Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

تحديد مواقع التفاعل البروتين البروتين عن طريق الببتيد صفائف

Published: November 18, 2014 doi: 10.3791/52097
Automatic Translation
1, 1, 1
1Institute of Chemistry, The Hebrew University of Jerusalem

Abstract

البروتين البروتين التفاعلات توسط معظم العمليات في الخلية والسيطرة التوازن الحية للكائن الحي. تفاعلات البروتين ضعف قد يؤدي إلى المرض، مما يجعل تفاعلات البروتين أهداف هامة المخدرات. وبالتالي فمن المهم جدا لفهم هذه التفاعلات على المستوى الجزيئي. يتم دراسة التفاعلات البروتينية باستخدام مجموعة متنوعة من التقنيات التي تتراوح بين المقايسات الخلوية والكيموحيوية لفحوصات الفيزيائية الحيوية الكمية، وهذه يمكن أن يؤديها إما مع البروتينات كامل طول، مع مجالات البروتين أو مع الببتيدات. الببتيدات تخدم أدوات ممتازة لدراسة تفاعلات البروتين منذ الببتيدات يمكن تصنيعه بسهولة والسماح للتركيز على مواقع التفاعل محددة. صفائف الببتيد تمكن من تحديد مواقع التفاعل بين اثنين من البروتينات وكذلك الكشف عن الببتيدات التي تربط البروتين المستهدف لأغراض علاجية. أنها تسمح أيضا إنتاجية عالية دراسات ريال. لتحديد مواقع الربط، وtypiكال الببتيد عادة يحتوي على مجموعة متداخلة جزئيا 10-20 بقايا الببتيدات المستمدة من سلاسل كاملة من واحد أو أكثر من البروتينات شريك من البروتين الهدف المنشود. فحص مجموعة للربط البروتين المستهدف يكشف عن الببتيدات ملزمة، المقابلة لمواقع الربط في البروتينات شريك، في وسيلة سهلة وسريعة فقط باستخدام كمية صغيرة من البروتين.

في هذه المقالة وصفنا بروتوكولا لفحص صفائف الببتيد لرسم خرائط مواقع التفاعل بين البروتين المستهدفة وشركائها. تم تصميم مجموعة الببتيد على أساس تسلسل البروتينات شريك مع مراعاة الهياكل الثانوية الخاصة بهم. كانت المصفوفات المستخدمة في هذا البروتوكول صفائف Celluspots بواسطة INTAVIS الآلات Bioanalytical إعدادها. تم حظر مجموعة لمنع غير محددة ملزمة ثم حضنت مع البروتين دراستها. الكشف باستخدام الأجسام المضادة يكشف الببتيدات ملزم المقابلة لمواقع محددة تفاعل بين البروتينات.

Introduction

البروتين البروتين التفاعلات توسط معظم العمليات في الخلية الحية. تفاعلات البروتين ضعف قد يؤدي إلى المرض، مما يجعل تفاعلات البروتين أهداف هامة المخدرات. وبالتالي فمن المهم جدا لفهم هذه التفاعلات على المستوى الجزيئي. يتم دراسة التفاعلات البروتينية باستخدام مجموعة متنوعة من التقنيات التي تتراوح بين المقايسات الخلوية والكيموحيوية لفحوصات الفيزيائية الحيوية الكمية، وهذه يمكن أن يؤديها إما مع البروتينات كامل طول، مع مجالات البروتين أو مع الببتيدات. الببتيدات تخدم أدوات ممتازة لدراسة تفاعلات البروتين. هذا لأن الببتيدات يمكن توليفها بسهولة وتسمح بالتركيز على موقع التفاعل معين من جهة، وعلى أهداف متعددة في البروتين بطريقة إنتاجية عالية على الآخر 1،2 اليد. فحص مجموعة الببتيد هو سريعة وسهلة لأداء طريقة للحصول على كمية كبيرة من البيانات حول تفاعلات البروتين المستهدف مع العديد من الشركاء في وقت قصير 3. خلافا لأساليب الكيمياء الحيوية أو الفيزيائية الحيوية الأخرى لكشف وتحليل تفاعلات البروتين البروتين، وفحص مجموعة الببتيد يتطلب تركيز منخفض جدا من البروتين ويمكن الكشف ضعيفة جدا ملزمة. صفائف الببتيد يمكن استخدامها في العديد من التطبيقات في التفاعلات الببتيد البروتين مثل رسم الخرائط من البروتين البروتين أو مواقع التفاعل مستقبلات يجند 4، واجهات هومو أو مغاير oligomerization، والأجسام المضادة التي تميز الحواتم 5، ودراسة الأنشطة الإنزيمية 6 وإنتاجية عالية بالهيكل علاقة النشاط (SAR) دراسات (7). لإجراء استعراض معمق حول فحص مجموعة الببتيد رؤية كاتز وآخرون. 4

