Abstract
Mirna klonen en high-throughput sequencing, genaamd miR-Seq, staat alleen als een transcriptome-brede benadering van miRNAs met single nucleotide resolutie kwantificeren. Deze techniek vangt miRNAs door aan 3 'en 5' oligonucleotide adapters miRNA moleculen en maakt de novo miRNA ontdekking. Koppeling met krachtige next-generation sequencing platforms, heeft miR-Seq instrumenteel in de studie van miRNA biologie geweest. Echter, belangrijke vooroordelen geïntroduceerd door oligonucleotideligatie stappen hebben verhinderd miR-Seq wordt gehanteerd als een nauwkeurige kwantificering tool. Eerdere studies tonen aan dat biases in de huidige miR-Seq methoden leiden vaak tot onnauwkeurige miRNA kwantificering met fouten tot 1.000-voudig voor sommige miRNAs 1,2. Om deze vertekeningen verleend door RNA ligatie lossen, hebben we een kleine RNA ligatie werkwijze die leidt tot ligatie efficiëntie van meer dan 95% voor zowel de 3 'en 5' ligatiestappen ontwikkeld. Benchmarking deze imbleek bibliotheek bouwmethode met equimolair of verschillend gemengde synthetische miRNAs consequent levert leest getallen minder dan tweevoudige afwijking van de verwachte waarde. Verder is deze high-efficiency miR-Seq methode maakt nauwkeurige genoom-brede miRNA profilering van in vivo totaal RNA monsters 2.
Introduction
High-throughput sequencing-gebaseerde methoden zijn op grote schaal toegepast voor vele biologische monsters laatste jaren enorm uitbreiden ons begrip van de moleculaire complexiteit van biologische systemen 3,4. Echter, het maken van RNA-monsters voor high-throughput sequencing schenkt vaak specifieke biases die inherent zijn aan de gebruikte methoden, het beperken van de potentiële nut van deze krachtige technieken. Deze methode specifieke vooroordelen zijn goed gedocumenteerd voor-ligatie is op kleine RNA bibliotheek voorbereidingen 1,2,5,6. Deze vooroordelen resulteren in 1.000-voudige variatie in leest nummers voor equimoleculaire synthetische miRNAs, waardoor gevolgtrekking van miRNA overvloed van sequencing data wild variabele en foutgevoelig.
Studies gericht op de eigenschappen van faag afgeleide T4 RNA ligasen hebben aangetoond dat de enzymen vertonen nucleotide gebaseerde voorkeuren 7, die zoals bevooroordeeld bibliotheken in high-throughput sequencing experimenten manifesteren
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
LET OP: Het is cruciaal om RNase vrije omstandigheden te handhaven gedurende de gehele procedure.
1. adenylatie van 3 "Linker
- Verdun DNA-oligonucleotide ontworpen om 3 'ligatiereacties 100 uM in nuclease-vrij H2O
Opmerking: Het oligonucleotide moet 5 'fosfaatgroep, een gerandomiseerde dinucleotide aan het 5' uiteinde en een 3 'dideoxycytosine hebben. De 5 'fosfaatgroep is een vereiste van de Mth enzym efficiënt 5' adenylatie 10. Het fosfaat kan worden toegevoegd door voorbehandeling van het oligonucleotide met een polynucleotide kinase of besteld met de modificatie direct. De gerandomiseerde dinucleotide aan het 5 'is belangrijk voor het minimaliseren van de sequentie die RNA ligasen voorkeur vertonen voor bepaalde end-end verbinden reacties over anderen 6. De 3 'dideoxycytosine plaatst een blokkeerelement op het 3' uiteinde van het oligonucleotide to remmen de vorming van linker-linker concatameren tijdens volgende ligatiestappen en dient ook om het 3 'uiteinde van het miRNA-Linker molecuul gevormd aan het einde van de 3' ligatiereactie 11 blokkeren. De oligonucleotide linkersequentie gekozen voor onpartijdige miR-Seq is als volgt: 5'PO 4 NNTGGAATTCTCGGGTGCCAAGG-dideoxyC3. - Monteer de volgende reactie adenylatie: 200 pmol 3 'linker oligonucleotide, 4 pi 10 x 5' DNA adenylatie buffer, 4 pi 1 mM ATP, 4 pl Mth RNA ligase, nuclease-vrij H2O tot een eindvolume van 40 pi.
