Summary
Eldeki gelişimsel süreçleri on gün içinde bir zamansal degrade üzerinde çalışacak, çünkü embriyonik memeli Kokleanın Canlı görüntüleme zordur. Burada beş gün boyunca bir floresan raportör fare alınan embriyonik koklear eksplant doku görüntüleme sonra kültürleme ve için bir yöntem mevcut.
Abstract
Burada canlı embriyonik fare koklear eksplantlannın uzun vadeli time-lapse görüntüleme için bir yöntem mevcut. Yaklaşık on gün boyunca memeli koklea gelirlerinin son derece düzenli, kompleks bir yapı oluşturmanın sorumlu gelişimsel programı. Bu süre boyunca gen ifadesindeki değişiklikler ve farmasötik veya genetik manipülasyona tepkilerini incelemek amacıyla, uzun dönemli görüntüleme gereklidir. Daha önce, canlı görüntüleme tipik olarak, standart bir mikroskop üzerinde bir nemlendirilmiş oda içinde Çıkarılan dokunun yaşayabilirliği ile sınırlandırılmıştır. Nem ve sıcaklık açısından Kültür büyümesi için gerekli ideal koşulları altında güçlüğü görüntüleme deneyleri uzunluğuna sınırları vermiştir. Değiştirilmiş bir doku kültürü inkübatör entegre bir mikroskop uzun vadeli-canlı görüntüleme için mükemmel bir ortam sağlar. Bu yöntemde biz embriyonik fare koklear eksplantlar kurmak nasıl ve zaman atlamalı IMAGI yapmak için bir inkübatör mikroskop nasıl kullanılacağını göstermektedirng 5 gün boyunca tipik embriyonik gün (E) 13 koklear çıkarılması ve Sox2, koklea prosensory hücrelerin bir göstergesi, davranışını incelemek için parlak bir alan ve floresan mikroskopi her ikisini de kullanarak.
Introduction
Memeli salyangozunun bir çok sipariş karmaşık bir organdır. Fare, doğum sonrası erken aşamalarında otik gün E11 üzerinde vezikül ve gelişimsel programın tamamlanmasından itibaren ilkel iç kulağın ortaya çıkması arasında, hücre sinyal birden dalgaları ve gen ifadesi koordine değişiklikler gerçekleşir. Koklear kanalın doruk tabanından çalışan Corti duyusal epiteli, organ ya da tespit sesidir. Corti organı Kalkınma zarif gelişme sonunda, bu iç saç hücrelerinin tek bir satır oluşacaktır şekilde kontrol edilir, dış saç hücrelerinin üç sıra destek hücrelerin beş satır (sütun hücrelerin iki satır, üç serpiştirilmiş Deiters 'hücrelerin satır) 1. , Işitme kaybı oluşumu ve duyusal epithemlium 2 desenlendirme kesitler studye önemini heighlighting Bu kesin emir sonuçlarından sapma.
Embriyonik fare Coch in vitro kültür içindelea Corti organı gelişme mekanizmaları eğitim önemli bir araçtır. Bu teknik 1974 yılında kurulmuş ve son 40 yıldır, duyusal epitel belirtilen ve Corti organı 3 kurulduğu tarafından mekanizmaların birçok aydınlatmak için kullanılır olmuştur. Cochlea dinamik gelişim süreçleri ile karmaşık bir organdır; yedi gün 1 tezahür olarak bir manipülasyon olarak uzun sürebilir. E13 bir koklear eksplant kültürü için GSK, 3β inhibitörlerin eklenmesi, örneğin,, en uygun kuluçka süresi bileşiğinin güçlü bir etkisi altı gün 4 gözlemlemek.