عدة أنواع من المصفوفات الببتيد موجودة حاليا. هناك نوعان من الاستراتيجيات الصناعية الكبرى لجعل صفائف الببتيد: تركيب الببتيدات قبل إرفاقها إلى دعم قوي، أو تركيب الببتيدات مباشرة على دعم قوي، وذلك أساسا باستخدام 4،8 تقنية SPOT. الويتم تصنيعه الببتيدات على دعم قوي عادة بنسبة 9-fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc) كيمياء 8. بين مخططات الاصطناعية شيوعا هي مرفق الببتيد من خلال محطة N (على سبيل المثال، JPT صفائف pepstar 9) والتعلق الببتيد من خلال محطة C (على سبيل المثال، PEPSCAN صفائف pepchip 10، JPT صفائف pepspot 9 و INTAVIS صفائف celluspot 11) 4. الدعم القوي يمكن أن تختلف وهكذا يفعل كيمياء اقتران الببتيد إليها. يمكن تركيبها الببتيدات CYS لإنهاء الشرائح الزجاجية عبر مجموعة ثيول 12. وN محطة من الببتيد يمكن تساهميا منضما إلى مجموعة الهيدروكسيل على الغشاء السليلوز من خلال الأسترة من الأحماض الأمينية المرفقة 8.

هنا نقدم بروتوكول مفصلة لفرز المصفوفات الببتيد كوسيلة لدراسة تفاعلات البروتين البروتين. مجموعة استخدمنا هي مجموعة Celluspots، وهي مجموعة صغيرة تحتوي على عمو كبيرالاتحاد الوطني للعمال من البقع (التكرارات تصل إلى 384 نقاط) على الغشاء السليلوز صغيرة تدعمها شريحة زجاجية. وهذا يتيح العمل مع كميات منخفضة من البروتين والأجسام المضادة والحصول على كمية كبيرة من البيانات في تجربة واحدة. يحتوي هذا مجموعة أيضا كثافة عالية الببتيد الذي يسمح الكشف عن انخفاض تقارب ملزمة. واستخدمت المصفوفة لرسم خرائط التفاعل STIL-CHFR، وهو أمر مهم للغاية للسيطرة تكاثر الخلايا العادية 13. تفاعل غير المنضبط بين اثنين من البروتينات يمكن أن يؤدي إلى تطور السرطان. عن طريق تعيين هذا التفاعل وجدنا موقع ملزم محدد والمخلفات 14 ملزمة. هذا يمهد الطريق لتصميم مثبطات العقلانية التي تحول دون هذا التفاعل البروتين البروتين.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. تصميم صفيف الببتيد

  1. تقسيم تسلسل البروتين المستهدف في متداخلة جزئيا 10-20 بقايا الببتيدات. تختلف كمية التداخل على تجربة محددة وموارد مختبر الأداء، ولكن من حيث المبدأ يعد التداخل كان ذلك أفضل. عند تصميم الببتيدات تأخذ بعين الاعتبار العناصر المعروفة هيكل الثانوي في البروتين يمكن أن يكون مسؤولا عن التفاعل.
  2. تأمر مجموعة الببتيد مصممة من خلال الباعة التجارية. هنا، الببتيدات استخدام تساهميا منضمة إلى مجموعة من خلال C-المحطة.