- Incubeer reactie bij 65 ° C gedurende 1 uur. Beëindig de reactie door verwarmen tot 85 ° C gedurende 5 min.
- Precipiteren geadenyleerde linker door toevoeging van 2,5 volumes 100% ethanol en 1/3 volume 10 M ammoniumacetaat resterende ATP te verwijderen en onverwachte ligaties voortaan reacties te voorkomen.
- Kort, meng de alcohol, zout en oligo oplossing tot homogeen, draaien op volle snelheid in een microcentrifuge (~ 15.000 xg) bij 4 ° C gedurende 20 min. Was de pellet in 70% ethanol, lucht drogen, en resuspendeer in de juiste hoeveelheid nuclease-vrij H2O 50-100 uM geadenyleerde oligo opleveren.
- Bevestig adenylerings door uitvoeren van 18% polyacrylamidegel.
- Bereid de gel door menging van de volgende: 6,3 g ureum, 6,75 ml van 40% acrylamide en 1,5 ml van 10x TBE. H Voeg 2 O tot 15 ml.
- Meng tot ureum volledig is opgelost en voeg 150 pl 10% (w / v) ammoniumpersulfaat (APS) en 15 pl tetramethlyethylenediamine (TEMED).
- Zodra gel heeft ingesteld, pre-run voor 30 min bij 24 V / cm gel breedte met 1x TBE lopende buffer bij kamertemperatuur. Zodra 30 min is up flush waterputten met stromend buffer.
- Meng 5 pmol van geadenyleerde oligonucleotiden met en gelijk volume 2x denaturerende RNA laadbuffer (95% (v / v) formamide,0,02% (w / v) SDS, 0,02% broomfenolblauw (w / v), 0,01% (w / v) xyleencyanol, 1,0 mM EDTA), warmte kort naar 75 ° C en snap gekoeld op ijs. Pipetteer gehele monster in de put van de gel. Ook een identieke hoeveelheid niet-geadenyleerde controle en lage moleculair gewicht standaarden grootte.
- Voer de gel bij 24 V / cm tot de broomfenolblauw is ¾ van de weg naar de bodem van de gel. Demonteer apparaten, post-vlek gel met 1x SYBR-goud oplossing in 1x TBE en visualiseren op UV-transilluminator doos (Figuur 2).
OPMERKING: Gel zuiveren geadenyleerde oligo op een wijze overeenkomstig aan die boven beschreven als "geen invoer RNA" controle resulteren in een grote hoeveelheid PCR-product vergeleken met monsters met input RNA.
2. Linker Ligatie 3 'einde van miRNA
- 3 "Ligatie
- Monteer de volgende componenten op ijs in de genoemde volgorde: 1,0 ul 50% (w / v) PEG 8000, 0,5 &# 956; l 10x RNA ligase buffer (500 mM Tris-HCl pH 7,5, 100 mM MgCl2, 10 mM DTT), 1,0 pl geadenyleerd 3'Linker (100 uM), 0,5 ui RNase inhibitor, 0.5-8.0 ug totaal RNA, 0,5 pl T4 RNA ligase 2, nuclease-vrij H2O tot een eindvolume van 5 ul.
- Meng de reactie door pipetteren de oplossing te viskeus om vortex vanwege de hoge concentratie van PEG 8000. Na grondig gemengd, zet de reactie in een thermocycler met een verwarmd deksel. Stel het blok tot 16 ° C en incubeer gedurende 4 uur.
OPMERKING: De reactie kan worden opgeschaald tot een eindvolume van 20 pl zonder verlies van ligatie efficiëntie. Reageren gedurende 4 uur bij kamertemperatuur of overnacht bij 4 ° C in wezen identieke ligatie efficiëntie opleveren.
- Gel Purification
- Na 3 'ligatie, meng de reactie met een gelijk volume van 2x RNA laadbuffer. Verwarm tot 70 ° C gedurende 5 min, en snap afkoelen op ijs. Laat het monster op een 15% polyacrylamide gel voor PAGE zuivering.
- Bereid een 15% polyacrylamide gel die 7 M ureum, in een zelfde wijze als eerder beschreven in stap 1.5.
