Abstract
MiRNA klonlama ve yüksek verim sıralama, miR-Dizi, tek nükleotid çözünürlükte miRNA'lar ölçmek için bir transcriptome geniş bir yaklaşım olarak tek başına duruyor adlandırılır. Bu teknik MiRNA moleküllere 3 've 5' oligonükleotid adaptörler takılarak miRNA'lar yakalar de novo miRNA keşif sağlar. Güçlü yeni nesil dizileme platformları ile birleştirilmesi sonucu, miR-Seq miRNA biyoloji çalışmaya vesile olmuştur. Ancak, oligonükleotid ligasyon adımlarla tarafından tanıtıldı önemli önyargılar doğru bir kantitasyon aracı olarak istihdam edilmesini miR-seg engellemiştir. Önceki çalışmalar, mevcut miR-Dizi yöntemleri önyargıları genellikle bazı miRNA'ların 1,2 1.000 kata kadar hataları ile yanlış miRNA miktar yol açtığını göstermektedir. RNA ligasyonu ile kazandırılan bu önyargıları gidermek için, biz de 3 've 5' ligasyon adımlar için% 95'in üzerinde ligasyonu verimliliği ile sonuçlanan bir küçük RNA ligasyonu yöntemi geliştirdik. Bu im Kıyaslamasürekli beklenen değerden az iki kat sapmayla numaraları okur verir, eşit molar veya farklı olarak karışık sentetik miRNA'lar kullanarak kitaplık inşaat yöntemi olduğunu kanıtladı. Ayrıca, bu yüksek verimli miR-Dizi yöntem in vivo toplam RNA örneklerinde 2 doğru genom miRNA profilleme izin verir.
Introduction
Yüksek verim sıralama tabanlı metodolojileri yaygın ölçüde biyolojik sistemlerin 3,4 moleküler karmaşıklığı anlayışımızı genişleyen son yıllarda birçok biyolojik numunelere uygulanmıştır. Ancak, yüksek sekanslama için RNA örneklerinin hazırlanması çoğu zaman, bu güçlü teknikleri potansiyel kullanımını sınırlayan çalışan yönteme özgü belirli bir yanlılığı kazandırır. Bu yöntem, belirli önyargıları iyi ligasyon-temelli, küçük RNA kütüphane hazırlıkları 1,2,5,6 için belgelenmiştir. Bu önyargıları 1,000 kat varyasyon çılgınca değişken ve hata eğilimli sıralama verilerinden miRNA bereket çıkarsama yapma, eşit molar sentetik miRNA'ların için sayıları okur sonuçlanabilir.
Faj türevli, T4 RNA ligazların özelliklerine odaklanarak çalışmalar enzimler yüksek verimli sekanslama deneylerde belirlendiği gibi yanlı kitaplıkları ortaya nükleotid bazlı tercihleri 7, olduğu belgelenmiştir adres
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Not: Bu, tüm işlem boyunca RNase içermeyen koşulları sağlamak için çok önemlidir.
3 'Bağlayıcının 1. Adenylation
- Nükleaz içermeyen H2O içinde 100 uM 3 ligasyon reaksiyonları için tasarlanmış DNA oligonükleotid seyreltin
Not: oligonükleotidi bir 5 'fosfat grubu, 5 bir randomize dinükleotid' ucuna ve 3 'dideoxycytosine olmalıdır. 5 PCP 10 'fosfat grubu etkili 5 için Mth enzimin bir gerekliliktir'. Fosfat doğrudan modifikasyonu ile bir polinükleotid kinaz ile oligonükleotidin ön-muamele ile ilave ya da istenebilir. 5 'ucunda, randomize dinükleotit hangi belirli bir son uç diğerleri üzerinde 6 tepkileri birleştirilmesi için bir RNA ligaz sergiler sekansı tercih en aza indirmek için önemlidir. 3, oligonükleotid t 'ucuna dideoxycytosine 3 bir blokaj elemanının yerleştirir'O sonraki bağlama adımları sırasında bağlayıcı-bağlayıcı konkatamerler oluşumunu inhibe eden ve aynı zamanda bağlama reaksiyonu, 11 3 '3'ün ucunda oluşturulan miRNA-Bağlayıcı molekülün ucunu' için blok teşkil eder. Aşağıdaki gibi tarafsız miR-Dizi yöntemi için seçilen oligonükleotid linker dizisi olduğu için: 5'PO 4 NNTGGAATTCTCGGGTGCCAAGG-dideoxyC3. ' - 200 pmol 3 'oligonükleotidi, 4 ul 10x için 5' DNA adenilasyon tampon maddesi, 4 ul 1 mM ATP, 4 ul Mde RNA ligaz, nükleaz içermeyen H2O 40 ul'lik nihai bir hacme kadar: Aşağıdaki adenilasyon reaksiyon bir araya getirin.