2. حجب غير محددة وملزمة

  1. جعل حل العازلة 50 ملي تريس أو الفوسفات التي تحتوي على 0.05٪ توين 20 (TBST / PBST) والتكيف مع درجة الحموضة المطلوبة مع كمية قياسه من حمض الهيدروكلوريك أو هيدروكسيد الصوديوم (من أجل معرفة قوة الأيونية دقيقة) وقوة الأيونية المطلوب مع كلوريد الصوديوم . هنا، استخدم الرقم الهيدروجيني من 7.5 والقوة الأيونية من 150 ملم.
  2. جعل حل حجب2.5٪ (ث / ت) مسحوق الحليب منزوع الدسم في TBST / PBST.
  3. لمنع غير محددة وملزمة، تزج في مجموعة 5 مل من عرقلة الحل. احتضان مجموعة لمدة 2-4 ساعة في درجة حرارة الغرفة أو بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية على شاكر.

3. احتضان مع البروتين

  1. غسل مجموعة الأولى مع 5 مل من عرقلة الحل لمدة 30 ثانية ثم مرتين مع TBST 5 مل / PBST لمدة 5 دقائق على شاكر في درجة حرارة الغرفة.
  2. احتضان مجموعة غسلها مع 5 مل من صاحب الموسومة حل البروتين تحتوي على 2.5٪ (ث / ت) مسحوق اللبن منزوع الدسم لمنع غير محددة وملزمة. هنا، استخدام 4.5 ميكرومتر من حل البروتين (STIL 500-650) الذائب في محلول منع وصفها.
    ملاحظة: عادة 5-10 ميكرومتر البروتين وتستخدم للفحص، ولكن تركيز البروتين يمكن أن يكون حتى ما يصل الى 2-3 ميكرومتر، اعتمادا على تقارب ملزمة وتركيزات محلية من الببتيدات التي تربط على مجموعة (كفاءة التوليف). المخزن المؤقت الذي البروتينتم حل يمكن أن تختلف ولكن هو شائع لتخفيف البروتين باستخدام نفس الحل الحجب هو موضح أعلاه.
  3. احتضان المصفوفة في حل البروتين ل08/03 ساعة في درجة حرارة الغرفة أو بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية.

4. احتضان مع الأجسام المضادة

  1. يغسل ثلاث مرات مع مجموعة 5 مل TBST / PBST. غسل الأول هو لمدة 30 ثانية تليها اثنين من 5 دقائق يغسل على شاكر في درجة حرارة الغرفة.
  2. احتضان مجموعة غسلها مع 5 مل من المخفف HRP-مترافق الأضداد (1: 1500) في وجود مخزن مؤقت الحضانة التي تحتوي على نفس المكونات في نفس تركيزات كما عرقلة الحل، لمدة 1 ساعة على شاكر في درجة حرارة الغرفة. الأجسام المضادة يمكن ربط إما بروتين الهدف أو العلامة.
  3. إجراء تجارب السيطرة اختبار تفاعل الأجسام المضادة مع الببتيدات على مجموعة، وخاصة إذا كان يحتوي على مجموعة من الببتيدات والبروتينات المستهدفة (على سبيل المثال، لoligomerization دراسات) بتكرار نفس البروتوكول دون الظريفص 3، تفرخ مع البروتين.
  4. يغسل ثلاث مرات مع مجموعة 5 مل TBST / PBST. غسل الأول هو لمدة 30 ثانية تليها اثنين من 5 دقائق يغسل على شاكر في درجة حرارة الغرفة.

