपूर्ति, फ्लश कुओं, भार नमूना और रन जेल बंद करें.
- नमूना लोड और bromophenol नीले जेल से बाहर निकल गया तो बस गया है जब तक पृष्ठ चलाते हैं. वांछित उत्पाद xylene cyanol के करीब विस्थापित करेगा.
- 3 'बंधाव के बाद, 2x शाही सेना लोड हो रहा है बफर के एक बराबर मात्रा के साथ प्रतिक्रिया मिश्रण. 5 मिनट के लिए 70 डिग्री सेल्सियस गर्मी, और बर्फ पर शांत तस्वीर. पृष्ठ शुद्धि के लिए एक 15% polyacrylamide जेल पर नमूना चलाएँ.
- धुंधला, दृश्य, और छांटना
- 15 मिनट के लिए 1x चल बफर (TBE), 1x SYBR-सोना, और चट्टान के साथ साफ ट्रे में जेल तंत्र और जगह जेल अलग करना.
- धुंधला पकवान से जेल निकालें और साफ प्लास्टिक की चादर के साथ कवर यूवी transilluminator बॉक्स पर कल्पना. बंधाव उत्पाद लंबाई में लगभग 45 न्यूक्लियोटाइड होना चाहिए.
- एक साफ razo साथ बंधाव उत्पाद युक्त क्षेत्र आबकारी0.5 मिलीलीटर सूक्ष्म अपकेंद्रित्र ट्यूब में आर ब्लेड और जगह.
- उत्पाद अलगाव और वर्षा
- पियर्स एक 30 जी सुई के साथ 0.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब के नीचे और एक दूसरे स्वच्छ, कम बनाए रखने में छेदा ट्यूब जगह, 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब. ~ 15,000 एक्स जी पर 5 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र.
- दिखने में पूरे जेल टुकड़ा भीतरी ट्यूब में छेद के माध्यम से ले जाया गया है कि इस बात की पुष्टि. यदि आवश्यक हो, करीब छेद करने के लिए कुछ जेल टुकड़े पुश करने के लिए एक साफ पिपेट टिप का उपयोग करें.
- खाली 0.5 मिलीलीटर ट्यूब त्यागें और एक्रिलामाइड घोल को उच्च नमक स्तंभ बफर के 400 μl (25 मिमी Tris-एचसीएल पीएच 7.5, 0.1% एसडीएस HSCB 400 मिमी NaCl) जोड़ें. रातोंरात 4 डिग्री सेल्सियस पर रॉक ट्यूब (ओं).
- एक विस्तृत बोर विंदुक टिप का उपयोग कर एक 0.22 माइक्रोन सेलूलोज एसीटेट स्पिन स्तंभ को घोल स्थानांतरण. ~ 15,000 XG पर कमरे के तापमान पर 3 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र दूर acrylamide जेल मैट्रिक्स से सभी तरल एकत्र करने के लिए.
- एक स्वच्छ, कम बनाए रखने के लिए तरल स्थानांतरण, 1.5 मिलीलीटर ट्यूब होते हैं20 मिलीग्राम / एमएल ग्लाइकोजन की 1 μl आईएनजी. एक isopropanol के बराबर मात्रा और 1/10 वें मात्रा सोडियम एसीटेट जोड़ें. ट्यूब कई बार inverting द्वारा समाधान मिक्स और 20 मिनट के लिए डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में -80 वेग.
- 20 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर पूरी गति से अपकेंद्रित्र न्यूक्लिक एसिड गोली. सतह पर तैरनेवाला निकालें और 70% इथेनॉल में धो लो. शुष्क हवा कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए गोली और 5 'बंधाव कदम के लिए सीधे आगे बढ़ना.
Linker हाइब्रिड 3. Linker Ligation से 5 'miRNA-3 का अंत'
- Pelleted न्यूक्लिक एसिड के लिए, निम्न घटकों को जोड़ने: 2 μl खूंटी 8000 (50% w / वी), 0.5 μl 10x आरएनए ligase बफर, 0.5 μl एटीपी (10 मिमी), 0.5 μl एनएन-आरएनए oligo (100 माइक्रोन), और एच 4 μl के अंतिम मात्रा को 2 हे.