- 1 saat boyunca 65 ° C'de reaksiyon inkübe edin. 5 dakika boyunca 85 ° C'ye ısıtılması yolu ile reaksiyonu bitirin.
- Kalıntı ATP kaldırmak ve gelecekteki reaksiyonlarda beklenmedik ligasyonu önlemek için% 100 2.5 hacim etanol ve 10 M amonyum asetat 1/3 hacme ilavesiyle adenylated bağlayıcı çökeltilmesi.
- Kısaca, al karıştırıncohol, tuz ve 20 dakika boyunca 4 ° C'de bir mikrosantrifüj içinde tam hızda eğirme homojenlik oligo çözeltisi (~ 15,000 xg). Adenylated oligo 50-100 uM vermek üzere nükleaz içermeyen H2O uygun hacimde% 70 etanol, kuru hava ve tekrar süspansiyon pelet yıkayın.
- % 18 poliakrilamidjeli çalıştırarak adenilasyon onaylayın.
- Birlikte, aşağıdakileri karıştırarak jel hazırlayın: 6.3 g üre,% 40 akrilamid 6.75 mi, ve 10x TBE 1.5 mi. H 2 O 15 ml ilave edilir.
- Üre tamamen çözülene kadar karıştırın ve amonyum persülfat (BP), ve 15 ul tetramethlyethylenediamine (TEMED) (ağ / hac), 150 ul% 10 ekleyin.
- Jel 1x TBE oda sıcaklığında tampon maddesi ile jel genişliğinin 24 V / cm 'de 30 dakika boyunca ön-run kurduğunda. Tamponu ile çalışan 30 dk kadar bir kez yıkayın kuyular.
- Ile adenylated oligonükleotitlerin ve 2x denatüre RNA yükleyici tampon eşit hacimde (% 95 (h / h) formamid 5 pmol karıştırın% 0.02 SDS,% 0.02 bromofenol mavisi (ağırlık / hacim),% 0.01 (ağırlık / hacim) (w / v) Ksilen siyanol, 1.0 mM EDTA) içinde, ısı kısa bir süre için 75 ° C ve buz üzerinde soğutuldu oturmaktadır. Jelin kuyuya, örneğin tamamına koyun. Aynı zamanda, bir sigara adenylated kontrol benzer bir miktar ve düşük molekül ağırlıklı boyutu standartlarına uygun bulunmaktadır.
- Bromofenol mavi jel tabanına yol ¾'ünü kadar 24 V / cm jel üzerinde çalıştırıldı. 1x TBE 1x SYBR-altın çözeltisi ile cihaz, post-leke jel sökmeye ve UV-transilluminator'de kutusu (Şekil 2) görselleştirmek.
Not: girdi RNA örnekleri ile karşılaştırıldığında Jel ", herhangi bir giriş RNA 'olarak kontrol PCR ürününün yüksek miktarda elde edilir, yukarıda tarif edilene benzer bir şekilde adenylated oligo temizler.
2. Bağlayıcı Ligasyon miRNA 3 'ucuna
- 3 'Ligasyon
- (Ağ / hac) PEG 8000, 0.5 ve 1.0 ul% 50: sıraya uygun olarak buz üzerinde, aşağıdaki bileşenleri monte956. l 10x RNA ligaz tamponu (500mM Tris-HCI pH 7.5, 100 mM MgCl2, 10 mM DTT), 1.0 ul, 3 'Linker (100 uM), 0.5 ul RNaz inhibitörü, 0,5-8,0 ug toplam RNA, adenylated 0.5 ul T4 RNA ligaz, 2, 5 ul'lik nihai bir hacme kadar nükleaz içermeyen H2O.