5. قراءة صفيف

  1. تنفيذ تطوير معان كيميائي مع ECL الغربية عدة الركيزة النشاف.
  2. إجراء الكشف مع محلل الصورة الانارة.
  3. تحليل النتائج. تأكد من أن كلا من التكرارات على مجموعة تظهر نفس الإشارات، وبالتالي فإن النتائج لا يمكن الاعتماد عليها. إذا كان من المعروف هيكل شريك البروتين، والبحث عن هيكل لالببتيدات ملزمة والبحث عن مواقع الربط. حتى الببتيدات التي هي الآن في تسلسل يمكن أن يكون وثيق معا في بنية التعليم العالي وإنشاء موقع ملزم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

STIL هو بروتين centrosomal مهم للغاية. التي تسيطر عليها الانقسام الخلوي العادي وانتشار الخلايا 13،15 - 19. STIL يتفاعل مع العديد من البروتينات 18،20،21، ومعظم التفاعلات تحدث خلال دورها المركزي، وهي المنطقة المختلين جوهريا (IDR) 14. قمنا بتصميم مجموعة مكونة من الببتيدات المشتقة من STIL بروتين ملزمة CHFR. CHFR هو القامع الورم التي يسببها ردا على الإنقسامية الإجهاد 22. منذ كان هيكل المجال STIL ربط CHFR غير معروف في ذلك الوقت، قسمنا المجال البروتين إلى 15 بقايا الببتيدات طويلة مع تداخل 7 المخلفات، كما هو موضح في الخطوة 1.1 في البروتوكول. أجرينا مجموعة الببتيد فحص لتحديد المواقع CHFR-STIL ملزم، كما هو مفصل في البروتوكول المذكور أعلاه ويتضح في الشكل رقم 1. كنا مجموعة INTAVIS Celluspot تتألف من 384 الببتيدات في التكرارات، والتي يمكن أن توفر كمية ضخمة من المعلومات كما هو موضح في الشكل (2). وباستخدام هذه مجموعة الببتيد وجدنا مواقع الربط لSTIL في البروتين ملزمة لها CHFR (الشكل 3). كل بقعة سوداء في مجموعة تمثل الببتيد المستمدة CHFR التي تربط STIL. لاحظ أن كل الببتيد يبدو مرتين لأنه موجود في نسختين، والذي يتحقق من موثوقية النتائج. وقد تجلى التفاعل بين STIL وCHFR سابقا في مستوى البروتين 13،14. وكشف فحص مجموعة الببتيد الببتيد 7 CHFR المشتقة التي تربط STIL IDR، وبقايا 500-650 (الشكل 3، Amartely وآخرون. 14). سمحت هذه النتائج لنا لرسم خريطة للموقع ملزم من STIL على CHFR. رغم المسافة من هذه الببتيدات 7 على التسلسل الأساسي CHFR قام الطلاب بإنشاء موقع ملزم واضحة المعالم لSTIL في CHFR (الشكل 4) 14.

7 / 52097fig1highres.jpg "/>
الشكل 1: مخطط لفحص مجموعة الببتيد A- تصميم مجموعة الببتيد يتكون من الببتيدات متداخلة جزئيا المستمدة من واحد أو أكثر من البروتينات شريك، مع مراعاة الهياكل الثانوية لها؛. B- احتضان مع البروتين المستهدفة؛ ج احتضان مع الأجسام المضادة للكشف. كشف د (يمكن أن تقوم به لمعان كيميائي، مضان، الخ)؛ ج- تحليل النتائج للكشف عن البروتين مواقع الربط. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 2
الشكل 2: مثال على مجموعة الببتيد فحص الكشف يتحقق باستخدام معان كيميائي الشريحة يحتوي على اثنين من صفائف متطابقة كما التكرارات.ES / ftp_upload / 52097 / 52097fig2large.jpg "الهدف =" _ فارغا "> الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 3
الرقم 3: فحص مجموعة الببتيد لربط STIL IDR إلى البروتين CHFR: 4.5 ميكرومتر تم عرض STIL 500-650 الموسومة صاحب ملزمة للمجموعة. كل بقعة سوداء يشير ملزمة بين جزء STIL والببتيد CHFR المستمدة-14. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 4
الشكل 4: موقع ملزمة STIL في CHFR تظهر على بنية المجال غنية CHFR السيستئين (بقايا 424-661، PDB الرقم: 2XPO) السبعة.الببتيدات التي تربط STIL في فرز مجموعة الببتيد يمكن تقسيمها إلى ثلاث مناطق ملونة الوردي والبرتقالي والأحمر، والتي هي بعيدة في التسلسل الرئيسي ولكن قريبة من بعضها البعض في هيكل 3D خلق موقع واحد ملزم. هذه المنطقة مليئة تشكل جيب ملزم للSTIL في CHFR ديمر 14. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

