Summary
Live-billeddannelse af embryonale pattedyr cochlea er udfordrende, fordi de udviklingsmæssige processer ved hånden operere på en tidsmæssig gradient i løbet af ti dage. Her præsenteres en fremgangsmåde til dyrkning og derefter afbilde embryonale cochlear eksplantat væv taget fra en fluorescerende reporter musen over fem dage.
Abstract
Her præsenterer vi en metode for langsigtet time-lapse billeddannelse af levende embryonale mus cochleare eksplantater. Den udviklingsmæssige program ansvarlig for opbygning af stærkt bestilt, komplekse struktur af de pattedyr cochlea provenuet for omkring ti dage. For at studere ændringer i genekspression i denne periode og deres reaktion på farmaceutiske eller genetisk manipulation, er nødvendige langsigtede billeddannelse. Tidligere har den direkte billedvisning typisk været begrænset af levedygtigheden af eksplanterede væv i et fugtigt kammer oven på en standard mikroskop. Vanskeligheder med at bevare optimale betingelser for vækst kultur med hensyn til fugtighed og temperatur har sat grænser for længden af imaging eksperimenter. Et mikroskop integreret i en modificeret vævsdyrkningsinkubator giver et glimrende miljø for langsigtet-live billeddannelse. I denne metode, vi demonstrere, hvordan at etablere embryonale muse cochlear eksplantater og hvordan man bruger en inkubator mikroskop til at foretage tid bortfalder imaging anvendelse af både lysfelt og fluorescensmikroskopi for at undersøge opførslen af en typisk embryonisk dag (E) 13 cochlear eksplantat og Sox2, en markør for de prosensory celler i cochlea, i løbet af 5 dage.
Introduction
Pattedyr cochlea er en yderst ordnede komplekst organ. Hos mus, mellem fremkomsten af den primitive indre øre fra den otisk vesikel på dag E11 og færdiggørelse af den udviklingsmæssige program på tidlige postnatale faser, flere bølger af cellesignalering og koordinerede ændringer i genekspression finde sted. Løb fra base til spidsen af den cochlear kanal er lyden detektering sensoriske epithel eller organ Corti. Udvikling af organet for Corti er udsøgt styres således, at ved udgangen af udvikling, vil det bestå af en enkelt række af indre hårceller, tre rækker af ydre hårceller spækket med fem rækker af understøttende celler (to rækker af søjle celler, tre rækker af Deiters 'celler) 1. Afvigelse fra denne præcise rækkefølge resulterer i høretab, heighlighting betydningen af studye afde tilblivelse og mønstring af den sensoriske epithemlium 2.
In vitro dyrkning af embryonale mus cochlea er et vigtigt redskab i at studere de mekanismer for udvikling af et organ under Corti. Denne teknik blev etableret i 1974 og i løbet af de sidste 40 år, er blevet brugt til at belyse mange af de mekanismer, som det sensoriske epithel er angivet, og det organ Corti etablerede 3. Cochlea er et komplekst organ med dynamiske udviklingsprocesser; en manipulation kan tage så lang tid som syv dage, manifestere 1. For eksempel, når tilsætning af GSK 3β inhibitorer til en cochlear eksplantat kultur på E13, den optimale inkubationstid at observere en robust virkningen af forbindelsen seks dage 4.
Live-billeddannelse af det udviklende cochlea muliggør undersøgelse ændringer i morfologi af orglet af Corti, ændringer i genekspression, tracking af trækfugle, prolifererende eller døende celler, og det giver real-time observation af resultaterne af farmaceutiske midler og afbrydelse af signalering veje. Indtil nu lever billeddannelse af cochleaer hovedsagelig blevet udført under anvendelse konfokalmikroskopi til billedet små områder af det organ Corti over korte tidsperioder 5-8, men denne teknik har begrænsninger på grund eksplantat levedygtighed. I billedbehandling af virkningerne af længerevarende manipulationer på langsomme udviklingsprocesser, imaging miljø er afgørende. Typisk en konfokal billeddannelse system bruger en fugtig plastboks, der sidder på mikroskopet. Varme og fugt kan slippe ud gennem hullerne i inkubere boks, hvor den møder mikroskop bordet, gennem adgang vinduerne, gennem de hængslede åbninger og gennem huller omkring forskellige dele af microscope- såsom formålet eller lyskilden. Dette er ikke optimal til at opretholde en sund eksplantater for mere end to eller tre dage.