नोट: 5'-उल्टे dideoxy-TCUACAGUCCGACGAUCNN3 चलता है और निर्माता द्वारा एचपीएलसी के माध्यम से शुद्ध किया गया था के रूप में 'एनएन-आरएनए oligo' की रचना है. - मिश्रणनीचे बार बार ऊपर pipetting और से यह नमूना. गोली पूरी तरह से फिर से solubilized किया गया है कि यह सुनिश्चित करने के लिए कुछ समय के लिए (5 मिनट के लिए) के लिए यह करो. फिर से solubilization समस्याग्रस्त है, तो 37 डिग्री सेल्सियस के लिए नमूना संक्षेप में (3-5 मिनट) गर्मी और मिश्रण को pipetting के फिर से शुरू.
- RNase अवरोध और टी -4 आरएनए ligase 1 (5 इकाइयों) की 1 मिश्रण: गोली समाधान में वापस आ गया है एक बार, एक 1 के 1 μl युक्त एक स्वच्छ पीसीआर ट्यूब के लिए सामग्री हस्तांतरण. फिर ऊपर और नीचे pipetting द्वारा मिश्रण.
- 4 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक थर्मल cycler में प्रतिक्रिया सेते हैं. सीडीएनए संश्लेषण के लिए तुरंत आगे बढ़ें.
4. रिवर्स प्रतिलेखन / सीडीएनए संश्लेषण
- 5 के लिए निम्न घटक जोड़ें 'Ligation प्रतिक्रिया: 2 μl 5x आरटी बफर, 0.75 μl 100 मिमी डीटीटी, 1 μl Illumina आरटी प्राइमर 5'-GCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3' (1 माइक्रोन), और 0.5 μl dNTPs (10 मिमी).
- 5 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस pipetting और गर्मी से मिलाएं. फिर धीरे धीरे बेंच टी पर शांतसेशन.
- प्रतिक्रिया बर्फ पर कमरे के तापमान, जगह ट्यूब को ठंडा और रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस एंजाइम और RNase अवरोध के प्रत्येक 0.5 μl जोड़ने के जाने के बाद. निर्माता के निर्देशों में संकेत विस्तार कदम के लिए थर्मल cycler में pipetting और जगह से मिलाएं.
- एक बार पूरा ऐड nuclease मुक्त एच 2 ओ के 5 μl 15 μl अप करने के लिए सीडीएनए पुस्तकालय की अंतिम मात्रा लाने के लिए.
5. पुस्तकालय तैयारी
- अनुक्रमण पीसीआर के लिए, बर्फ पर निम्न प्रतिक्रिया इकट्ठा: 6 μl 5x Phusion बफर, 1 μl dNTPs (10 मिमी), 0.9 μl DMSO के, 0.75 μl 5 'प्राइमर (25 माइक्रोन), 0.75 μl 3' प्राइमर (25 माइक्रोन), 3 μl सीडीएनए पुस्तकालय (इनपुट की राशि के आधार पर चर एकाग्रता), 0.5 μl Phusion पोलीमरेज़ (1 इकाई), 30 μl के अंतिम मात्रा को nuclease मुक्त एच 2 ओ. टेम्पलेट और का अनुक्रमण मंच के साथ अनुकूलता को आश्वस्त करने प्राइमर दृश्यों चुनेंचुनाव.
- 15 सेकंड के लिए 72 डिग्री सेल्सियस पर विस्तार, पहले 4 चक्र के लिए, 3 मिनट के लिए 98 डिग्री सेल्सियस पर प्रारंभिक विकृतीकरण 15 सेकंड के लिए 50 डिग्री सेल्सियस पर 15 सेकंड, पानी रखना के लिए 98 डिग्री सेल्सियस denature: पीसीआर निम्नलिखित सेटिंग्स के साथ प्रतिक्रिया भागो .