الببتيد فحص مجموعة هو أداة ممتازة لتحديد مواقع الربط من البروتين المستهدف في شركائها. هذا الاختبار هو سريعة وسهلة لأداء ويمكن الحصول على النتائج في واحد أو يومين عمل. الببتيد فحص مجموعة هي متعددة ويمكن استخدامها لأغراض كثيرة. أنها يمكن أن تستخدم لوصف تعديلات ما بعد الترجمة مثل الفسفرة وتحديد ركائز من تحركات. على سبيل المثال: كيناز FLT3، الذي يرتبط الحادة سرطان الدم النخاعي، phosphorylates صور التي تحتوي على الببتيدات الركيزة التي عثرت عليها مجموعة الببتيد فحص 6. تم اختبار خصائص المثبطة للمثبطات التيروزين كيناز pazopanib وlapatinib باستخدام مجموعة الببتيد فحص 23. يمكن استخدام الببتيدات مجموعة لتحديد المواقع التي تتوسط تفاعلات البروتين البروتين. أمثلة على هذه البروتينات درس في المختبر باستخدام هذه الطريقة هي: تميزت لنا التفاعل بين البروتين HIV-1 VIF والبروتين A3G الخلويجي مجموعة الببتيد 24. فحص مجموعة الببتيد كانت تستخدم لدراسة التفاعلات لمكافحة أفكارك بي سي إل-2 مع عائلة المؤيد لأفكارك ASPP2 بروتين 25 ودراسة ربط tBID، وهو عضو في عائلة بي سي إل-2، مع الميتوكوندريا البروتين MTCH2 26؛ تم تحليل التفاعل داخل الجزيئي بين المجالات الميوسين لجنة التحقيق المستقلة باستخدام مجموعة الببتيد فحص 27. هنا نقدم مثالا على كيفية استخدام مجموعة الببتيد فحص لتحديد المواقع التي تتوسط التفاعل STIL-CHFR، تفاعل البروتين البروتين مهم في انتشار مرض السرطان و14. يمكن الكشف عن الموقع بالضبط ملزمة تخدم كأساس لتصميم الرشيد للمثبطات للتفاعل درس.

فحص مجموعة الببتيد ليس الفحص الكمي. فمن شبه الكمي لأن كمية الببتيد في كل بقعة على مجموعة تختلف نظرا لفارق في العائد الببتيد التوليف والنقاء. وهذا بدوره يعتمد على peptتسلسل IDE، طول، وما إلى ذلك الاختلاف في العائد والنقاء ويمكن أيضا أن تؤدي أحيانا إلى نتائج إيجابية أو سلبية كاذبة كاذبة. المقارنة بين شدة ضمن نفس مجموعة يمكن إجراء، مما أدى إلى الترتيب شبه الكمي. لكن هذه المقارنة بين المصفوفات مختلفة أو تجارب مختلفة مع نفس مجموعة ليست مضمونة. لقياس ملزمة، والببتيدات وجدت في فرز مجموعة الببتيد يجب تصنيعه واختباره للربط البروتين الهدف باستخدام أساليب فيزيائية حيوية مثل تباين مضان، متساوي الكالوري المعايرة (ITC)، مأكل سطح الرنين (SPR)، الخ وهذه المقايسات ليست حساسة دائما إلى ضعيف ملزمة لأنها تحتاج إلى تركيز عال من البروتين للكشف عن مثل ملزمة. فحص مجموعة الببتيد، من ناحية أخرى، حساس جدا إلى ضعيف ملزمة. وبالتالي، بعض من التفاعلات التي لوحظت في فحص مجموعة لا يمكن ملاحظتها أو قياسها كميا باستخدام أساليب مثل مضان anisot لزج 14. حقيقة أن فحص مجموعة الببتيد يتطلب تركيزات منخفضة جدا من البروتين جنبا إلى جنب مع حساسية عالية للمقايسة جعل مجموعة الببتيد طريقة مفيدة لفحص تفاعلات البروتين الببتيد في مجموعة واسعة من الانتماءات.