- Çözelti girdaba çok viskoz olduğu gibi bağlı bir kez iyice karıştırılır PEG 8000 yüksek konsantrasyonu pipetleme tepkime karışımı ısıtılmış kapak ile, bir termal döngü reaksiyonu yerleştirin. 16 ° C'ye kadar bloğu ayarlama, ve 4 saat süreyle inkübe edin.
Not: Reaksiyon bağlanma verimliliği herhangi bir kayıp olmadan 20 ul bir son hacme kadar ölçeklendirilebilir. Çevre sıcaklığında 4 saat boyunca reaksiyona girmesi ya da gece boyunca 4 ° C 'de esas itibarıyla benzer bağlanma verimliliği elde edilir.
- Jel saflaştırma
- 3 'Ligasyondan sonra, 2x RNA yükleyici tampon maddesinin eşit hacmi ile reaksiyona karıştırın. 5 dakika boyunca 70 ° C'ye kadar ısı ve buz üzerinde serin ek. PAGE arıtılması için bir% 15 poliakrilamid jeli üzerinde örnek çalıştırın.
- Adım 1.5'te daha önce tarif edilene benzer bir şekilde, 7 M üre ihtiva eden bir% 15 poliakrilamid jelinde hazırlayın.
- En az 30 dakika boyunca jel genişliği 24 V / cm jel ön çalıştırın. Öncesi dönemde aynı geriliminde güç kaynağı, floş kuyuları, yük örnek ve çalışma jel kapatın.
- Örnek yükleyin ve Bromophenol mavi jel çıkıldı sadece kadar PAGE çalıştırın. Arzu edilen ürün, iksilen siyanol yakın hareket edecektir.
- 3 'Ligasyondan sonra, 2x RNA yükleyici tampon maddesinin eşit hacmi ile reaksiyona karıştırın. 5 dakika boyunca 70 ° C'ye kadar ısı ve buz üzerinde serin ek. PAGE arıtılması için bir% 15 poliakrilamid jeli üzerinde örnek çalıştırın.
- Boyama, Görselleştirme ve Eksizyon
- 15 dakika boyunca 1x çalışan tampon (TBE), 1x SYBR-altın ve kaya temiz tepsiye jel aparat ve yer jel sökmeye.
- Boyanması çanak jel çıkarın ve temiz bir plastik wrap ile kaplı UV transilluminator'de kutusunda görselleştirmek. Ligasyon ürünü, uzunluğu yaklaşık 45 nükleotid olacaktır.
- Temiz bir Razo ile ligasyon ürünü içeren bölgeyi tüketim0.5 ml mikro-santrifüj tüpüne r bıçak ve yer.
- Ürün İzolasyon ve Yağış
- Pierce, 30 G iğne ile 0.5 ml mikrosantrifüj tüp alt ve ikinci bir temiz, düşük tutma deldi tüp yeri, 1.5 ml mikrosantrifüj tüp. ~ 15,000 x g'de 5 dakika boyunca santrifüje.
- Görme tüm jel dilim iç tüp delikten hareket ettiğini teyit etmektedir. Gerekirse, yakın deliğe bazı jel parçaları itmek için temiz bir pipet kullanın.
- Boş 0.5 mi tüp atılır ve akrilamid bulamaca yüksek tuzlu kolon tamponu 400 ul (25 mM Tris-HCI pH 7.5,% 0.1 SDS HSCB 400 mM NaCl) ilave edin. Gece boyunca 4 ° C 'de kaya tüpü (s).
- Geniş çaplı bir pipet kullanarak 0.22 mikron selüloz asetat spin kolon bulamaç aktarın. ~ 15,000 x g'de, oda sıcaklığında 3 dakika boyunca santrifüje uzaklıkta akrilamid jel matrisi tüm sıvı toplamak.