Vi definerer "incubator mikroskop 'som et omvendt mikroskop forseglet i en standard CO 2-inkubator, snarere end en inkubator bygget omkring mikroskopet. En inkubator mikroskop extendens livet af forsøget, således at i stedet for billeddannelse over to eller tre dage, kan prøver afbildes i op til to uger. En inkubator mikroskop giver et glimrende miljø for cellevækst og differentiering, med minimal forstyrrelse eksplantatkulturer og standard kontrollerede forhold. I undersøgelser, der finder sted over flere dage er det almindeligt at ty til billeddannelse prøver dagligt ved at fjerne dem fra inkubatoren og transporterer dem til et omvendt fluorescerende mikroskop. Mens denne tilgang kan arbejde, fjerne retter fra inkubatoren påfører stress på følsomme udvikle væv. Ændringer i surhed af dyrkningsmediet og svingninger i temperatur på grund af fjernelse fra inkubatoren kan medføre suboptimal udvikling og usundt væv. Billeddannelse af samme region på samme fokale plan og i samme retning på hver tidspunkt er meget udfordrende. Ved anvendelse af et automatiseret system i en inkubator, er det muligt at opretholde en sundvæv, at indsamle billeder på flere tidspunkter og sikre, at det samme område er fanget i hver ramme. I de senere år er der udviklet flere integrerede mikroskop væv væksthuse, disse har været nyttig, ikke kun i klinisk praksis 9, men også i stamceller og kræftforskning 10,11.
Her præsenterer vi en protokol for langsigtet billeddannelse af embryonale mus cochleare eksplantater. Vi bruger en automatiseret mikroskopi-system inde i en standard CO 2 inkubator, der har evnen til at tage billeder af flere prøver på indstillede tidspunkter. Systemet består af et omvendt mikroskop sæt inde i en inkubator. Prøverne anbringes i en roterende forhøjning, der tillader billeddannelse af multiple prøver ved hvert tidspunkt. Illumination, image capture og rotation af podiet styres af et automatiseret system, der drives gennem Metamorph software. Ved at sætte en billeddannende rutine ved hjælp af operativsystemet software kan vi sætte et eksperiment til at køre op til two uger med minimal menneskelig indgriben. I dette eksempel anvender vi både lysfelt og fluorescens til at vise store vækst og omlejring af cochlea, og specifikt prosensory region. I dette eksperiment, vil cochleae dissekeres fra Sox2 EGFP reporter mus på embryonale dag E13. In vitro-kulturer vil blive etableret, og derefter afbildes over fem dage.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Mus væv blev høstet fra Sox2 EGFP -reporter mus 12 vedligeholdes og aflivet i overensstemmelse med canadisk Rådet om Animal Care retningslinjer for pasning og anvendelse af forsøgsdyr.
1. Dyrkning embryonale Cochleae
- Supplere Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) ved at blande 8,89 ml af DMEM, 1 ml føtalt bovint serum (FBS), 100 pi 100x N2 supplement, og 10 pi 10 mg / ml ciprofloxacin. Supplere Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) ved at blande 495 ml HBSS med 5 ml 100% HEPES.
- Forbered glasbund dyrkningsskålene:
- I en laminær strømning, resuspender 200 pi basalmembran ekstrakt substrat i 5 ml DMEM. Forbered 35 mm diameter glasbund dyrkningsskålene med 10 mm brønde. Tilsæt 150 pi substrat / DMEM i centret af hvert glas bund skål. Disse retter kan anvendes efter 40 min inkubation, eller kan lagres i en CO 2 BEMÆRK: Glas bund retter anvendes af følgende grunde: for at sikre, at bunden af skålen er gennemsigtig og egnet til billedbehandling, for at skabe en fordybning i midten af skålen, der tillader eksplantaterne at bosætte sig i et let placeret område og endelig så efter et eksperiment prøven kan behandles for immunfarvning og efterfølgende analyse.
- Forbered arbejds-station og værktøjer:
- Tænd for laminar strømning ren bænk og sprøjtes ned med 70% EtOH at skabe et rent arbejdsområde. Soak pincet, skeer, og et sort 184 silikoneelastomer skålen (en blanding af 184 silikoneelastomer (10 dele), hærdningsmiddel (1 del) og trækul pulver (2,5 g)) i 70% EtOH.