يمكن أن يكون نتائج سلبية كاذبة أيضا يرجع ذلك إلى حقيقة أن الببتيدات الخطية قد لا تمثل بشكل صحيح هيكل 3D من موقع ملزم في البروتين. لكن هذا ليس مشكلة مع البروتينات المختلين جوهريا، والتي تتمثل بشكل جيد من قبل الببتيدات. يمكن أيضا أن يحدث نتائج إيجابية كاذبة من قبل ملزم من الأجسام المضادة للمجموعة. ويمكن الكشف عن هذه عن طريق إجراء تجربة السيطرة كما هو موضح في القسم بروتوكول 4.3. ويمكن أيضا نتائج سلبية كاذبة إذا كان يمكن الحصول على حاتمة البروتين التي تعترف بها الأضداد تصبح غير معلن عليها ملزمة للمجموعة الببتيد. هذه المشكلة ليست شائعة لكن يمكن حلها باستخدام الأجسام المضادة بولكلونل ضد البروتين.

jove_content "> وفحص مجموعة الببتيد ويمكن أيضا أن تستخدم لتحسين الببتيدات الرصاص، بما في ذلك المسح الضوئي وألانين ريال سعودي يدرس 7 و بمجرد معرفة موقع ملزم من الهدف، ويمكن تصميم مجموعة على أساس تسلسل مع تعديلات متعددة بما في ذلك استبدال كل بقايا لألانين (علاء مسح) للتعرف على بقايا هامة للتفاعل. وبطريقة مماثلة، يمكن إجراء دراسات ريال سعودي عن طريق تغيير خصائص مختلفة من الببتيدات ملزمة. وتشمل هذه متفاوتة الطول من الببتيد، واستبدال المخلفات من قبل D المقابلة الأحماض -amino وتعديلات أخرى مثل الحامض، بالغليكوزيل والاستعاضة عنها الأحماض الأمينية غير طبيعية. وهذه الببتيدات المعدلة، وكلها ترتكز على تسلسل هدف واحد، يمكن توليفها في مجموعة واحدة وفحص لبروتين هدف ملزم في تجربة سريعة وسهلة واحد ، وتوفير ثروة من المعلومات لتحسين المانع المحتملين وفهم الآلية الجزيئية للتفاعل.

"jove_content"> منهجية لفحص مجموعة الببتيد هي مرنة للغاية ويمكن تطبيقها تغييرات في البروتوكول عند الحاجة. منع المركبات الأخرى بجانب الحليب، مثل ألبومين المصل البقري (BSA) أو السكروز، يمكن استخدامها. إذا غير محددة وملزمة لوحظ، ينبغي استخدام تركيزات أعلى من الحليب / BSA / السكروز. يمكن المحتضنة البروتين مع مجموعة في أي عازلة المطلوب، ولكن من المهم أن تضيف إلى الحليب عازلة / BSA / السكروز أو أي مانع آخر يستخدم في عرقلة الحل، لمنع ملزم غير محددة. ينبغي أن يظل تركيز بروتين منخفض نسبيا، وملزمة قوية يمكن ملاحظتها حتى مع البروتين 3-5 ميكرومتر. يجب أن يكون حجم حضانة في كل الخطوات (حظر، الحضانة مع البروتين أو الأجسام المضادة وغسيل) يكفي لتغطية كامل المصفوفة. عادة 4-5 مل تكفي. والجسم المضاد الثانوي يمكن أن تستخدم إذا كانت الأجسام المضادة الأولية غير قابل للكشف. في هذه الحالة الخطوتين 6 و 7 يجب أن يتكرر مع تخفيف وحضانة مراتالتي تتلاءم مع الجسم المضاد الثانوي معين. يعتمد إجراء الكشف على الأجسام المضادة. لالفجل البيروكسيديز (HRP) الأجسام المضادة مترافق، ويستخدم عادة لمعان كيميائي كما هو موضح في هذا البروتوكول. بدائل مختلفة يمكن استخدامها لأجسام مختلفة، مثل مضان أو الكهربائية معان كيميائي 4. مجموعة الببتيد الموصوفة هنا هي للاستخدام مرة واحدة فقط ولا يمكن إعادة استخدامها.