- Temiz, düşük tutma sıvı transfer, 1.5 ml tüp içerir20 mg / ml glikojen 1 ul ing. Bir izopropanol eşit hacim ve 10/1 inci hacim sodyum asetat ekleyin. Tüpü birkaç kez baş aşağı çevirerek çözeltisi karıştırın ve 20 dakika boyunca ° C sıcaklıkta dondurucuya -80 hızlandırabilir.
- 20 dakika boyunca 4 ° C 'de tam hızda santrifüje nükleik asidi: pelet. Süpernatantı ve% 70 etanol içinde yıkayın. Havada kurutma, oda sıcaklığında 10 dakika süre ile pellet halindedir ve 5 'bağlama adımı doğrudan devam edin.
Bağlayıcı Hybrid 3. Bağlayıcı ligasyon 5 'miRNA-3 Sonu'
- Tanelenmiş nükleik asit için, aşağıdaki bileşenler eklemek: 2 ul PEG 8000 (% 50 ağırlık / hacim), 0.5 ul 10x RNA ligaz tamponu, 0.5 ul ATP (10 mM), 0.5 ul NN-RNA, oligo (100 uM), ve H 4 ul bir son hacim 2 O.
NOT: 5'-ters dideoksi-TCUACAGUCCGACGAUCNN3 "ifadesi ve üretici tarafından HPLC ile saflaştırıldı 'NN-RNA, oligo' in bileşimi olup. - Karıştırmakaşağı defalarca yukarı pipetleme ve bu örnek. Pelet tamamen yeniden solübilize olmuştur emin olmak için bir süre (5 dk) için yapın. Yeniden-solübilizasyon sorunlu ise, 37 ° C örnek kısaca (3-5 dk) ısı ve karıştırmak için pipetlenmesini devam.
- RNaz inhibitörü ve T4 RNA ligaz 1 (5 birim): 1'lik bir karışımı topak çözelti içinde geri sonra, bir 1 1 ul içeren temiz bir PCR tüpü aktarılmaktadır. Yine aşağı yukarı pipetleme karıştırın.
- 4 saat 37 ° C'de bir termal döngü reaksiyonu inkübe edin. CDNA sentezi hemen geçin.
4. ters transkripsiyon / cDNA Sentezi
- 5 Aşağıdaki bileşenleri ekleme ligasyon reaksiyonu: 2 ul 5X RT tampon maddesi, 0,75 ul 100 mM DTT, 1 ul Illumina RT primer 5'-GCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3 '(1 uM) ve 0.5 ul dNTP (10 mM) getirilmiştir.
- 5 dakika boyunca 65 ° C'ye kadar pipetleme ve ısı ile karıştırın. Sonra yavaş yavaş tezgah t üzerinde soğumasınıop.
- Reaksiyon, buz üzerinde, oda sıcaklığında, bir yer tüpüne soğutuldu ve ters transkriptaz enzimi ve RNase inhibitör her biri 0.5 ul ekleyin sonra. Imalatçının talimatlarında belirtildiği uzatma aşaması için ısı döngüleyici içinde pipetleme ve yerine göre karıştırın.
- Tamamlandığında eklenti nükleaz içermeyen H2O 5 ul 15 ul kadar cDNA kütüphanesinin son hacmi getirmek.
5. Kütüphane hazırlanması
- Endeksleme PCR için, buz üzerinde, aşağıdaki reaksiyon monte: 6 ul 5x Phusion Tampon, 1 ul dNTP (10 mM), 0.9 ul DMSO, 0.75 ul 5 'primer (25 uM), 0.75 ul 3' primer (25 uM), 3 ul cDNA kütüphanesi (girdi miktarına bağlı olarak değişken konsantrasyon), 0.5 ul Phusion Polimeraz (1 ünite), 30 ul'lik nihai bir hacme kadar nükleaz içermeyen H2O. Şablonun ve sıralama platformu ile uyumluluğu sağlamak için primer dizileri seçinseçim.
- 15 saniye için 72 ° C 'de uzanmaktadır, birinci 4 çevrim için, 3 dakika boyunca 98 ° C de ilk denaturasyon 15 sn için 50 ° C'de 15 saniye, tavlama için 98 ° C denatüre: PCR, aşağıdaki ayarlarla bir reaksiyondan .