- Voorlooptijd de gel bij 24 V / cm gel breedte ten minste 30 min. Schakel de stroomvoorziening, flush putten, load monster en run gel op dezelfde spanning als pre-run.
- Laad het monster en draaien de PAGE totdat de broomfenolblauw net heeft verlaten de gel. Het gewenste product migreert nabij de xyleencyanol.
- Na 3 'ligatie, meng de reactie met een gelijk volume van 2x RNA laadbuffer. Verwarm tot 70 ° C gedurende 5 min, en snap afkoelen op ijs. Laat het monster op een 15% polyacrylamide gel voor PAGE zuivering.
- Vlekken, Visualisatie, en Excisie
- Demonteer gel apparaten en plaats gel in een schone bak met 1x lopende buffer (TBE), 1x SYBR-goud, en rock voor 15 min.
- Verwijder gel tegen vlekken schotel en visualiseren op UV transilluminator doos bedekt met schone plastic wrap. Het ligatieproduct moet ongeveer 45 nucleotiden lang.
- Accijnzen het gebied dat de ligatieproduct met een schone Razor mes en plaats in 0,5 ml micro-centrifugebuis.
- Product Isolatie en neerslag
- Pierce bodem van 0,5 ml microcentrifugebuis met een 30 G naald en zet de doorboorde buis in een tweede schone, lage retentie, 1,5 ml microcentrifugebuis. Centrifugeer gedurende 5 minuten bij ~ 15.000 x g.
- Visueel bevestigen dat de gehele gel slice is verplaatst door het gat in de binnenband. Gebruik indien nodig een schone pipet tip om wat gelfragmenten dichter bij het gat te duwen.
- Gooi de lege buis van 0,5 ml en voeg 400 ul hoge zoutconcentratie kolom buffer (HSCB 400 mM NaCl, 25 mM Tris-HCl pH 7,5, 0,1% SDS) aan de acrylamide slurry. Rock tube (s) bij 4 ° C gedurende de nacht.
- Transfer slurry naar een 0,22 micron celluloseacetaat spin-kolom met een wide-bore pipet tip. Centrifugeer gedurende 3 min bij kamertemperatuur ~ 15.000 xg verzamelen alle vloeistof verwijderd van acrylamide gel matrix.
- Breng de vloeistof aan een schone, lage retentie, 1,5 ml tube bevattening 1 ui van 20 mg / ml glycogeen. Voeg een gelijk volume isopropanol en 1/10 volume natriumacetaat. Meng de oplossing door het buisje meerdere malen en neerslaan in -80 ° C vriezer gedurende 20 minuten.
- Centrifugeer bij volle snelheid bij 4 ° C gedurende 20 min aan het nucleïnezuur pellet. Verwijder supernatant en was in 70% ethanol. Drogen pellet gedurende 10 min bij kamertemperatuur en direct verder naar 5 'ligatiestap.
3. Linker Ligatie tot 5 'einde van miRNA-3' Linker Hybrid
- Om pellets nucleïnezuur, voeg de volgende componenten: 2 pl PEG 8000 (50% w / v), 0,5 gl 10x RNA Ligase buffer, 0,5 ul ATP (10 mM) 0,5 pl NN-RNA oligo (100 uM) en H 2 O tot een eindvolume van 4 pl.
OPMERKING: De samenstelling van de "NN-RNA- oligo 'is als volgt 5'-geïnverteerde dideoxy-TCUACAGUCCGACGAUCNN3 en werd via HPLC gezuiverd door de fabrikant. - Vermengendit monster door pipetteren en herhaaldelijk naar beneden. Doe dit enige tijd (tot 5 min) dat de pellet is volledig opnieuw opgelost. Als opnieuw oplosbaar is problematisch, verwarmen het monster kort (3-5 min) tot 37 ° C en opnieuw pipetteren te mengen.
- Nadat de pellet terug in oplossing, breng de inhoud ervan een schone PCR buis die 1 ui van een 1: 1 mengsel van RNase inhibitor en T4 RNA-ligase 1 (5 eenheden). Opnieuw meng door en neer te pipetteren.
- Incubeer de reactie in een thermische cycler bij 37 ° C gedurende 4 uur. Onmiddellijk overgaan tot cDNA synthese.