- I ren arbejde station, høst embryoner til eksperimentet. Saml embryoner af passende drægtighed i iskold HBSS suppleret med 1% HEPES.
- Bestem en ekstern eller synlig organ, der vil demonstrerereporter aktivitet og undersøge embryoner under anvendelse af et fluorescerende stereomikroskop. Indsamle de embryoner, der udviser reporter aktivitet i iskold HBSS suppleret med 1% HEPES som disse er omfattet af eksperimentet.
- Saml tindingeben:
- Arbejde hurtigt, ved hjælp af en kølig lyskilde og fine tænger, indsamle hoveder af hvalpene. Pas at klippe på halshvirvel og under kæben til at undgå at beskadige tindingeben.
- Åbn forsigtigt kraniet. Fjern hjerne, trim fra forsiden af hovedet, og overføre den bageste kraniet til frisk iskold HBSS suppleret med 1% HEPES i en ren skål. Dissekere forsigtigt ud peanut formede tindingeben tog sig for at holde vestibulære system i Takt.
- Dissekere cochlea:
- Overfør tindingeben til en sort silicone elastomer belagt skål i iskold HBSS suppleret med 1% HEPES, pin vestibulære region af knoglen. Indsæt insekt stifteren skrå vinkel for at stabilisere tindingebenet og skabe plads til tangen. Pinning er et afgørende skridt i processen, som om tindingebenet får lov til at bevæge sig for meget, det er meget vanskeligt at høste en intakt cochlea.
- Fjern forsigtigt brusk omkring cochlea. Indsæt en tand af tangen i brusken på den ydre kant af bunden af cochlea og klippe et hul i brusken.
- Klippe en klap op på siden, indsætte tine af pincet og forsigtigt adskille taget af kanalen fra brusken. Clip vandret hen over toppen og diagonalt, og løft forsigtigt af forreste del af kapslen. Indsæt en gren af tangen mellem den resterende brusk og kanalen og forsigtigt klip fra den sidste sektion. Den apikale overflade af cochlea nu udsat for.
- Begyndende ved basis, fange det område, hvor tag af kanalen opfylder cochlear epitel og åbne cochlear kanalen. Forsigtigt skrælle tag, afpudsningnår det er nødvendigt, indtil den er helt fjernet. Afskære dele af membranen tilbage på den mediale side af kanalen. Rengør kanalen af overskydende mesenkymvæv og tag kanalen fra det vestibulære system.
- Kultur eksplantater:
- Placer en eksplantat, luminale overflade op i centrum af et substrat belagt glas bund dyrkningsskål omhyggeligt aftappe al væsken og henstår i to minutter. Tilsæt 150 pi suppleret DMEM drop-klogt at eksplantatet, pas på ikke at forstyrre den. Bør eksplantatet flyde frit, flytte med pincet, men passe på, at eksplantatet afregner til bunden af skålen, således at den kan vedhæfte til substratet.
- Placer glasbund retter i en dyb diameter 12 cm petriskål, med en lille skål sterilt vand for at opretholde fugtighed. Sæt kulturerne i en 35 ° C inkubator natten over for at eksplantatet vedhæfte til substratet og fladere.
2. Levende ImagING
- Vælg eksplantatpartikler prøver. Brug en fluorescerende stereomikroskop for at vurdere tilstanden af hver eksplanteret cochlea. Vælg kun explanter hvor kanalen er intakt og fastgjort til glasset fra base til spids.
- Indstil inkubatoren ved 35 ° C med 5% CO 2 til kultur cochlear væv. Sæt kulturerne i inkubatoren mikroskop:
- Forsigtigt aspireres off suppleret DMEM og erstatte med mindst 500 pi frisk medier. Til afbildning af op til 6 dage, er bedre 1-1,5 ml. I tilfælde, hvor eksplantater er løst vedlagt, pipette en ring af medier rundt i kanten af fadet. Denne ekstra væske vil gøre en miniature 'befugtet kammer «uden at forstyrre eksplantatet mens det fortsætter med at knytte til matricen.