NOT: giriş malzemenin miktarına bağlı olarak, toplam PCR çevrim numaraları değişir. Tipik olarak, toplam RNA 1-2 ug bir giriş için, 13 toplam PCR döngüleri mıR-Dizi kütüphane oluşturmak için yeterlidir. - Tavlama ve uzatma çevrimi bir araya getirilmiş ve 30 sn için ve denatürasyon için 70 ° C sıcaklıkta gerçekleştirilmektedir, iki aşamalı bir şekilde, örneğin daha sonraki aşamalarda, durulamalar, 5-12, yürütmek tekrar 15 sn için 98 ° C 'dir.
Not: Reaksiyon hacmi PCR programı duraklatma izin veren ve arzu edilen ürün bir görünüm için izlemek için önceden belirlenmiş bir döngü sayılarında, 10 ul bir kısım kaldırmak üzere 30 ul. Tipik haliyle, çevrimleri 10, 13 ve 16 toplam RNA numunesinin test için seçilir.
- 15 saniye için 72 ° C 'de uzanmaktadır, birinci 4 çevrim için, 3 dakika boyunca 98 ° C de ilk denaturasyon 15 sn için 50 ° C'de 15 saniye, tavlama için 98 ° C denatüre: PCR, aşağıdaki ayarlarla bir reaksiyondan .
- Hazırlamak% 40 akrilamid ve 2 ml 10x TBE 1 ml, ve H2O 10 ml karıştırılarak% 8 denatüre edici olmayan akrilamid jeli. Daha sonra% 10 APS 100 ul ve TEMED 10 ul ekle. Jel dökün ve set edelim.
- 30 dakika boyunca jel genişliği, 12 V / cm jel ön çalıştırın. Floş kuyular. 10x yükleme tamponu 1 ul ekle (15% Ficoll 400, 66 mM EDTA, 20 mM Tris-HCI, pH 8.0,% 0.1 (ağ / mavi / hacim) bromofenol hac) SDS,% 0.01 () 10 ul ekle boyutları her çukuruna 5 mm x 1 mm x 15 mm numune. Tipik olarak, her iyi örneklerin 30 ul yükleyebilirsiniz. Bromofenol mavi boya sadece jel alt bitene kadar 1x TBE tamponu içinde, jel genişliği 10 V / cm 'de örnek jel üzerinde çalıştırıldı.
- Leke ve aşama 2.3'de tarif edildiği gibi jel görselleştirmek.
- 146 baz çift bant pulu ve Bölüm 2.4 de tarif edilene benzer bir şekilde, HSCB 0.25 ml, gece boyunca tasfiye edilir. Bir izopropanol eşit hacimde ve 10/1 inci hacim sodyum asetat DNA hızlandırabilir. % 70 e yıkama peletTE tamponunda -metanol ve tekrar süspansiyon.
- Üreticinin tavsiyelerine göre PicoGreen kullanarak kütüphane niceliğini.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Yukarıdaki yöntemi için beklenen sonuçlar, ilk (Şekil 2) Mde RNA ligaz ile PCP tabi tutuldu DNA oligonükleotidin büyüklüğünde tek bir nükleotid vardiya (artış) gözlenmesi gerekir. 3 'bağlanmasından sonra, akrilamid jel görselleştirme (bakınız Şekil 3), jel, 100-300 nükleotid bölgesinde barizdir net, yüksek molekül ağırlıklı bant gösterir. Bu kullanılan toplam RNA numunesi yüksek kalitede olduğunu gösterir (bozulmuş değil). İkinci olarak, bir aşırı olan jelli 25 nükleotid bölgesine bir çok parlak sinyal, bağlanmamış 3 'bağ dikkat edilmelidir. Ayrıca 3 'bağlanma içinde bir giriş sinyali bir RNA kontrolü dahil etmek yararlı olabilir. Bu 3 'bağlayıcının saflığını gösterir, ve aynı zamanda spesifik olmayan sinyal sorunlu hale gelir döngüsü sayısının gösterilmesi için PCR aşamasından yoluyla gerçekleştirilebilir. 5 'ligasyon bir teşhis yokturAncak, Şekil 4'te gösterilen kullanılan PEG8000 ve yüksek konsantrasyon önemini göstermektedir radyoaktif olarak işaretlenmiş RNA ile gerçekleştirilmiştir tarif eşdeğer bir reaksiyondur. Son olarak, PCR ve yerel PAGE, uzatılmış, PCR primerleri, adaptör sıraların söz boyutu, bir miRNA insert, ve ek dizisi ile tutarlı 146 baz çiftlik bir DNA ürünü gözlenebilir sonra. O (ampirik olarak belirlenir) PCR döngüleri uygun sayısı aşılırsa, hiçbir miRNA insert ürün istenen amplikonu boyutunu gizleyebilir dikkat etmek önemlidir. Sentetik miRNA 5 pmol, tipik olarak, toplam RNA 2 ug PCR 13-18 devir gerekli olan bir sonuç Şekil 5 içinde gösterilmektedir.