4. reverse transcriptie / cDNA Synthesis
- Voeg de volgende componenten aan de 5 'ligatiereactie: 2 pl 5x RT-buffer, 0,75 pl 100 mM DTT, 1 ui Illumina RT primer 5'-GCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3' (1 uM), en 0,5 pl dNTPs (10 mM).
- Meng door pipetteren en verhit tot 65 ° C gedurende 5 min. Vervolgens langzaam afkoelen op de bank top.
- Zodra reactie afgekoeld tot kamertemperatuur, plaats buis op ijs en voeg 0,5 pl elk van reverse transcriptase enzym en RNase inhibitor. Meng door pipetteren en plaats thermische cycler voor het uitrekstap aangegeven in de instructies van de fabrikant.
- Eenmaal voltooid add 5 ul nuclease-vrij H2O het eindvolume van het cDNA tot 15 pi te brengen.
5. Bibliotheek Voorbereiding
- Voor de indexering PCR, assembleren de volgende reactie op ijs: 6 pl 5x Phusion buffer, 1 ul dNTP (10 mM), 0,9 pl DMSO, 0,75 pl 5 'primer (25 uM), 0,75 pl 3' primer (25 uM), 3 pl cDNA-bibliotheek (variabele concentratie, afhankelijk van de hoeveelheid van de input), 0,5 gl Phusion polymerase (1 eenheid), nuclease-vrij H2O tot een eindvolume van 30 ui. Kies de primer sequenties voor gegarandeerde compatibiliteit met de template en de sequencing platform vankeuze.
- Voer de PCR reactie met de volgende instellingen: initiële denaturatie bij 98 ° C gedurende 3 min, gedurende de eerste 4 cycli denaturatie 98 ° C gedurende 15 seconden, annealen bij 50 ° C gedurende 15 seconden, verlengen bij 72 ° C gedurende 15 sec .
OPMERKING: Afhankelijk van de hoeveelheid van het uitgangsmateriaal, variëren de totale PCR cyclus nummers. Kenmerkend voor een ingang van 1-2 ug totaal RNA, 13 totaal PCR cycli voldoende om de miR-Seq bibliotheek genereren. - Voer de volgende cycli, bijvoorbeeld cycli 5-12, in een tweestaps wijze waarbij de annealing en extensie cycli worden gecombineerd en bij 70 ° C gedurende 30 sec en de denaturatie weer 98 ° C gedurende 15 sec.
Opmerking: Het reactievolume is 30 ui toestaan pauzeren het PCR-programma en verwijderen van een 10 pl aliquot op vooraf bepaalde cyclus nummers te controleren op het uiterlijk van het gewenste product. Typisch cycli 10, 13 en 16 zijn gekozen voor het testen van een totaal RNA-monster.
- Voer de PCR reactie met de volgende instellingen: initiële denaturatie bij 98 ° C gedurende 3 min, gedurende de eerste 4 cycli denaturatie 98 ° C gedurende 15 seconden, annealen bij 50 ° C gedurende 15 seconden, verlengen bij 72 ° C gedurende 15 sec .
- Bereideneen 8% niet-denaturerende acrylamide gel door het mengen van 2 ml 40% acrylamide, 1 ml van 10x TBE, en H2O tot 10 ml. Voeg vervolgens 100 pl 10% APS en 10 ui TEMED. Giet gel en laat set.
- Pre-run de gel bij 12 V / cm gel breedte voor 30 min. Flush putten. Voeg 1 pl 10x laadbuffer (15% Ficoll-400, 66 mM EDTA, 20 mM Tris-HCl pH 8,0, 0,1% (w / v) SDS, 0,01% (w / v) broomfenolblauw), voeg 10 ul monster aan elk putje van afmetingen 5 mm x 1 mm x 15 mm. Meestal kan elke well maximaal 30 ui monsters. Laat het monster gel bij 10 V / cm breedte gel in 1x TBE buffer totdat de broomfenolblauw kleurstof loopt net uit de bodem van de gel.
- Vlekken en visualiseren gel zoals beschreven in stap 2.3.
- Accijnzen de 146 basenparen band en elueren overnachting in 0,25 ml van HSCB op een manier vergelijkbaar met wat is beschreven in paragraaf 2.4. Precipiteren DNA in een gelijk volume isopropanol en 1/10 volume natriumacetaat. Was de pellet in 70% ethanol en resuspendeer in TE buffer.