- Alternativt brug hængslet parabol dækker at åbne lågene mens skålen forbliver i sin montering i mikroskopet, hvis reagenser skal udveksles under intervaller mellem billedsamlinger. Hængslede dish covers tillade låg væreåbnes uden at forstyrre prøverne eller fjerne retter fra deres indstillinger. Dette fastholder deres nøjagtige position for efterfølgende billede fanger.
- Sæt glasset bund skåle indeholdende relevante prøver i prøve fad indehaveren. Mikroskopet i dette eksempel har en roterende platform, der holder otte 35 mm prøve retter.
- Under laminar flow hætte erstatte plastlåg med glaslåg og sæt retter i prøve fad indehaveren. Placer prøve fad indehaveren indersiden inkubatoren pas på ikke at fordrive eksplantaterne fra bunden af skålen eller at forstyrre medierne.
- Forsigtigt aspireres off suppleret DMEM og erstatte med mindst 500 pi frisk medier. Til afbildning af op til 6 dage, er bedre 1-1,5 ml. I tilfælde, hvor eksplantater er løst vedlagt, pipette en ring af medier rundt i kanten af fadet. Denne ekstra væske vil gøre en miniature 'befugtet kammer «uden at forstyrre eksplantatet mens det fortsætter med at knytte til matricen.
- Opsæt imaging rutine:
- Tænd mikroskopet, UV-lampe og kamera og åbn imaging software.
- Find prøverne, plukke et billeddannende område, fly af fokus og justere eksponering gange for hver skål i rækkefølge. Vælg fokusplanet afhængigt af ikke blot visningen af eksplantatet på tidspunktet for start, men alså i betragtning af, hvordan væv vil bevæge sig, og hvor lang tid naturligvis vil køre.
- Indstil en Z stak centrering omkring den valgte brændplan i fluorescens kanal. Angiv hyppigheden og længden af prøveudtagningen til eksperimentet. Hyppigheden af prøveudtagningen vil blive begrænset af den tid, det tager at indsamle billeder, så dette bør afgøres efter valg synsfelter og fastsætte en Z stak. I dette tilfælde tager prøveudtagning placere hver 30 min i løbet af fem dage. Varigheden af forsøget kan være op til 14 dage.
- Generer en film:
- Ved slutningen af tidsforskydningen periode åbne billedfilerne. I dette tilfælde Metamorph software, der åbner sekventielle indsamlingssteder anvendes. Billede efter billede vælge den bedste fokusplan for at vise cellepopulationen af interesse.
- Konvertere disse billeder til en .avi-fil, eller eksportere dem som en montage til at generere et sæt af billeder, der kan åbnes og analyseres i billedbehandling software eller omregnet til multiple formats anvender videobehandling software.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Her viser vi en montage (figur 1) og en film (figur 2) viser, hvordan en typisk organotypisk cochlear explant vil vokse, hvis belagt på E13.5. En Sox2 reporter mus blev anvendt til at visualisere prosensory region. Filmen illustrerer, at cochlea undergår vækst og konvergens og udvidelse, må cellerne i den laterale område af den grønne Sox2 domænet ikke synes at opdele som væv, der omgiver den udvider sig. Dette er en egenskab af et organ under Corti; på E13 den fremtidige sensoriske epithel forlader cellecyklus og efterfølgende kendt som den zone af ikke-spredning 13. En anden time-lapse eksperiment centrering på den midterste base af en anden cochlear eksplantat (figur 3 og 4) viser, at som det strækker den prosensory region indsnævres. Bemærk, at vævet efter tre dage i kultur har betydeligt fladere, så det er muligt at visualisere individobbelt fluorescerende celler, hvorimod i begyndelsen der er regioner, hvor den interne refleksion af lys på grund af væv tykkelse gør det muligt at identificere områder af udtryk, men ikke de enkelte celler.
Figur 1:. Time - lapse billeder af Sox2 reporter cochlear væv indsamlet over fem dage Dette montage viser status for eksplantatet vækst startende på dag nul og slutter på dag fem, prøveudtagning hver 30 min ved hjælp af en 10X mål. Eksplantatet blev etableret på E13 og dyrket over natten før billeddannelse. Som eksplantatet modnes det både vokser og undergår konvergerende strækkebevægelser. (A) Sekventielle billeder, der viser omfanget af cochlear vækst ved 12 timers intervaller. Synligt lys kanal overlejret med GFP-fluorescens genbedømt af EGFP Sox2 reporter. kun (B) GFP-fluorescens kanal. Scale bar svarer til 200 um. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 2 :. Time-lapse animation af Sox2 reporter cochlear væv indsamlet over 5 dage Dette er den samme eksplantat eksperiment er angivet i figur 1, er denne tidsrammer valgte intervaller på 30 minutter i løbet af 5 dage, og kombineres som en .avi-fil til at generere en film.