2-adımlı ligasyonu küçük RNA kütüphane hazırlanması için iş akışı Şekil 1. şematik. Starafsız bir miR-Seq kütüphanesinin hazırlanması için genel adımlar hown bulunmaktadır. 3 siyah olduğunu göstermiştir 'adım 1 PCP üzerinden aktive edilir DNA bağlama adaptörü, miRNA yeşil gösterilir ve 3 lige edilmiştir' 2. adımda adaptörü, ve 5 'RNA ligasyonu adaptör lige edilmiştir mavisinin adım 3. Numaralı adımda kimerik molekülü Protokol bölümünde ayrıntılı olarak anlatılmıştır, italik enzimatik adımlarını gösterir.
Şekil 2. 3 Adenylation ligasyon reaksiyonu. 'Mde RNA Ligase DNA, oligonükleotid PCP 18% PAGE-üre jel ile Bağlayıcı ardışık 3 için kullanılacak', (+) (Mde RNA ligaz ile kuluçkalanmıştır bir örneği belirtir - ) bir numunesi, enzim olmadan kuluçkalanmıştır, ve (m) boyutu standartlarına işaret eder gösterir (sayı gösterilen birbaz çifti t sağ). Solunda bulunan oligonükleotid türlerin bir şemasıdır. Yıldız işareti olarak anormal bir oligonükleotit sentezi ile üretilen daha büyük bir DNA ürünleri göstermektedir.
Şekil 3. Sentetik ve Total RNA Örneklerinin 3 'ligasyonu. 3 A),% 15 PAGE üre-jelatin içinde jelle saflaştırıldı değildi bağlayıcı ligasyon reaksiyonları, (m), (hiç bir RNA), giriş RNA ve 3 ile bir reaksiyonu gösterir (soldaki sayılar baz çiftini göstermektedir) boyutu standartlarına işaret eder ' (+) 'da aynı jel-saflaştırılmış bir bağlayıcı ile ligasyon' 3 maruz mouse total RNA miktarını göstermektedir jelle arıtıldı bağlayıcı, (2 ve 1 ug) '5 sentetik miRNA pmol ve 3 ile yapılan bağlanmasını gösterir , yıldız P 32 ile yapılan ligasyon reaksiyonu fazlalığı 3 'benzer 3 bağlayıcı. B) otoradyogramı' gösterir 5 'sentetik miRNA etiketli sonunda. Üstündeki sayısı reaksiyon devam etmesine izin verildi süresi (saat) gösterir ve alt bağlanmamış ve bağlandı toplamının yüzdesi olarak bağlanmıştır miktarını gösterir.
Şekil 4. 5 'Radyo-etiketli miRNA-3'Linker Hybrid ligasyonu. 5 otoradyogramı' ligasyon reaksiyonu bağlayıcı melez 'sentetik miRNA-3 etiketli ucu' P 32 5 ile gerçekleştirildi. Üst Number reaksiyonda kullanılan PEG miktarını gösterir ve alt sayısı bağlanmamış ve bağlandı toplamının yüzdesi olarak bağlanmıştır miktarını gösterir. MiRNA, 5 yeşil 've 3' adaptör, sırasıyla, mavi ve siyah burada sol hatları bağlanmış moleküller şematiktir.