नोट: इनपुट सामग्री की मात्रा पर निर्भर करता है, कुल पीसीआर चक्र संख्या बदलती हैं. आमतौर पर, कुल शाही सेना के 1-2 माइक्रोग्राम प्रति का एक इनपुट के लिए, 13 कुल पीसीआर चक्र मीर Seq पुस्तकालय उत्पन्न करने के लिए पर्याप्त हैं. - Annealing और विस्तार चक्र संयुक्त और 30 सेकंड और विकृतीकरण के लिए 70 डिग्री सेल्सियस पर बाहर किया जाता है, जहां एक दो कदम तरीके से जैसे बाद के चक्र, चक्र 5-12, बाहर ले जाने के लिए फिर से 15 सेकंड के लिए 98 डिग्री सेल्सियस है.
नोट: प्रतिक्रिया मात्रा पीसीआर कार्यक्रम रोक परमिट और वांछित उत्पाद की उपस्थिति के लिए नजर रखने के लिए पूर्व निर्धारित चक्र संख्या में एक 10 μl विभाज्य दूर करने के लिए 30 μl है. आमतौर पर, चक्र 10, 13, और 16 कुल शाही सेना नमूना से परीक्षण के लिए चुना जाता है.
- 15 सेकंड के लिए 72 डिग्री सेल्सियस पर विस्तार, पहले 4 चक्र के लिए, 3 मिनट के लिए 98 डिग्री सेल्सियस पर प्रारंभिक विकृतीकरण 15 सेकंड के लिए 50 डिग्री सेल्सियस पर 15 सेकंड, पानी रखना के लिए 98 डिग्री सेल्सियस denature: पीसीआर निम्नलिखित सेटिंग्स के साथ प्रतिक्रिया भागो .
- तैयार करना40% acrylamide का 2 मिलीलीटर, 10x TBE के 1 मिलीग्राम, और एच 2 हे 10 मिलीलीटर मिश्रण से एक 8% गैर denaturing acrylamide जेल. फिर 10% ए पी के 100 μl और TEMED के 10 μl जोड़ें. जेल डालो और सेट करते हैं.
- 30 मिनट के लिए जेल चौड़ाई की 12 वी / सेमी में जेल पूर्व चलाते हैं. फ्लश कुओं. 10x लोड हो रहा है बफर के 1 μl जोड़ें (15% Ficoll-400, 66 मिमी EDTA, 20 मिमी Tris-एचसीएल पीएच 8.0, 0.1% (डब्ल्यू / नीले / वी) bromophenol डब्ल्यू वी) एसडीएस, 0.01% (), के 10 μl जोड़ने आयामों की हर अच्छी तरह 5 मिमी x 1 मिमी x 15 मिमी नमूना. आमतौर पर, प्रत्येक अच्छी तरह से नमूने के 30 μl को लोड कर सकते हैं. Bromophenol नीले डाई सिर्फ जेल के नीचे से बाहर चलाता है जब तक 1x TBE बफर में जेल चौड़ाई की 10 वी / सेमी नमूना जेल चलाएँ.
- दाग और कदम 2.3 में वर्णित के रूप में जेल कल्पना.
- 146 आधार जोड़ी बैंड उत्पाद शुल्क और खंड 2.4 में वर्णित है क्या करने के लिए इसी तरह के एक फैशन में HSCB के 0.25 मिलीलीटर में रातोंरात elute. एक isopropanol के बराबर मात्रा और 1/10 वें मात्रा सोडियम एसीटेट में डीएनए वेग. 70% ई में धो गोलीते बफर में thanol और resuspend.
- निर्माता की सिफारिशों के अनुसार PicoGreen का उपयोग पुस्तकालय यों.