Figur 3:. Mid basis undergår CE bevægelser og udfladning Sequential billeder, der viser, at den prosensory epitel midten base (EGFP) indsnævrer, udvider og flader i løbet af 5 dage. Pilene angiver regionen, der indsnævrer. Rammer valgt fra en 5 dages tidsforløb sekvens ved 12 timers intervaller ved hjælp af en 10X objektiv. Scale bar svarer til 200 um. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 4 : Time-lapse animation af midten basen undergår CE bevægelser og udfladning Animeret time-lapse-sekvens viser konvergens og udvidelse af det sensoriske epithel vist i figur 3 med stel udvalgt ved 30 min intervaller..
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Der er flere tekniske punkter at overveje, når kulturer er etableret, og i oprettelsen af time-lapse mikroskop, for langsigtet billeddannelse.
Vi bruger basalmembranmatrix som et substrat til dyrkning af cochlear eksplantater, men substratet skal matches til celletype. For eksempel til at afbilde neuronale kulturer, kan det være bedre at tilvejebringe en fibronectincoating. Inkubationstemperatur og gassammensætning bør også vælges efter vævstype. Vælge en alder af eksplantatet er vigtig. Vi starter på E13 tidligst fordi på E12 i retning af vækst er mindre forudsigelig. Da det er vigtigt, at eksplantater dyrkes natten over for at vedhæfte til substratet, bør forsøg planlægges at starte den følgende dag. Hvis et eksperiment er at starte på E15 eller ældre, bør der etableres kulturer på E13, som over tid vævet flader og spreder så cellerne er lettere at billede (se figur 3). Hvis cortiske organ skal afbildes, er det vigtigt, at cochlea dissekeres meget omhyggeligt. Rifter i den laterale kant af eksplantatet opdele det indre spænding af vævet, og dermed når cochlea gennemgår morfologiske omlejringer, cellernes spill "gennem brudstedet danner en v-formet protrusion.This fremspring kan flytte området af interesse ud af visningen . Derudover skal der drages omsorg for at fjerne så meget af taget af kanalen på den mediale side som muligt. Dette væv fortsætter med at formere sig som eksplantatet udvider sig og kan vokse over toppen af området af interesse tilslører det fra visningen.
Ved opsætning af den billeddannende rutine, skal vækst og ændringer i morfologi cochlea overvejes nøje. Bør vælges målet ikke blot er baseret på størrelsen af det område, der skal afbildes, men også under hensyntagen til, om denne region vil bevæge sig eller udvide. Celler i midterområdetaf cochlea (figur 1 og 2) kløft og bevæge sig inden for et begrænset område, så en stor forstørrelse kan bruges (20X, 40X, 60X). Celler i organet for Corti eller den laterale epitel, dog vil bevæge sig som eksplantatet vokser; en lavere forstørrelse (10X eller 20X) er bedre, da chancerne for, at cellerne forbliver i synsfeltet er højere. Billeddannelse af stationære regioner i cochlea er mulig ved høje forstørrelser. Vi valgte at bruge en 10X mål i repræsentative resultater afsnittet, fordi vi ønskede at vise hele explant, og fordi vævet bevægelsen er dynamisk på tidlige stadier.
Næste for at overveje, er planet af fokus. Da eksplantatet vil vokse udad og flade, er det sandsynligt, at brændplanet vil ændre sig dramatisk i løbet af tidsforløbet. Hvis området af interesse er det organ Corti eller lateral epitel, forudse dette og fokusere på de celler, der migrerer ud af eksplantatet kan hjælpe. Dette er alså et argument for at bruge de nederste forstørrelsesobjektiver. Det er muligt at indstille Z stakke for både fluorescens og DIC. Hvis cellerne af interesse er tilbøjelige til at flytte ud af fokus, oprette en Z stak af 3-5 um per trin kan modvirke dette, især hvis det sidste trin er i planet af dækglasset. Det kan være vanskeligt at vælge den rigtige plan ved visning kulturer på dag ét, som tætheden af pakningen af cellerne og reflekteret lys fra det omgivende væv kan forhindre et klart udsyn. Ved gennemgang af de rammer, til at generere en film eller montage senere, omhyggelig udvælgelse af Z-fly giver også sporing af celle bevægelser i tre dimensioner. Eksperimentet kan sættes på pause på ethvert tidspunkt at justere fokus indstillinger, hvis prøven bevæger sig ud af rækkevidde.