- Kwantificeren bibliotheek met picogreen volgens de aanbevelingen van de fabrikant.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De verwachte resultaten voor de bovenstaande methode dient echter aanvankelijk waarneming van een enkel nucleotide verandering (toename) van de omvang van de DNA oligonucleotide die aan adenylatie van Mth RNA ligase was (Figuur 2). Na 3 'ligatie visualisatie van de acrylamide gel aangeeft (zie figuur 3) scherp hoogmoleculaire banden zichtbaar in de 100-300 nucleotide gebied van de gel. Dit betekent dat de totale RNA-monster gebruikt van hoge kwaliteit (niet afgebroken). Ten tweede moet men een zeer helder signaal op de 25 nucleotide gebied van de gel, die overmaat, geligeerde 3 'linker observeren. Het kan ook nuttig zijn om een geen input RNA in de 3'-ligatie wordt geregistreerd. Dit zal de zuiverheid van het 3 'linker geven, en ook door de PCR stap uitgevoerd voor indicatie van het aantal cycli bij niet- specifiek signaal problematisch. Er is geen diagnostische de 5 'ligatieEchter in figuur 4 is een reactie gelijk aan die beschreven met radioactief gemerkt RNA uitgevoerd waarin het belang van de hoge concentratie van PEG8000 toegepast aangeeft. Tenslotte, na de PCR en natieve PAGE, een DNA-product van 146 basenparen overeenkomstig de omvang van de adaptersequenties, een miRNA insert en extra sequentie uit de uitgebreide PCR-primers kunnen worden waargenomen. Het is belangrijk op te merken dat wanneer het juiste aantal PCR-cycli (die empirisch bepaald) wordt overschreden, kan geen miRNA inzetstuk product de gewenste amplicongrootte verhullen. Getoond in figuur 5 is een resultaat van 5 pmol synthetische miRNA, typisch 2 ug totaal RNA 13-18 PCR cycli nodig.
Figuur 1. Schematische voorstelling van de workflow voor de 2-step ligatie kleine RNA-bibliotheek voorbereiding. Shown zijn algemene stappen voor het opstellen van een onbevooroordeelde miR-Seq bibliotheek. Zwart weergegeven is 3 'DNA ligatie adapter die via adenylatie wordt geactiveerd in stap 1, wordt miRNA getoond in groen en geligeerd aan de 3'-adapter in stap 2, en 5' RNA ligatie adapter in blauw dat is geligeerd aan het chimeer molecuul in stap 3 genummerde stappen worden in detail beschreven in de sectie protocol cursief aangegeven enzymatische stappen.
Figuur 2. adenylatie van 3 '. Linker met Mth RNA-ligase 18% PAGE-gel van ureum adenylatie van DNA oligonucleotide te gebruiken voor daaropvolgende 3' ligatiereactie (+) geeft aan dat monster werd geïncubeerd met Mth RNA ligase (- ) geeft monster geïncubeerd zonder enzym, en (m) geeft de grootte normen (nummers getoond eent recht baseparen). Links staat een schema van de oligonucleotide aanwezige soorten. Sterretje geeft grotere DNA-producten gegenereerd door afwijkende oligonucleotidesynthese.
Figuur 3. 3 "Ligatie van Synthetische Totaal RNA monsters. A) 15% PAGE-gel van Urea 3 'ligatiereacties, (m) geeft grootte standaarden (nummers links geven baseparen), (geen RNA) geeft een reactie zonder ingangssignaal RNA en 3' linker die niet werd gel gezuiverd (+) geeft ligatie uitgevoerd met 5 pmol synthetische miRNA en een 3'linker die gel gezuiverd was, (2 en 1 ug) de omvang van muis totaal RNA onderworpen aan 3 'ligatie met dezelfde, gel gezuiverd linker , sterretje geeft overtollige 3 'linker B.) Autoradiogram van soortgelijke 3' ligeringsreactie uitgevoerd met P 32 5'-uiteinde gemerkte synthetische miRNA. Nummer boven geeft de tijd (uur) de reactie liet men, en onderaan aangeeft hoeveel geligeerd als een percentage van de som van geligeerde en geligeerd.