بروتوكول المعروضة هنا يدل على فائدة كبيرة من صفائف الببتيد. باستخدام مجموعة مصممة بشكل صحيح، يمكن تحديد مواقع الربط بين اثنين من البروتينات بالتفصيل. مرة واحدة وتتميز بكثير من موقع ملزم يمكن استخدامه كموقع الهدف المخدرات لتثبيط التفاعل البروتين البروتين ذات الصلة. بناء على الببتيدات ملزمة جدت في فرز مجموعة، جزيئات صغيرة المثبطة يمكن تصميم وفرزهم كما يؤدي المخدرات.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

يتم دعم وأيد AF بمنحة بدءا من مجلس البحوث الأوروبي في إطار البرنامج الإطاري السابع للجماعة الأوروبية (FP7 / 2007-2013) / اتفاق ERC غرانت N ° 203413 ومركز منيرفا لبيو الهجين systems.HA معقدة ومنظمة العفو الدولية بواسطة داليا ودان رشاف الزمالة لطلاب درجة متقدمة في الجامعة العبرية في القدس.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Peptide array INTAVIS Bioanalytical Instruments
His-probe Antibody (H-3) HRP Santa Cruz Biotechnology sc-8036 HRP
EZ-ECL Kit Biological industries 20-500-120
Skim Milk Becton, Dickinson and Company 232100
LAS-3000 camera  FUJI film