pload / 52.095 / 52095fig5highres.jpg "/>
Şekil 5. miR-Dizi bağlama prosedürü oluşturulmuş PCR ürünleri küçük RNA, DNA Kütüphanesi. 8,% yerel PAGE PCR-tüREV. Üst Numaraları PCR döngüleri, tarafında sayılar molekül boyutu standartlarını göstermektedir gösterir. PCR ile ilgili her bir DNA türlerinin doğru tespit edilir. Izgara şeklini numune çanağı bir oto-floresan kaynaklanmaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu tarifnamede anlatılan yöntemler, bağlama verimliliği, yani PEG, randomize bağlayıcıların kullanımı yüksek konsantrasyonlarda ve bağlayıcıların 2,6,9 yüksek konsantrasyonu en üst düzeye çıkarmak için birkaç anahtar değişkenlerden kullanır. Bu yaklaşım, total RNA örnekleri 2 güvenilir kantitatif sıralama kütüphaneleri izin verir. Biz giriş RNA'nın çoklu titrasyonlarını yaptık ve önceki metodoloji (veriler gösterilmemiştir) 1-8 mikrogram aralığında toplam RNA tutarlar için en uygun olduğu sonucuna varmışlardır. 10-500 ng aralığında miktarlarda kullanıldığı zaman, okuma alanının büyük bir kısmı adaptörü konkatamerler ve RNA ligaz saflaştırılır başka bakteriyel diziler tarafından tüketilir. Ancak, düşük sayı okur olsa aynı yüksek giriş örneklerinin kıyasla mevcut mıR türler, hala gerçek tutarları yansıtıcı olan bu düşük giriş deneylerde fazlalaştı. Için, toplam RNA örneklerinden gözlenen mıR profilleri, gerçek bir yansıması olmasını sağlamak içinve farklı örnekleri çapraz incelenmesini sağlamak için miktarlar, rutin üç sentetik kalibratör RNA'ların 12, 10 misli dilüsyonları bulunmaktadır. 0.01: farklı bir kalibratör RNA'ların 0,001 pmol yararlı elde tahlilin kantitatif tabiatının teyit için numara okur Biz 0.1 dahil olduğunu bulduk.
Şekil 1 (yıldız bakınız) de belirtildiği gibi olan sentetik oligonükleotidlerin sık sipariş dizisinden boyutu farklı olan anormal molekülü ihtiva ederler. Bu ürünler miRNA-3 ile birlikte arındırmak mümkün iseniz Mth PCP aşağıdaki bağlayıcı 'bağlayıcı melez, o PAGE için gerekli 3 arındırmak olabilir'. Bu negatif kontrol örneklerinde gözlemlenen spesifik olmayan PCR ürününün miktarını azaltmak için yararlı olduğu bulundu.
Yukarıda tarif edilen metodoloji MiRNA kütüphaneleri 2 kantitatif hazırlanması için ölçüt olarak alındı, ancak tam olarak bu uygulama hali hazırda olduğu tahminhem de daha genel prosedürlere licable; yani RNA-seq ve CLIP-Dizi (Çapraz Link Immuno-Yağış) kütüphane hazırlanması. Aslında, daha önce yayınlanmış olan raporlarda 13 sağlam bir kütüphane, PCR nispetle sonuçlanan deneyler-Dizi CLIP önceki metodoloji aynı ilkeler bir kullanmışlardır (veriler gösterilmemiştir). Serum miRNA'ların tıbbi bir tanı aracı olarak çekiş kazanmak Son olarak, biz önceki metodoloji en sağlam ve güvenilir miRNA biyobelirteçlerinin belirlenmesinde büyük ölçüde yardımcı olacağını tahmin ediyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3' Linker (5' phosphorylated, 3' blocked) | Integrated DNA Technologies | custom | |
| 5' Linker | Integrated DNA Technologies | custom | 5' blocked, HPLC purified |
| T4RNL2 (1-249 K227Q) | New England Biolabs | M0351S | Specialized for ligation of pre-adenylated DNA adapters |
| 10x Ligation buffer (without ATP) | New England Biolabs | Included with M0351S | |
| 10x Ligation buffer (with ATP) | New England Biolabs | Included with M0204L | |
| RNaseOUT | Invitrogen | 10777-019 | |
| Polyethylene glycol (mol. Wt. 8,000) | New England Biolabs | Included with M0204L | |