Figuur 4. 5 "Ligatie van radio-gelabelde miRNA-3'Linker Hybrid. Autoradiogram van 5 'ligatiereactie uitgevoerd met P 32 5' uiteinde gemerkte synthetische miRNA-3 'linker hybride. Nummer boven aangegeven hoeveelheid PEG gebruikt in de reactie, en het aantal onderaan aangeeft hoeveel geligeerd als een percentage van de som van geligeerde en geligeerd. Lijnen links is een schema van de geligeerde moleculen waar miRNA in groen, 5 'en 3 "adapters zijn blauw en zwart respectievelijk.
Pbelasting / 52095 / 52095fig5highres.jpg "/>
Figuur 5. PCR-afgeleide kleine RNA-DNA-bibliotheek. 8% Inheemse PAGE van PCR-producten gegenereerd uit miR-Seq ligatie procedure. Getallen boven wijzen cycli van PCR, getallen aan de zijkant geven de standaards moleculaire grootte. Elk DNA soorten uit de PCR geïdentificeerd rechts. Rasterpatroon is te wijten aan auto-fluorescentie van specimen gerecht.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De hierin beschreven werkwijze maakt gebruik van een aantal belangrijke variabelen ligatie efficiëntie, namelijk hoge concentraties PEG gebruik van gerandomiseerde linkers en hoge concentratie van linkers 2,6,9 maximaliseren. Deze aanpak maakt het mogelijk op een betrouwbare kwantitatieve sequencing bibliotheken uit totaal RNA monsters 2. We hebben meerdere titraties input RNA uitgevoerd en hebben geconcludeerd dat de voorgaande werkwijze is het meest geschikt voor totale RNA bedragen in het bereik 1-8 ug (data niet getoond). Wanneer bedragen in het bereik 10-500 ng gebruikt, wordt een meerderheid van de gelezen ruimte verbruikt door adapter concatameren en bacteriële sequenties waaraan de RNA ligasen worden gezuiverd. Echter, het is vermeldenswaard in deze lage input experimenten die de miR soorten die aanwezig zijn, hoewel laag in leest getal, zijn nog steeds een afspiegeling is van werkelijke bedragen in vergelijking met identieke hogere inkoopkosten monsters. Om te waarborgen dat de miR profielen waargenomen uit totaal RNA monsters reflecterende feitelijkebedragen, en aan een kruisverhoor van verschillende monsters toe, we routinematig zijn inclusief 10-voudige verdunningen van drie synthetische kalibrator RNA's 12. We hebben gevonden dat de opname van 0.1: 0.01: 0.001 pmol afzonderlijke calibrator RNA opbrengst nuttig leest nummers voor bevestiging van de kwantitatieve aard van de test.
Zoals in figuur 1 (zie sterretje) synthetische oligonucleotiden bevatten vaak afwijkende moleculen die verschillen in grootte van de sequentie besteld. Als deze producten zijn in staat om samen te zuiveren met de miRNA-3 'linker hybride, dan kan het nodig zijn om PAGE te zuiveren van de 3' linker volgende Mth adenylering. We hebben gemerkt dat dit nuttig voor het verminderen van de hoeveelheid niet-specifieke PCR-producten waargenomen in negatieve controle monsters.