Live-billeddannelse af et cochlear eksplantat over en uge tilføjer en ny dimension til forståelsen af udviklingen af cochlea, der vil supplere konfokal direkte billedvisning. Dette er en fremragende metode til at bruge, når orgel lang lang-term undersøgelse er nødvendig, men vil ikke erstatte stor forstørrelse konfokal billeddannelse til kortsigtede enkelt celle studier. Valget af teknik afhænger af typen af væv, der skal afbildes, og forbindelse af eksperimentet. Denne teknik vil give efterforskerne undersøge spatio-temporale ændringer i reporter genekspression, celleproliferation og migration i realtid og tillade undersøgelse af reporter gen reaktion på farmaceutiske midler og levedygtigheden af celler i flere detaljer end tidligere muligt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at afsløre.
Acknowledgments
Tak til Willy Sun for teknisk bistand og Dr. Kris Gellynck for nyttige kommentarer og tre anonyme korrekturlæsere for deres konstruktive råd. Dette arbejde blev finansieret af Sunnybrook Hearing Regeneration Initiative
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle media | Gibco | 12430 | Multiple brands manufacture this |
| Basement membrane extract | Corning | 354230 | Matrigel. Alternative similar products are available from other suppliers. http://catalog2.corning.com/Lifesciences/en-US/Shopping/Product.aspx?categoryname=Cell+Culture+and+Bioprocess%28Lifesciences%29|Extracellular+Matrix+Proteins+ECMs+and+Attachment+Factors%28Lifesciences%29|Matrigel+Basement+Membrane+Matrix+%28Lifesciences%29 |
| Fetal bovine serum | Gibco | 16000044 | Multiple brands manufacture this http://www.lifetechnologies.com/search/global/searchAction.action?query=fbs&resultPage=1&results PerPage=15&autocomplete= |
| HEPES | Gibco | 5630080 | Multiple brands manufacture this http://www.lifetechnologies.com/search/global/searchAction.action?query=hepes&resultPage=1&results PerPage=15&autocomplete= |
| 100 x N2 supplement | Gibco | 17502-048 | Multiple brands manufacture this http://www.lifetechnologies.com/search/global/searchAction.action?query=n2&resultPage=1&results PerPage=15&autocomplete= |
| Ciprofloxacin | Sigma Aldrich | 17850-5G-F | Multiple brands manufacture this http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/17850?lang=en®ion=CA |
| Hank's balanced salt solution | Gibco | 14170161 | Multiple brands manufacture this. Should be refidgerated before use. http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/life-science/cell-culture/mammalian-cell-culture/reagents/balanced-salt-solutions/hbss-hanks-balanced-salt-solution.html?s_kwcid=AL!3652!3!26107410508!e!!g!!hbss&ef_id=xoFOglw2s UMAAMU8:20140228185720:s |
| Fine Forceps | Fine Science tools | 11254-20 | Size number 5 http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=350&CategoryId=29 |
| Curette | Fine Science Tools | 10080-05 | size 1 mm http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=91&CategoryId=118 |
| Insect Pins | Fine Science Tools | 26001-35 | Must be stainless Steel http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=124 |
| 50 mm plastic dishes | Corning/Falcon | 351006 | Multiple brands manufacture this |
| charcoal | Sigma Aldrich | 05105-250G | Multiple brands manufacture similar items http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/05105?lang=en®ion=CA |
| 184 silicone elastomer | Dow/Corning | SYLGARD® 184 SILICONE ELASTOMER KIT | Dishes are home made several weeks in advance. Silicone elastomer can be from any supplier.http://www.dowcorning.com/applications/search/products/Details.aspx?prod=01064291 |
| Glass bottom dishes | MatTek | P35G-0-10-C | The dimensions of the dish are determined by the specifications of the imaging system. 35 mm diameter, 10mm well, number 0 coverslip fits Olympus Vivaview FL. http://glass-bottom-dishes.com/catalog/index.php?main_page=product_info&cPath= 1_4_15&products_id=2 |
| Stereomicroscope | Zeiss | 495101-9804-000 | Stemi 2000 model. multiple brands manufacture similar items http://microscopy.zeiss.com/microscopy/en_de/products/stereo-zoom-microscopes/stemi-2000.html |
| Cold Light Source | Zeiss | 000000-1063-182 | Multiple brands manufacture similar items http://microscopy.zeiss.com/microscopy/en_de/products/microscope-components/lightsources.html |
| Fluorescent Stereomicroscope | Leica microsystems | Contact Leica microsystems | Leica M165-FC. Multiple brands manufacture similar items http://www.leica-microsystems.com/products/stereo-microscopes-macroscopes/fluorescence/details/product/leica-m165-fc/ |
| Incubator Microscope +imaging software | Olympus | Contact Olympus | Inverted microcope sealed inside a Co2 incubator. Vivaview FL incubator microscope with proprietry Metamorpoh imaging software. http://olympuscanada.com/seg_section/product.asp?product=1055&c=0 |
| Clean bench | Thermo Scientific | 51029701 | Multiple brands manufacture similar items http://www.thermoscientific.com/en/product/heraguard-eco-clean-bench.html |
| CO2 incubator | Thermo Scientific | 3310 | Multiple brands manufacture similar items http://www.thermoscientific.com/en/products/co2-incubators.html |
| Laminar Flow hood | Thermo Scientific | 51026651 | Multiple brands manufacture similar items http://www.thermoscientific.com/en/products/biological-safety-cabinets-clean-benches.html |
References
- Wu, D. K., Kelley, M. W. Molecular mechanisms of inner ear development. Cold Spring Harbor perspectives in biology. 4, (2012).
- Shim, K. The auditory sensory epithelium: the instrument of sound perception. The international journal of biochemistry & cell biology. 38, 1827-1833 (2006).
- Van de Water, T., Ruben, R. J. Growth of the inner ear in organ culture. The Annals of otology, rhinology, and laryngology. 83, 1-16 (1974).
- Jacques, B. E., et al. A dual function for canonical Wnt/beta-catenin signaling in the developing mammalian cochlea. Development. 139, 4395-4404 (2012).
- Castellano-Munoz, M., Peng, A. W., Salles, F. T., Ricci, A. J. Swept field laser confocal microscopy for enhanced spatial and temporal resolution in live-cell imaging. Microscopy and microanalysis : the official journal of Microscopy. Society of America, Microbeam Analysis Society, Microscopical Society of Canada. 18, 753-760 (2012).
- Szarama, K. B., Gavara, N., Petralia, R. S., Chadwick, R. S., Kelley, M. W. Thyroid hormone increases fibroblast growth factor receptor expression and disrupts cell mechanics in the developing organ of corti. BMC developmental biology. 13, 6 (2013).
- Appler, J. M., et al. Gata3 is a critical regulator of cochlear wiring. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 33, 3679-3691 (2013).
- Wibowo, I., Pinto-Teixeira, F., Satou, C., Higashijima, S., Lopez-Schier, H. Compartmentalized Notch signaling sustains epithelial mirror symmetry. Development. 138, 1143-1152 (2011).
- Hashimoto, S., Kato, N., Saeki, K., Morimoto, Y. Selection of high-potential embryos by culture in poly(dimethylsiloxane) microwells and time-lapse imaging. Fertility and sterility. 97, 332-337 (2012).
- Matsuoka, F., et al. Morphology-based prediction of osteogenic differentiation potential of human mesenchymal stem cells. PloS one. 8, (2013).
- Ma, G. F., et al. et al.Transforming growth factor-beta1 and -beta2 in gastric precancer and cancer and roles in tumor-cell interactions with peripheral blood mononuclear cells in vitro. PloS one. 8, (2013).
- Taranova, O. V., et al. SOX2 is a dose-dependent regulator of retinal neural progenitor competence. Genes & development. 20, 1187-1202 (2006).
- Chen, P., Segil, N. p27(Kip1) links cell proliferation to morphogenesis in the developing organ of Corti. Development. , 1581-1590 (1999).