| Nuclease-free water | Ambion | AM9937 | We have found water collected from a distillation apparatus to be of equvalent quality. |
| T4RNL1 | New England Biolabs | M0204L | |
| Superscript III RT kit | Invitrogen | 18080-051 | |
| Phusion PCR kit | New England Biolabs | M0530S | |
| Illumina RP1 primer | Integrated DNA Technologies | custom | Sequence information available from Illumina |
| Illumina RT primer | Integrated DNA Technologies | custom | Sequence information available from Illumina |
| Illumina index primer(s) | Integrated DNA Technologies | custom | Sequence information available from Illumina |
| 40% Acrylamide | Fisher Scientific | BP14081 | |
| Urea | Sigma Aldrich | U6504 | |
| Ammonium persulfate | Sigma Aldrich | A3678 | |
| Tetramethyethylenediamine (TEMED) | Sigma Aldrich | T9281 | |
| 2x Denaturing RNA loading buffer | New England Biolabs | Included with M0351S | |
| Razor blades | VWR | 55411-050 | |
| SpinX Centricon tubes | Costar | CLS8161 | |
| Low retention microfuge tubes | Fisher Scientific | 02-681-320 | |
| Sybr Gold | Invitrogen | S-11494 | |
| Adenylation kit | New England Biolabs | E2610L |
References
- Hafner, M., et al. RNA-ligase-dependent biases in miRNA representation in deep-sequenced small RNA cDNA libraries. RNA. 17 (9), 1697-1712 (2011).
- Zhang, Z., Lee, J. E., Riemondy, K., Anderson, E. M., Yi, R. High-efficiency RNA cloning enables accurate quantification of miRNA expression by deep sequencing. Genome Biology. 14 (10), 109 (2013).
- Consortium, T. E. P. The ENCODE (ENCyclopedia Of DNA Elements) Project. Science. 306 (5696), 636-640 (2004).
- Consortium, T. E. P. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).
- Linsen, S. E. V., et al. Limitations and possibilities of small RNA digital gene expression profiling. Nature Methods. 6 (7), 474-476 (2009).
- Jayaprakash, A. D., Jabado, O., Brown, B. D., Sachidanandam, R. Identification and remediation of biases in the activity of RNA ligases in small-RNA deep sequencing. Nucleic Acids Research. 39 (21), 141 (2011).
- McLaughlin, L. W., Romaniuk, E., Romaniuk, P. J., Neilson, T. The Effect of Acceptor Oligoribonucleotide Sequence on the T4 RNA Ligase Reaction. European Journal of Biochemistry. 125 (3), 639-643 (1982).
- Zhuang, F., Fuchs, R. T., Sun, Z., Zheng, Y., Robb, G. B. Structural bias in T4 RNA ligase-mediated 3′-adapter ligation. Nucleic Acids Research. 40 (7), 54 (2012).
- Harrison, B., Zimmerman, S. B. Polymer-stimulated ligation: enhanced ligation of oligo- and polynucleotides by T4 RNA ligase in polymer solutions. Nucleic Acids Research. 12 (21), 8235-8251 (1984).
- Torchia, C., Takagi, Y., Ho, C. K. Archaeal RNA ligase is a homodimeric protein that catalyzes intramolecular ligation of single-stranded RNA and DNA. Nucleic Acids Research. 36 (19), 6218-6227 (2008).
- Lau, N. C., Lim, L. P., Weinstein, E. G., Bartel, D. P. An Abundant Class of Tiny RNAs with Probable Regulatory Roles in Caenorhabditis elegans. Science. 294 (5543), 858-862 (2001).
- Yi, R., et al. DGCR8-dependent microRNA biogenesis is essential for skin development. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (2), 498-502 (2009).
- Leung, A. K. L., et al. Genome-wide identification of Ago2 binding sites from mouse embryonic stem cells with and without mature microRNAs. Nature Structural & Molecular Biology. 18 (2), 237-244 (2011).