Hoewel de hierboven beschreven methode werd vergeleken voor kwantitatieve voorbereiding van miRNA bibliotheken 2, we volledig verwachten dat het is gemakkelijk applicable om meer algemene procedures ook; namelijk RNA-seq en CLIP-Seq (Cross Link Immuno-Neerslag) bibliotheek voorbereiding. In feite hebben we werkzaam aantal van dezelfde principes van de voorgaande methode experimenten resulteert in robuuste bibliotheek PCR ten opzichte van eerder gepubliceerde rapporten 13-Seq CLIP (data niet getoond). Ten slotte, zoals serum miRNAs krijgen tractie als een medisch diagnostisch instrument, verwachten we de vorige methodologie sterk zal helpen bij de identificatie van de meest robuuste en betrouwbare miRNA biomerkers.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3' Linker (5' phosphorylated, 3' blocked) | Integrated DNA Technologies | custom | |
| 5' Linker | Integrated DNA Technologies | custom | 5' blocked, HPLC purified |
| T4RNL2 (1-249 K227Q) | New England Biolabs | M0351S | Specialized for ligation of pre-adenylated DNA adapters |
| 10x Ligation buffer (without ATP) | New England Biolabs | Included with M0351S | |
| 10x Ligation buffer (with ATP) | New England Biolabs | Included with M0204L | |
| RNaseOUT | Invitrogen | 10777-019 | |
| Polyethylene glycol (mol. Wt. 8,000) | New England Biolabs | Included with M0204L | |
| Nuclease-free water | Ambion | AM9937 | We have found water collected from a distillation apparatus to be of equvalent quality. |
| T4RNL1 | New England Biolabs | M0204L | |
| Superscript III RT kit | Invitrogen | 18080-051 | |
| Phusion PCR kit | New England Biolabs | M0530S | |
| Illumina RP1 primer | Integrated DNA Technologies | custom | Sequence information available from Illumina |
| Illumina RT primer | Integrated DNA Technologies | custom | Sequence information available from Illumina |
| Illumina index primer(s) | Integrated DNA Technologies | custom | Sequence information available from Illumina |
| 40% Acrylamide | Fisher Scientific | BP14081 | |
| Urea | Sigma Aldrich | U6504 | |
| Ammonium persulfate | Sigma Aldrich | A3678 | |
| Tetramethyethylenediamine (TEMED) | Sigma Aldrich | T9281 | |
| 2x Denaturing RNA loading buffer | New England Biolabs | Included with M0351S | |
| Razor blades | VWR | 55411-050 | |
| SpinX Centricon tubes | Costar | CLS8161 | |
| Low retention microfuge tubes | Fisher Scientific | 02-681-320 | |
| Sybr Gold | Invitrogen | S-11494 | |
| Adenylation kit | New England Biolabs | E2610L |
References
- Hafner, M., et al. RNA-ligase-dependent biases in miRNA representation in deep-sequenced small RNA cDNA libraries. RNA. 17 (9), 1697-1712 (2011).
- Zhang, Z., Lee, J. E., Riemondy, K., Anderson, E. M., Yi, R. High-efficiency RNA cloning enables accurate quantification of miRNA expression by deep sequencing. Genome Biology. 14 (10), 109 (2013).
- Consortium, T. E. P. The ENCODE (ENCyclopedia Of DNA Elements) Project. Science. 306 (5696), 636-640 (2004).
- Consortium, T. E. P. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).
- Linsen, S. E. V., et al. Limitations and possibilities of small RNA digital gene expression profiling. Nature Methods. 6 (7), 474-476 (2009).
- Jayaprakash, A. D., Jabado, O., Brown, B. D., Sachidanandam, R. Identification and remediation of biases in the activity of RNA ligases in small-RNA deep sequencing. Nucleic Acids Research. 39 (21), 141 (2011).
- McLaughlin, L. W., Romaniuk, E., Romaniuk, P. J., Neilson, T. The Effect of Acceptor Oligoribonucleotide Sequence on the T4 RNA Ligase Reaction. European Journal of Biochemistry. 125 (3), 639-643 (1982).
- Zhuang, F., Fuchs, R. T., Sun, Z., Zheng, Y., Robb, G. B. Structural bias in T4 RNA ligase-mediated 3′-adapter ligation. Nucleic Acids Research. 40 (7), 54 (2012).
- Harrison, B., Zimmerman, S. B. Polymer-stimulated ligation: enhanced ligation of oligo- and polynucleotides by T4 RNA ligase in polymer solutions. Nucleic Acids Research. 12 (21), 8235-8251 (1984).
- Torchia, C., Takagi, Y., Ho, C. K. Archaeal RNA ligase is a homodimeric protein that catalyzes intramolecular ligation of single-stranded RNA and DNA. Nucleic Acids Research. 36 (19), 6218-6227 (2008).
- Lau, N. C., Lim, L. P., Weinstein, E. G., Bartel, D. P. An Abundant Class of Tiny RNAs with Probable Regulatory Roles in Caenorhabditis elegans. Science. 294 (5543), 858-862 (2001).
- Yi, R., et al. DGCR8-dependent microRNA biogenesis is essential for skin development. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (2), 498-502 (2009).
- Leung, A. K. L., et al. Genome-wide identification of Ago2 binding sites from mouse embryonic stem cells with and without mature microRNAs. Nature Structural & Molecular Biology. 18 (2), 237-244 (2011).