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Representative Results
पूर्ववर्ती विधि के लिए प्रत्याशित परिणाम शुरू में (चित्रा 2) महीना आरएनए ligase द्वारा adenylation के अधीन था कि डीएनए oligonucleotide के आकार में एक एकल nucleotide पारी (वृद्धि) का अवलोकन किया जाना चाहिए. 3 'बंधाव के बाद, acrylamide जेल के दृश्य (चित्रा 3 देखें) जेल से 100-300 न्यूक्लियोटाइड क्षेत्र में स्पष्ट तेज उच्च आणविक भार बैंड इंगित करता है. यह प्रयोग किया जा रहा कुल शाही सेना नमूना उच्च गुणवत्ता की है इंगित करता है कि (अपमानित नहीं). दूसरे एक अतिरिक्त है जो जेल के 25 न्यूक्लियोटाइड क्षेत्र में एक बहुत ही उज्ज्वल संकेत, unligated 3 'लिंकर का पालन करना चाहिए. यह भी 3 'बंधाव में एक नहीं, इनपुट शाही सेना नियंत्रण शामिल करने के लिए सहायक हो सकता है. इस 3 'लिंकर की पवित्रता का संकेत होगा, और भी गैर विशिष्ट संकेत समस्याग्रस्त हो जाता है जब चक्र संख्या के संकेत के लिए पीसीआर कदम के माध्यम से किया जा सकता है. 5 'बंधाव के लिए कोई निदान नहीं है, हालांकि चित्रा 4 में दिखाया कार्यरत PEG8000 के उच्च एकाग्रता के महत्व को इंगित करता है जो रेडियो-लेबल शाही सेना के साथ किया वर्णित एक के समान एक प्रतिक्रिया है. अंत में, पीसीआर और देशी पृष्ठ बढ़ाया पीसीआर प्राइमरों से अनुकूलक दृश्यों का आकार, एक miRNA डालें, और अतिरिक्त दृश्य के साथ संगत 146 आधार जोड़े की एक डीएनए उत्पाद मनाया जा सकता है के बाद. यह (अनुभव से निर्धारित किया जाता है) पीसीआर चक्र की उचित संख्या अधिक हो गई है, तो कोई miRNA डालने उत्पाद वांछित amplicon आकार अस्पष्ट हो सकता है कि नोट करना महत्वपूर्ण है. सिंथेटिक miRNA के 5 pmoles, आम तौर पर कुल शाही सेना के 2 माइक्रोग्राम प्रति के लिए पीसीआर के 13-18 चक्र आवश्यक हैं से एक परिणाम चित्रा 5 में दिखाया गया है.
2-कदम बंधाव छोटे-शाही सेना पुस्तकालय तैयारी के लिए कार्यप्रवाह चित्रा 1. योजनाबद्ध. एसएक निष्पक्ष मीर Seq पुस्तकालय की तैयारी के लिए सामान्य कदम hown हैं. 3 काले रंग में दिखाया गया है 'चरण 1 में adenylation के माध्यम से सक्रिय होता है जो डीएनए बंधाव एडाप्टर, miRNA हरे रंग में दिखाया गया है और 3 से ligated है' चरण 2 में अनुकूलक, और 5 'शाही सेना बंधाव एडाप्टर के लिए ligated है जो नीले रंग में है चरण 3 क्रमिक चरणों में काइमेरिक अणु प्रोटोकॉल खंड में विस्तार से वर्णन किया गया हैं, इटैलिक एंजाइमी कदम से संकेत मिलता है.
चित्रा 2. 3 की Adenylation बंधाव प्रतिक्रिया '. महीना आरएनए ligase डीएनए oligonucleotide की adenylation से 18% Page-यूरिया जेल के साथ Linker बाद 3 के लिए प्रयोग की जाने वाली', (), (महीना आरएनए ligase साथ incubated था कि नमूना इंगित करता है - ) नमूना एंजाइम के बिना incubated, और (एम) आकार मानकों को इंगित करता है इंगित करता है (संख्या दिखाया एकबेस जोड़े में टी दाएं). बाएँ पर मौजूद oligonucleotide प्रजातियों में से एक योजनाबद्ध है. तारक न्यायपालिका oligonucleotide संश्लेषण द्वारा उत्पन्न बड़ा डीएनए उत्पादों को इंगित करता है.