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Benyamini, H., Friedler, A. Using peptides to study protein–protein interactions. Future Medicinal Chemistry. 2 (6), 989-1003 (2010).
  2. Geysen, H. M., Wagner, C. D. Isotope or mass encoding of combinatorial libraries. Chemistry & Biology. 3 (8), 679-688 (1996).
  3. Frank, R. Spot-synthesis: an easy technique for the positionally addressable, parallel chemical synthesis on a membrane support. Tetrahedron. 48 (42), 9217-9232 (1992).
  4. Katz, C., Levy-Beladev, L., Rotem-Bamberger, S., Rito, T., Rudiger, S. G., Friedler, A. Studying protein-protein interactions using peptide arrays. Chem Soc Rev. 40 (5), 2131-2145 (2011).
  5. Hansen, L. B., Buus, S., Schafer-Nielsen, C. Identification and Mapping of Linear Antibody Epitopes in Human Serum Albumin Using High-Density Peptide Arrays. PLoS ONE. 8 (7), (2013).
  6. Uecker, A. A substrate peptide for the FLT3 receptor tyrosine kinase. British Journal of Haematology. 144 (1), 127-130 (2009).
  7. Gabizon, R., Faust, O., Benyamini, H., Nir, S., Loyter, A., Friedler, A. Structure-activity relationship studies using peptide arrays: the example of HIV-1 Rev-integrase interaction. Med. Chem. Commun. 4 (1), 252-259 (2013).
  8. Frank, R. The SPOT-synthesis technique: Synthetic peptide arrays on membrane supports—principles and applications. Journal of Immunological Methods. 267 (1), 13-26 (2002).
  9. Innovative Peptide Solutions. , http://www.jpt.com (2014).
  10. PEPSCAN shaping peptides to perfection. , http://www.pepscan.com (2014).
  11. Intavis Bioanalytical Instruments. , http://www.intavis.com (2014).
  12. Falsey, J. R., Renil, M., Park, S., Li, S., Lam, K. S. Peptide and Small Molecule Microarray for High Throughput Cell Adhesion and Functional Assays. Bioconjugate Chemistry. 12 (3), 346-353 (2001).
  13. Castiel, A., Danieli, M. M. The Stil protein regulates centrosome integrity and mitosis through suppression of Chfr. Journal of Cell Science. 124 (4), 532-539 (2011).
  14. Amartely, H., David, A., Lebendiker, M., Benyamini, H., Izraeli, S., Friedler, A. The STIL protein contains intrinsically disordered regions that mediate its protein-protein interactions. Chemical Communications. 50, Cambridge, England. 5245-5247 (2013).
  15. Izraeli, S., Lowe, L. A. The SIL gene is required for mouse embryonic axial development and left-right specification. Nature. 399 (6737), 691-694 (1999).
  16. Izraeli, S., Colaizzo-Anas, T., Bertness, V. L., Mani, K., Aplan, P. D., Kirsch, I. R. Expression of the SIL gene is correlated with growth induction and cellular proliferation. Cell Growth Differ. 8 (11), 1171-1179 (1997).
  17. Arquint, C., Sonnen, K. F., Stierhof, Y. -D., Nigg, E. a Cell-cycle-regulated expression of STIL controls centriole number in human cells. Journal of Cell Science. 125 (5), 1342-1352 (2012).
  18. Tang, C. J., Lin, S. Y. The human microcephaly protein STIL interacts with CPAP and is required for procentriole formation. Embo J. 30 (23), 4790-4804 (2011).
  19. Vulprecht, J., David, A. STIL is required for centriole duplication in human cells. Journal of Cell Science. 125 (5), 1353-1362 (2012).
  20. Campaner, S., Kaldis, P., Izraeli, S., Kirsch, I. R. Sil phosphorylation in a Pin1 binding domain affects the duration of the spindle checkpoint. Mol Cell Biol. 25 (15), 6660-6672 (2005).
  21. Kasai, K., Inaguma, S., Yoneyama, A., Yoshikawa, K., Ikeda, H. SCL/TAL1 interrupting locus derepresses GLI1 from the negative control of suppressor-of-fused in pancreatic cancer cell. Cancer Res. 68 (19), 7723-7729 (2008).
  22. Chaturvedi, P., Sudakin, V. Chfr regulates a mitotic stress pathway through its RING-finger domain with ubiquitin ligase activity. Cancer Res. 62 (6), 1797-1801 (2002).
  23. Olaussen, K. a, Commo, F. Synergistic proapoptotic effects of the two tyrosine kinase inhibitors pazopanib and lapatinib on multiple carcinoma cell lines. Oncogene. 28 (48), 4249-4260 (2009).
  24. Reingewertz, T. H., Britan-Rosich, E. Mapping the Vif–A3G interaction using peptide arrays: A basis for anti-HIV lead peptides. Bioorganic & Medicinal Chemistry. 21 (12), 3523-3532 (2013).
  25. Katz, C., Benyamini, H. Molecular basis of the interaction between the antiapoptotic Bcl-2 family proteins and the proapoptotic protein ASPP2. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (34), 12277-12282 (2008).
  26. Katz, C., Zaltsman-Amir, Y., Mostizky, Y., Kollet, N., Gross, A., Friedler, A. Molecular Basis of the Interaction between Proapoptotic Truncated BID (tBID) Protein and Mitochondrial Carrier Homologue 2 (MTCH2) Protein: KEY PLAYERS IN MITOCHONDRIAL DEATH PATHWAY. Journal of Biological Chemistry. 287 (18), 15016-15023 (2012).
  27. Rosenberg, M. M., Ronen, D., Lahav, N., Nazirov, E., Ravid, S., Friedler, A. High resolution characterization of myosin IIC tailpiece and its effect on filament assembly. Journal of Biological Chemistry. 288 (14), 9779-9789 (2013).

Tags

علم الأحياء الجزيئي، العدد 93، الببتيد، الببتيد المصفوفات، تفاعلات البروتين البروتين، مواقع الربط، الببتيد التوليف، المصفوفات المجهرية
تحديد مواقع التفاعل البروتين البروتين عن طريق الببتيد صفائف
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Amartely, H., Iosub-Amir, A.,… More

Amartely, H., Iosub-Amir, A., Friedler, A. Identifying Protein-protein Interaction Sites Using Peptide Arrays. J. Vis. Exp. (93), e52097, doi:10.3791/52097 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter