Summary
Live-avbildning av den embryonale pattedyr cochlea er utfordrende fordi de utviklingsprosesser for hånden operere på en tidsmessig gradient over ti dager. Her presenterer vi en metode for dyrking og deretter bildebehandling embryonale cochlea explant vev tatt fra en fluorescerende reporter musen over fem dager.
Abstract
Her presenterer vi en metode for langsiktig time-lapse avbildning av levende foster muse cochlea eksplantater. Utviklings program ansvaret for å bygge den svært bestilt, kompleks struktur av de pattedyr cochlea inntektene for rundt ti dager. For å studere forandringer i gen-ekspresjon i denne perioden og deres respons på farmasøytiske eller genetisk manipulasjon, er langvarig avbildning nødvendig. Tidligere har levende avbildning vanligvis vært begrenset av levedyktigheten til eksplanterte vevet i en fuktet kammer på toppen av en standard mikroskop. Vanskeligheter med å opprettholde optimale betingelser for vekstkultur med hensyn til fuktighet og temperatur har lagt begrensninger på lengden av bildebehandlings eksperimenter. Et mikroskop integrert i en modifisert vevsdyrkningsinkubator gir et utmerket miljø for langsiktig-live imaging. I denne metoden viser vi hvordan å etablere embryonale mus cochlea eksplantater og hvordan du bruker en inkubator mikroskop for å gjennomføre tid forfalle Imaging bruke både lyse felt og fluorescerende mikroskopi for å undersøke oppførselen til en typisk embryonale dag (E) 13 cochlea eksplantering og Sox2, en markør av prosensory cellene i sneglehuset, over fem dager.
Introduction
Pattedyrsneglehuset er en høyt organisert komplekst organ. I mus, mellom fremveksten av den primitive indre øret fra otic vesikkel på dag E11 og gjennomføring av utviklings program på tidlige postnatal stadier, flere bølger av cellesignalisering og koordinerte endringer i genuttrykk skje. Kjører fra bunn til toppen av cochlea-kanalen er lyden påvise sensorisk epitel, eller organ Corti. Utvikling av orgelet av Corti er utsøkt kontrollert slik at ved slutten av utviklingen, vil det bestå av en enkelt rad av indre hårceller, tre rader med ytre hårcellene ispedd fem rader med støtte celler (to rader med pilar celler, tre rader av Deiters 'celler) 1. Avvik fra dette presise ordre resultater i hørselstap, heighlighting betydningen av studye ofthe tilblivelse og fordelingen av den sensoriske epithemlium to.
In vitro dyrkning av den embryonale muse cochlea er et viktig verktøy i å studere mekanismene for utvikling av orgelet i Corti. Denne teknikken ble etablert i 1974 og i løpet av de siste 40 årene, har blitt brukt til å belyse mange av de mekanismer som sensorisk epitel er spesifisert og orgel av Corti etablerte tre. Sneglehuset er et komplekst organ med dynamiske utviklingsprosesser; en manipulasjon kan ta så lenge som syv dager å manifestere en. For eksempel, når du legger GSK 3β hemmere til et cochlea eksplantering kultur på E13, til optimal inkubasjonstid observere en robust effekt av det sammensatte er seks dager 4.
Live-avbildning av utviklings cochlea tillater gransking endringer i morfologi av orgelet av Corti, endringer i genuttrykk, sporing av migrerende, prolifererende eller døende celler, og det gjør at real-time observasjon av resultatene av farmasøytiske midler og forstyrrelse av signalering trasé. Inntil nå, leve avbildning av sneglehusethar i hovedsak blitt utført ved hjelp konfokalmikroskopi til bilde små områder av organ Corti over korte tidsperioder 5-8, men denne teknikken har begrensninger på grunn eksplantering levedyktighet. I avbildning av effektene av langsiktige manipulasjoner på langsomme utviklingsprosesser, er bildebehandlingsmiljøet avgjørende. Vanligvis en confocal levende bildesystem bruker en fuktet plastboks som sitter på mikroskopet. Varme og fuktighet kan unnslippe gjennom hullene i rugende boksen der den møter mikroskop tabellen, gjennom tilgangs vinduer, gjennom hengslede åpninger og gjennom hullene rundt ulike deler av microscope- som objektiv eller lyskilde. Dette er ikke optimal for å opprettholde sunne eksplantater i mer enn to eller tre dager.
Vi definerer "inkubator mikroskop 'som et invertert mikroskop forseglet inne i en standard CO 2 inkubator, snarere enn en inkubator bygget rundt mikroskopet. En inkubator mikroskop exhar en tendens til levetiden av forsøket, slik at heller enn avbildning over to eller tre dager, kan prøvene bli avbildet i inntil to uker. En inkubator mikroskop gir et utmerket miljø for cellevekst og differensiering, med minimal forstyrrelse eksplanterer kulturer og standard kontrollerte forhold. I studier som går over flere dager er det vanlig å ty til bildeprøver på daglig basis ved å fjerne dem fra inkubatoren og frakte dem til en invertert fluorescerende mikroskop. Mens denne tilnærmingen kan arbeide, tar ut serviset fra inkubatoren påfører stress på sensitive utvikle vev. Endringer i surheten i dyrkningsmediet, og fluktuasjoner i temperatur på grunn av fjerning fra inkubatoren kan resultere i suboptimal utvikling og usunt vev. Imaging samme region på samme fokalplan og i samme retning på hver gang punktet er ekstremt krevende. Ved å bruke et automatisert system i en inkubator, er det mulig å opprettholde sunnvev, for å fange opp bilder på flere tidspunkter, og for å sikre at det samme området er fanget i hver ramme. I de senere årene har flere integrerte mikroskop vev inkubatorer har blitt utviklet, disse har vært nyttig ikke bare i klinisk praksis 9, men også i stamcelle og kreftforskning 10,11.
Her presenterer vi en protokoll for langsiktig levende avbildning av embryonale muse cochlea eksplantater. Vi bruker en automatisert mikros system inne i en standard CO 2 inkubator som har evnen til å ta bilder av flere prøver på sett tidspunkter. Systemet består av et invertert mikroskop beliggende inne i en inkubator. Prøvene blir plassert i en roterende pallen som tillater avbildning av flere prøver på hvert tidspunkt. Belysning, bildeopptak, og rotasjon av pallen er kontrollert av et automatisk system drevet gjennom Metamorph programvare. Ved å sette en bilde rutine med programvaren kan vi sette et eksperiment for å kjøre i opptil two uker med minimal menneskelig inngripen. I dette eksempelet bruker vi både lyse felt og fluorescens for å vise vekst i stor skala og omleiring av sneglehuset, og spesifikt, prosensory regionen. I dette eksperimentet, vil cochleae bli dissekert fra Sox2 EGFP rapportør mus på embryoniske dag E13. In vitro kulturer blir etablert og deretter avbildes i løpet av fem dager.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Mus vev ble høstet fra Sox2 EGFP -reporter mus 12 vedlikeholdt og avlives i samsvar med Canadian Council on Animal Care retningslinjer for omsorg og bruk av forsøksdyr.
1. Dyrking Embryonic Cochleae
- Supplement Dulbeccos modifiserte Eagle-medium (DMEM) ved å blande 8,89 ml av DMEM, 1 ml føtalt bovint serum (FBS), 100 ul av N2-supplement 100x, og 10 ul av 10 mg / ml ciprofloksacin. Supplement Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) ved å blande 495 ml HBSS med 5 ml 100% HEPES.
- Forbered glassbunn kultur retter:
- I en laminær strømningshette, resuspendere 200 pl basalmembranekstrakt substrat i 5 ml DMEM. Forbered 35 mm diameter glassbunn kultur retter med mm brønner 10. Pipetter 150 mL underlaget / DMEM i sentrum av hver glassbunn parabolen. Disse retter kan brukes etter 40 min inkubering, eller kan lagres i en CO 2 MERK: Glass bunnet retter blir brukt av følgende grunner: for å sikre at bunnen av fatet er transparent og egnet for bildebehandling, for å lage en brønn i midten av parabolen som gjør explants å bosette seg i et lett ligger området og til slutt slik at etter et eksperiment prøven kan bli behandlet for farging og etterfølgende analyse.
- Forbered arbeidsstasjonen og verktøy:
- Slå på laminær ren benk, og spray ned med 70% EtOH å lage et rent arbeidsområde. Suge tang, skjeer, og et sort 184 silikon elastomer fatet (en blanding av 184 silikon elastomer (10 deler), herder (1 del) og trekull pulver (2,5 g)) i 70% EtOH.
- I ren arbeidsstasjonen, slakte embryoer for forsøket. Samle embryoer fra det aktuelle svangerskapet i iskald HBSS supplert med 1% HEPES.
- Bestem en ekstern eller synlig organ som vil demonstrerereporter aktivitet og undersøke befruktede egg ved hjelp av en fluorescerende stereomikroskop. Samle de embryoer som utviser rapportøraktivitet i iskald HBSS supplementert med 1% HEPES som disse er gjenstand for eksperimentet.
- Samle timelige bein:
- Arbeide raskt, ved hjelp av en kjølig lyskilde og fin pinsett, samle lederne for valpene. Vær nøye med å klippe på halsvirvler og under kjeven for å unngå skade på timelige bein.
- Åpne forsiktig skallen. Fjern hjernen, trim av fronten av hodet, og overføre den bakre hodeskallen til frisk iskald HBSS supplert med 1% HEPES i en ren tallerken. Nøye dissekere ut peanut formet timelige bein å ta vare å holde det vestibulære systemet i takt.
- Dissekere cochlea:
- Overfør de timelige bein til en svart silikon elastomerbelagt fatet i iskald HBSS supplert med 1% HEPES, pin vestibular regionen i beinet. Sett insekt pins påen skrå vinkel for å stabiltinningbenet og skape rom for tang. Pinner er et viktig skritt i prosessen som om tinningbenet er lov til å bevege seg for mye er det svært vanskelig å høste en intakt cochlea.
- Fjern forsiktig brusk rundt cochlea. Sett en tine av pinsettangens inn i brusk ved den ytre kant av bunnen av sneglehuset og klippet et hull inn i brusk.
- Klipp en klaff opp på siden, setter tine av tang og forsiktig skille taket av kanalen fra brusk. Clip horisontalt over toppen og diagonalt, og løft av den fremre delen av kapselen. Sett inn en spiss av tang i mellom de resterende brusk og kanalen og forsiktig klippe av den siste delen. Den apikale overflaten av sneglehuset er nå utsatt.
- Starter på basen, fange området der taket av kanalen møter cochlea epitel og åpne cochlea-kanalen. Forsiktig løsner taket, trimmingnår det er nødvendig inntil det er fullstendig fjernet. Klipp av eventuelle deler av membranen igjen på den mediale side av kanalen. Rengjøre kanalen overflødig mesenchymale vev og løsne kanalen fra det vestibulære systemet.
- Kultur explants:
- Legg inn en eksplantat, luminal overflaten opp, i sentrum av et substrat belagt glassbunn kultur fatet, nøye trekke ut all væsken og la stå i to minutter. Legg 150 ul supplert DMEM drop-klokt å eksplantatet, ta vare for ikke å forstyrre den. Skulle eksplantatet flyte fritt, omplassere med pinsett, men pass på at eksplantatet legger seg til bunnen av fatet, slik at den kan feste til underlaget.
- Plasser glassbunn retter i en dyp 12 cm diameter petriskål, med en liten skål med sterilt vann for å opprettholde fuktighet. Sett kulturer inn til en 35 ° C inkubator over natten for at eksplantat å feste til underlaget og flat.
2. Levende Imaging
- Velg eksplantering prøver. Bruke et fluorescerende stereomikroskop for å vurdere tilstanden til hver eksplantert sneglehuset. Velge kun eksplantater hvor kanalen er intakt og festet til glasset fra basen til apex.
- Sett inkubator ved 35 ° C med 5% CO 2 til kultur cochlea vev. Sett kulturer inn i kuvøsen mikroskop:
- Forsiktig aspirer utenfor supplert DMEM og erstatte med minst 500 mL frisk medier. For bildebehandling opp til 6 dager, er 1-1,5 ml bedre. I tilfeller der eksplantater er løst festet, pipetter en ring av media rundt kanten av fatet. Denne ekstra væske vil gjøre en miniatyr "fuktet kammer 'uten å forstyrre eksplantatet mens den fortsetter å feste til matrisen.
- Alternativt kan du bruke hengslet fatet dekker å åpne dekslene under fatet forblir i sin tilpasning i mikroskop hvis reagenser må byttes i løpet av intervallene mellom bildesamlinger. Hengslet tallerken dekker lar lokkene til å væreåpnet uten å forstyrre de prøver eller fjerne retter fra sine innstillinger. Dette opprettholder sin eksakte posisjon for påfølgende bilde fanger.
- Sett inn glassbunn retter som inneholder riktige prøvene inn i prøve parabolen holder. Mikroskopet i dette eksemplet har en roterende plattform som holder åtte 35 mm prøve retter.
- Under laminær hette erstatte plastlokk med glasslokk og sett oppvasken inn i prøve parabolen holder. Plasser prøven parabolen holder inne inkubatoren tar seg ikke å løsne explants fra bunnen av fatet eller å forstyrre media.
- Forsiktig aspirer utenfor supplert DMEM og erstatte med minst 500 mL frisk medier. For bildebehandling opp til 6 dager, er 1-1,5 ml bedre. I tilfeller der eksplantater er løst festet, pipetter en ring av media rundt kanten av fatet. Denne ekstra væske vil gjøre en miniatyr "fuktet kammer 'uten å forstyrre eksplantatet mens den fortsetter å feste til matrisen.
- Sett opp bilde rutine:
- Slå på mikroskopet, UV lampe og kameraet og åpne bildebehandlingsprogrammer.
- Finn prøvene, plukke en bildeområde, fokusplanet og justere eksponeringstider for hver rett etter hverandre. Velg fokusplanet avhengig ikke bare på visningen av eksplantat på tidspunktet for start, men alså med tanke på hvordan vevet vil flytte og hvor lang tid Kurset vil gå.
- Sett en Z stabel sentrering rundt det valgte fokalplanet i fluorescens kanal. Angi hyppigheten og lengden av prøvetagnings for forsøket. Hyppigheten av prøvetakingen vil bli begrenset av den tiden det tar å samle bilder, så dette bør bestemmes etter å ha valgt synsfelt og sette en Z stack. I dette tilfellet prøvetaking finner sted hvert 30 min i løpet av fem dager. Varigheten av forsøket kan være opp til 14 dager.
- Generere en film:
- Ved slutten av tidsintervallperiode åpne bildefilene. I dette tilfellet Metamorph programvare som åpner sekvensielle innsamlingspunkter brukes. Bilde for bilde plukke de beste fokusplanet for å vise cellepopulasjon av interesse.
- Konvertere disse bildene til en AVI-fil, eller eksportere dem som en montasje for å generere et sett med bilder som kan åpnes og analysert i bildebehandlingsprogram eller konverteres til flere formats bruker videobehandling programvare.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Her viser vi en montasje (figur 1) og en film (figur 2) viser hvordan en typisk organotypic cochlea eksplantering vil vokse hvis belagt på E13.5. En Sox2 reporter mus ble brukt til å visualisere prosensory regionen. Filmen illustrerer at sneglehuset undergår vekst og konvergens og forlengelse, har cellene i den laterale delen av den grønne Sox2 domenet ikke synes å dele som vevet som omgir det utvider seg. Dette er en egenskap av organ Corti; E13 på den potensielle sensorisk epitel kommer ut av cellesyklusen, og blir deretter kjent som den sone av ikke-spredning 13. En andre tidsintervall eksperiment sentrering på midt base av en annen cochlea eksplantasjon (figurene 3 og 4) viser at etter hvert som den strekker seg, smalner prosensory regionen. Legg merke til at etter tre dager i kultur vevet har betraktelig utflatet slik at det er mulig å visualisere fysisk perdual som fluorescerer celler, mens i begynnelsen er det områder hvor intern refleksjon av lys på grunn av vev tykkelsen gjør det mulig å identifisere regioner av uttrykket, men ikke individuelle celler.
Figur 1:. Time - lapse bilder av Sox2 reporter cochlea vev samlet inn over fem dager Denne montasjen viser fremdriften av eksplantat vekst start på dag null og slutter på dag fem, prøvetaking hvert 30 min ved hjelp av en 10X objektiv. Eksplantatet ble etablert på E13 og kultivert over natten før bildebehandling. Som eksplantatet modnes det både vokser og gjennomgår konvergent forlengelse bevegelser. (A) Sekvensiell bilder som viser omfanget av cochlea vekst på 12 timers mellomrom. Synlig lys kanal kledde med GFP fluorescens genetvurdert av EGFP Sox2 reporter. (B) GFP fluorescens kanalen. Scale bar tilsvarer 200 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 :. Time-lapse animasjon av Sox2 reporter cochlea vev samlet inn over fem dager Dette er det samme explant eksperiment vist i figur 1, er denne tidsrammer valgt med 30 minutters intervaller over fem dager, og kombinert som en AVI-fil til å generere en film.
Figur 3:. Mid basen under CE bevegelser og flatere Sequential bilder som viser at prosensory epitel av midten av base (EGFP) smalner av, og strekker flater i løpet av 5 dager. Pilene angir regionen som smalner. Rammer valgt fra en fem dagers tid lapse sekvens på 12 timers mellomrom ved hjelp av en 10X objektiv. Scale bar tilsvarer 200 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 : Time-lapse animasjon av mid basen under CE bevegelser og flatere Animert time-lapse sekvens som viser konvergens og utvidelse av sensorisk epitel vist i figur 3 med rammer valgt med 30 minutters mellomrom..
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det er flere tekniske poeng å vurdere når kulturer er etablert og i å sette opp time-lapse mikroskop for at langsiktig bildebehandling.
Vi bruker basalmembran matrise som et substrat for dyrking av cochlea eksplantater, men underlaget bør matches til celletype. For eksempel, i bilde neuronale kulturer, kan det være bedre å tilveiebringe et belegg fibronektin. Inkubasjon temperatur og gassammensetning bør også velges i henhold til vevstype. Å velge en alder av eksplantatet er viktig. Vi starter på E13 tidligst fordi på E12 retning av vekst er mindre forutsigbar. Som det er viktig at eksplantater er dyrket over natten til å feste til underlaget, bør eksperimenter være planlagt for å begynne den neste dag. Ved et eksperiment er å starte på E15 eller eldre, bør kulturene bli etablert på E13 som over tid vevet flater og sprer seg slik at cellene er lettere å bilde (se figur 3). Hvis det organ av Corti er som skal avbildes, er det viktig at sneglehuset dissekeres meget nøye. Kutt i den laterale kant av eksplantat bryte den indre spenningen i vevet, således når sneglehuset undergår morfologiske rearrangementer, cellenes søl 'gjennom riften danner en "V" formet protrusion.This fremspringet kan bevege regionen av interesse ut av visningen . I tillegg må man sørge for å fjerne så mye av taket av kanalen på den mediale side som mulig. Dette vevet fortsetter å spre seg som eksplantatet ekspanderer og kan vokse over toppen av regionen av interesse å skjule det fra visningen.
Når du setter opp bilde rutine, må vekst og endringer i morfologi av cochlea vurderes nøye. Formålet bør velges basert ikke bare av størrelsen på området som skal avbildes, men også å ta hensyn til hvorvidt den regionen vil bevege seg eller ekspandere. Celler i den mediale regionenav sneglehuset (figur 1 og 2) splitt og bevege seg innenfor et begrenset område, slik at en høy forstørrelse kan brukes (20X, 40X, 60X). Celler i det organ eller den laterale Corti epitel, vil imidlertid som bevege eksplantatet vokser; en lavere forstørrelse (10X eller 20X) er bedre, så sjansene for at cellene vil forbli i synsfeltet er høyere. Avbildning av stasjonære regioner av sneglehuset er mulig ved høye forstørrelser. Vi valgte å bruke et 10X objektiv i den representative resultater seksjonen fordi vi ønsket å vise hele eksplantat, og fordi vevet bevegelsen er dynamisk på tidlige stadier.
Neste å vurdere er fokusplanet. Gitt at eksplantatet vil vokse utover og flat, er det sannsynlig at fokusplanet vil endre seg dramatisk i løpet av den tiden kurset. Hvis regionen av interesse er det organ Corti eller lateral epitel, forutse dette og fokusere på cellene migrerer ut av eksplantat kan hjelpe. Dette er alså et argument for å bruke de lavere forstørring. Det er mulig å sette Z stabler for både fluorescens og DIC. Hvis cellene av interesse er sannsynlig å bevege seg ut av fokus, å sette opp en stabel av Z 3-5 um pr trinn kan motvirke dette, spesielt hvis den siste trinn er i planet av dekkglasset. Det kan være vanskelig å velge riktig plan når du ser kulturer på dag én, som tettheten av pakking av cellene og reflektert lys fra omkringliggende vev kan hindre fri sikt. Ved gjennomgang av rammene for å generere en film eller montage senere, kan nøye utvalg av Z-flyene også sporing av celle bevegelser i tre dimensjoner. Eksperimentet kan bli stanset på et punkt for å justere fokusinnstillinger hvis prøven beveger seg utenfor rekkevidde.
Live-avbildning av et cochlea eksplantering over en uke tilfører en ny dimensjon til å forstå utviklingen av sneglehuset som vil utfylle confocal levende bildebehandling. Dette er en utmerket metode å bruke når organ bredt lang-term undersøkelse er nødvendig, men vil ikke erstatte høy forstørrelse confocal bildebehandling for kortsiktige enkeltcellestudier. Valget av teknikk er avhengig av type vev som skal avbildes, og rammen av forsøket. Denne teknikken gjør det mulig å undersøke undersøkere spatio-temporale endringer i genekspresjon reporter, celleproliferasjon og migrering i sanntid og tillater studiet av reportergen respons til farmasøytiske midler og levedyktighet av celler i større detalj enn tidligere mulig.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noe å avsløre.
Acknowledgments
Takk til Willy Sun for teknisk assistanse og Dr. Kris Gellynck for nyttige kommentarer og tre anonyme anmeldere for sin konstruktive råd. Dette arbeidet ble finansiert av Sunnybrook Hearing Regeneration Initiative
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle media | Gibco | 12430 | Multiple brands manufacture this |
| Basement membrane extract | Corning | 354230 | Matrigel. Alternative similar products are available from other suppliers. http://catalog2.corning.com/Lifesciences/en-US/Shopping/Product.aspx?categoryname=Cell+Culture+and+Bioprocess%28Lifesciences%29|Extracellular+Matrix+Proteins+ECMs+and+Attachment+Factors%28Lifesciences%29|Matrigel+Basement+Membrane+Matrix+%28Lifesciences%29 |
| Fetal bovine serum | Gibco | 16000044 | Multiple brands manufacture this http://www.lifetechnologies.com/search/global/searchAction.action?query=fbs&resultPage=1&results PerPage=15&autocomplete= |
| HEPES | Gibco | 5630080 | Multiple brands manufacture this http://www.lifetechnologies.com/search/global/searchAction.action?query=hepes&resultPage=1&results PerPage=15&autocomplete= |
| 100 x N2 supplement | Gibco | 17502-048 | Multiple brands manufacture this http://www.lifetechnologies.com/search/global/searchAction.action?query=n2&resultPage=1&results PerPage=15&autocomplete= |
| Ciprofloxacin | Sigma Aldrich | 17850-5G-F | Multiple brands manufacture this http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/17850?lang=en®ion=CA |
| Hank's balanced salt solution | Gibco | 14170161 | Multiple brands manufacture this. Should be refidgerated before use. http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/life-science/cell-culture/mammalian-cell-culture/reagents/balanced-salt-solutions/hbss-hanks-balanced-salt-solution.html?s_kwcid=AL!3652!3!26107410508!e!!g!!hbss&ef_id=xoFOglw2s UMAAMU8:20140228185720:s |
| Fine Forceps | Fine Science tools | 11254-20 | Size number 5 http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=350&CategoryId=29 |
| Curette | Fine Science Tools | 10080-05 | size 1 mm http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=91&CategoryId=118 |
| Insect Pins | Fine Science Tools | 26001-35 | Must be stainless Steel http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=124 |
| 50 mm plastic dishes | Corning/Falcon | 351006 | Multiple brands manufacture this |
| charcoal | Sigma Aldrich | 05105-250G | Multiple brands manufacture similar items http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/05105?lang=en®ion=CA |
| 184 silicone elastomer | Dow/Corning | SYLGARD® 184 SILICONE ELASTOMER KIT | Dishes are home made several weeks in advance. Silicone elastomer can be from any supplier.http://www.dowcorning.com/applications/search/products/Details.aspx?prod=01064291 |
| Glass bottom dishes | MatTek | P35G-0-10-C | The dimensions of the dish are determined by the specifications of the imaging system. 35 mm diameter, 10mm well, number 0 coverslip fits Olympus Vivaview FL. http://glass-bottom-dishes.com/catalog/index.php?main_page=product_info&cPath= 1_4_15&products_id=2 |
| Stereomicroscope | Zeiss | 495101-9804-000 | Stemi 2000 model. multiple brands manufacture similar items http://microscopy.zeiss.com/microscopy/en_de/products/stereo-zoom-microscopes/stemi-2000.html |
| Cold Light Source | Zeiss | 000000-1063-182 | Multiple brands manufacture similar items http://microscopy.zeiss.com/microscopy/en_de/products/microscope-components/lightsources.html |
| Fluorescent Stereomicroscope | Leica microsystems | Contact Leica microsystems | Leica M165-FC. Multiple brands manufacture similar items http://www.leica-microsystems.com/products/stereo-microscopes-macroscopes/fluorescence/details/product/leica-m165-fc/ |
| Incubator Microscope +imaging software | Olympus | Contact Olympus | Inverted microcope sealed inside a Co2 incubator. Vivaview FL incubator microscope with proprietry Metamorpoh imaging software. http://olympuscanada.com/seg_section/product.asp?product=1055&c=0 |
| Clean bench | Thermo Scientific | 51029701 | Multiple brands manufacture similar items http://www.thermoscientific.com/en/product/heraguard-eco-clean-bench.html |
| CO2 incubator | Thermo Scientific | 3310 | Multiple brands manufacture similar items http://www.thermoscientific.com/en/products/co2-incubators.html |
| Laminar Flow hood | Thermo Scientific | 51026651 | Multiple brands manufacture similar items http://www.thermoscientific.com/en/products/biological-safety-cabinets-clean-benches.html |
References
- Wu, D. K., Kelley, M. W. Molecular mechanisms of inner ear development. Cold Spring Harbor perspectives in biology. 4, (2012).
- Shim, K. The auditory sensory epithelium: the instrument of sound perception. The international journal of biochemistry & cell biology. 38, 1827-1833 (2006).
- Van de Water, T., Ruben, R. J. Growth of the inner ear in organ culture. The Annals of otology, rhinology, and laryngology. 83, 1-16 (1974).
- Jacques, B. E., et al. A dual function for canonical Wnt/beta-catenin signaling in the developing mammalian cochlea. Development. 139, 4395-4404 (2012).
- Castellano-Munoz, M., Peng, A. W., Salles, F. T., Ricci, A. J. Swept field laser confocal microscopy for enhanced spatial and temporal resolution in live-cell imaging. Microscopy and microanalysis : the official journal of Microscopy. Society of America, Microbeam Analysis Society, Microscopical Society of Canada. 18, 753-760 (2012).
- Szarama, K. B., Gavara, N., Petralia, R. S., Chadwick, R. S., Kelley, M. W. Thyroid hormone increases fibroblast growth factor receptor expression and disrupts cell mechanics in the developing organ of corti. BMC developmental biology. 13, 6 (2013).
- Appler, J. M., et al. Gata3 is a critical regulator of cochlear wiring. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 33, 3679-3691 (2013).
- Wibowo, I., Pinto-Teixeira, F., Satou, C., Higashijima, S., Lopez-Schier, H. Compartmentalized Notch signaling sustains epithelial mirror symmetry. Development. 138, 1143-1152 (2011).
- Hashimoto, S., Kato, N., Saeki, K., Morimoto, Y. Selection of high-potential embryos by culture in poly(dimethylsiloxane) microwells and time-lapse imaging. Fertility and sterility. 97, 332-337 (2012).
- Matsuoka, F., et al. Morphology-based prediction of osteogenic differentiation potential of human mesenchymal stem cells. PloS one. 8, (2013).
- Ma, G. F., et al. et al.Transforming growth factor-beta1 and -beta2 in gastric precancer and cancer and roles in tumor-cell interactions with peripheral blood mononuclear cells in vitro. PloS one. 8, (2013).
- Taranova, O. V., et al. SOX2 is a dose-dependent regulator of retinal neural progenitor competence. Genes & development. 20, 1187-1202 (2006).
- Chen, P., Segil, N. p27(Kip1) links cell proliferation to morphogenesis in the developing organ of Corti. Development. , 1581-1590 (1999).