चित्रा 3. सिंथेटिक और कुल शाही सेना के नमूने के 3 'Ligation. 3 में से एक) 15% Page-यूरिया जेल जेल शुद्ध नहीं था कि लिंकर 'बंधाव प्रतिक्रियाओं, (एम), (कोई आरएनए) कोई इनपुट शाही सेना और 3 के साथ एक प्रतिक्रिया इंगित करता है (बाएं पर संख्या आधार जोड़े संकेत मिलता है) आकार मानकों को इंगित करता है' (+) एक ही है, जेल-शुद्ध लिंकर साथ बंधाव '3 के अधीन माउस कुल शाही सेना की राशि का संकेत जेल-शुद्ध किया गया था जो संयोजक, (2 और 1 माइक्रोग्राम प्रति)' 5 सिंथेटिक miRNA के pmol और एक 3 के साथ प्रदर्शन बंधाव इंगित करता है , तारक पी 32 के साथ प्रदर्शन बंधाव प्रतिक्रिया अतिरिक्त 3 'भी इसी 3 के संयोजक. बी) Autoradiogram' को इंगित करता है 5 'सिंथेटिक miRNA लेबल खत्म होता है. शीर्ष पर नंबर प्रतिक्रिया आगे बढ़ने के लिए अनुमति दी गई थी समय (एचआर) को इंगित करता है, और नीचे में unligated और ligated की राशि का एक प्रतिशत के रूप में ligated राशि को इंगित करता है.
चित्रा 4. 5 'रेडियो लेबल miRNA-3'Linker हाइब्रिड के ligation. 5 की Autoradiogram' बंधाव प्रतिक्रिया संयोजक संकर 'सिंथेटिक miRNA -3 लेबल अंत' पी 32 5 के साथ प्रदर्शन किया. शीर्ष पर नंबर प्रतिक्रिया में इस्तेमाल किया खूंटी की राशि को इंगित करता है, और नीचे संख्या unligated और ligated की राशि का एक प्रतिशत के रूप में ligated राशि को इंगित करता है. MiRNA, 5 में हरी है 'और' 3 एडेप्टर क्रमशः, नीले और काले हैं छोड़ दिया, जहां पर लाइनों ligated अणुओं का एक योजनाबद्ध हैं.
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चित्रा 5. मीर Seq बंधाव प्रक्रिया से उत्पन्न पीसीआर उत्पादों के छोटे-शाही सेना डीएनए लाइब्रेरी. 8% मूल निवासी पृष्ठ पीसीआर व्युत्पन्न. शीर्ष पर नंबर पीसीआर के चक्र, पक्ष में संख्या आणविक आकार मानकों का संकेत संकेत मिलता है. पीसीआर से प्रत्येक डीएनए प्रजातियों सही में पहचान की है. ग्रिड पैटर्न नमूना पकवान की ऑटो प्रतिदीप्ति की वजह से है.
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Discussion
इस के साथ साथ वर्णित पद्धति बंधाव क्षमता, अर्थात् खूंटी, बेतरतीब Linkers के उपयोग की उच्च सांद्रता, और Linkers 2,6,9 के उच्च एकाग्रता को अधिकतम करने के लिए कई महत्वपूर्ण चर का उपयोग करता है. यह दृष्टिकोण कुल शाही सेना के नमूने 2 से मज़बूती से मात्रात्मक अनुक्रमण पुस्तकालयों देता है. हम इनपुट शाही सेना के कई अनुमापन का आयोजन किया है और पिछले पद्धति (नहीं दिखाया डेटा) 1-8 माइक्रोग्राम प्रति रेंज में कुल शाही सेना मात्रा के लिए सबसे उपयुक्त है कि यह निष्कर्ष निकाला है. 10-500 एनजी रेंज में मात्रा में उपयोग किया जाता है, पढ़ने के लिए अंतरिक्ष के बहुमत एडाप्टर concatamers और आरएनए ligases शुद्ध कर रहे हैं जिसमें से बैक्टीरियल दृश्यों से सेवन किया जाता है. हालांकि, यह कम संख्या में पढ़ता है, हालांकि समान उच्चतर इनपुट नमूनों की तुलना में जब वर्तमान मीर प्रजातियों, अभी भी वास्तविक मात्रा को प्रतिबिंबित करता है कि इन कम इनपुट प्रयोगों में ध्यान देने योग्य है. आदेश में कुल शाही सेना के नमूने से मनाया मीर प्रोफाइल वास्तविक को प्रतिबिंबित करता है कि यह सुनिश्चित करने के लिए, और विभिन्न नमूनों की जिरह की अनुमति के बराबर है, हम नियमित रूप से तीन सिंथेटिक अंशशोधक RNAs के 12 में से 10 गुना dilutions शामिल हैं. 0.01: अलग अंशशोधक RNAs के 0,001 pmol उपयोगी उपज परख की मात्रात्मक प्रकृति की पुष्टि के लिए संख्या पढ़ता हम 0.1 का समावेश है कि मिल गया है.
चित्रा 1 (तारक देखें) में बताया गया है कि सिंथेटिक oligonucleotides अक्सर आदेश दिया अनुक्रम से आकार में अलग हैं जो न्यायपालिका अणु होते हैं. इन उत्पादों miRNA-3 के साथ सह शुद्ध करने के लिए सक्षम हैं, तो महीना adenylation निम्नलिखित लिंकर 'लिंकर संकर, तो यह पृष्ठ के लिए आवश्यक 3 शुद्ध हो सकता है'. हम इस नकारात्मक नियंत्रण के नमूने में मनाया गैर विशिष्ट पीसीआर उत्पाद की मात्रा को कम करने के लिए उपयोगी हो पाया है.
ऊपर वर्णित पद्धति miRNA पुस्तकालयों 2 की मात्रात्मक तैयारी के लिए बेंचमार्क किया गया था हालांकि, हम पूरी तरह से यह एप्लिकेशन को आसानी से है कि आशासाथ ही अधिक सामान्य प्रक्रियाओं को licable; अर्थात् आरएनए seq और क्लिप Seq (क्रॉस लिंक इम्यूनो-वर्षा) पुस्तकालय तैयारी. वास्तव में, हम पहले से प्रकाशित रिपोर्ट 13 को मजबूत पुस्तकालय पीसीआर सापेक्ष में जिसके परिणामस्वरूप प्रयोगों-Seq क्लिप करने के लिए पूर्ववर्ती कार्यप्रणाली का एक ही सिद्धांत के कुछ कार्यरत है (नहीं दिखाया डेटा). सीरम miRNAs एक चिकित्सा नैदानिक उपकरण के रूप में कर्षण हासिल रूप में अंत में, हम पिछले पद्धति सबसे मजबूत और विश्वसनीय miRNA बायोमार्कर की पहचान करने में बहुत सहायता करेगा पूर्वानुमान.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3' Linker (5' phosphorylated, 3' blocked) | Integrated DNA Technologies | custom | |
| 5' Linker | Integrated DNA Technologies | custom | 5' blocked, HPLC purified |
| T4RNL2 (1-249 K227Q) | New England Biolabs | M0351S | Specialized for ligation of pre-adenylated DNA adapters |
| 10x Ligation buffer (without ATP) | New England Biolabs | Included with M0351S | |
| 10x Ligation buffer (with ATP) | New England Biolabs | Included with M0204L | |
| RNaseOUT | Invitrogen | 10777-019 | |
| Polyethylene glycol (mol. Wt. 8,000) | New England Biolabs | Included with M0204L | |
| Nuclease-free water | Ambion | AM9937 | We have found water collected from a distillation apparatus to be of equvalent quality. |
| T4RNL1 | New England Biolabs | M0204L | |
| Superscript III RT kit | Invitrogen | 18080-051 | |
| Phusion PCR kit | New England Biolabs | M0530S | |
| Illumina RP1 primer | Integrated DNA Technologies | custom | Sequence information available from Illumina |
| Illumina RT primer | Integrated DNA Technologies | custom | Sequence information available from Illumina |
| Illumina index primer(s) | Integrated DNA Technologies | custom | Sequence information available from Illumina |
| 40% Acrylamide | Fisher Scientific | BP14081 | |
| Urea | Sigma Aldrich | U6504 | |
| Ammonium persulfate | Sigma Aldrich | A3678 | |
| Tetramethyethylenediamine (TEMED) | Sigma Aldrich | T9281 | |
| 2x Denaturing RNA loading buffer | New England Biolabs | Included with M0351S | |
| Razor blades | VWR | 55411-050 | |
| SpinX Centricon tubes | Costar | CLS8161 | |
| Low retention microfuge tubes | Fisher Scientific | 02-681-320 | |
| Sybr Gold | Invitrogen | S-11494 | |
| Adenylation kit | New England Biolabs | E2610L |
References
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