Gelişmekte Kokleanın Canlı görüntüleme Corti organı morfoloji değişiklikleri soruşturma verir, gen ifadesi değişiklikleri, göç ve izleme çoğalan veya hücreleri ölüyor, ve gerçek-zamanlı ilaç ajanların sonuçlarının gözlem ve sinyalizasyon bozulması sağlar yollar. Şimdiye kadar, Kokleanın Canlı görüntülemeyeağırlıklı olarak kısa süreler 5-8 üzerinde Corti organı görüntü küçük alanlarda konfokal mikroskopi kullanılarak gerçekleştirilen, ancak bu tekniğin eksplant canlılığı nedeniyle sınırlamalar sahiptir. Yavaş gelişim süreçleri uzun süreli manipülasyon etkilerinin görüntülemede, görüntüleme ortamında çok önemlidir. Tipik bir konfokal canlı görüntüleme sistemi mikroskop oturur nemlendirilmiş bir plastik kutu kullanır. Isı ve nem gibi objektif veya ışık kaynağı olarak eklemli açıklıklar içinden ve microscope- çeşitli parçaları etrafında boşluklar aracılığıyla, erişim pencerelerden, mikroskop tablo uygun kuluçka kutusuna boşluklar kaçabilir. Bu fazla iki veya üç gün boyunca sağlıklı eksplantlarını korumak için optimal değildir.
Biz standart bir CO 2 inkübatör içinde mühürlü bir ters mikroskop yerine mikroskop etrafında inşa edilen bir inkübatör olarak 'inkübatör mikroskop' tanımlar. Bir inkübatör mikroskop exDeneyin ömrünü uzatmaktadır yerine, iki veya üç gün boyunca görüntüleme daha, örnekler iki haftaya kadar süre için görüntülü şekildedir. Bir inkübatör mikroskop kültürleri ve standart kontrollü koşullar eksplantasyona minimal rahatsızlık, hücre büyümesi ve farklılaşması için mükemmel bir ortam sağlar. Birden fazla gün içinde yer alan çalışmalarda inkübatörden çıkardıktan ve bir ters flüoresan mikroskop bunları taşıyarak günlük olarak görüntüleme örneklere başvurmak olağandır. Bu yaklaşım işe iken, inkübatör bulaşıkları kaldırma duyarlı gelişmekte olan doku üzerinde stres uğratan. Nedeniyle inkübatörden çıkarıldıktan için sıcaklık kültürleme orta ve dalgalanmalar asit değişiklikleri optimal gelişim ve sağlıksız dokuya neden olabilir. Aynı odak düzlemi ve her zaman noktasında aynı yönde aynı bölgeyi görüntüleme son derece zordur. Bir inkübatör içinde otomatik bir sistem kullanılarak, sağlıklı sağlamak mümkündürdoku, daha fazla zaman noktalarında görüntüleri toplamak ve aynı alan her karede yakalanmasını sağlamak için. Son yıllarda birçok entegre mikroskop doku inkübatör, geliştirilen bu klinik pratikte 9 değil aynı zamanda kök hücre ve kanser araştırmalarında 10,11 değil sadece yararlı olmuştur.
Burada embriyonik fare koklear eksplantlannın uzun vadeli canlı görüntüleme için bir protokol mevcut. Biz set zaman noktalarında çoklu numunelerin görüntüleri yakalamak için kapasitesine sahip standart bir CO 2 inkübatör içinde otomatik bir mikroskop sistemi kullanın. Sistem, bir kuluçka makinesi içine yerleştirilmiş ters çevrilmiş bir mikroskop oluşur. Numuneler, her bir zaman noktasında çok sayıda örneğin görüntüleme sağlayan döner bir kürsü yerleştirilir. Aydınlatma, görüntü yakalama ve kürsünün dönme Metamorph yazılımı aracılığıyla işletilen otomatik bir sistem tarafından kontrol edilir. Işletim yazılımı kullanarak bir görüntüleme rutin ayarlayarak biz tw kadar aday için bir deney ayarlayabilirsinizen az insan müdahalesi ile o hafta. Bu örnekte biz özellikle büyük ölçekli büyüme ve koklea yeniden düzenlenmesini ve, prosensory bölgeyi göstermek için hem parlak bir alan ve floresan kullanın. Bu deneyde, cochleae. Embriyonik gün E13 üzerinde Sox2 EGFP muhabiri fareler disseke edilecektir In vitro kültürler kurulacak ve daha sonra beş gün içinde görüntülendi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Fare doku korunur ve laboratuvar hayvanlarının bakımı ve kullanımı için Hayvan Bakımı kurallar üzerinde Kanadalı Konseyi çerçevesinde ötenazi farelerde 12 -reporter Sox2 EGFP hasat edildi.
1. Kültürleme Embriyonik Cochleae
- 8.89 mL DMEM, fetal sığır serumu ve 1 ml (FBS), 100 x N2 ek 100 ul ve / ml siprofloksasin, 10 mg, 10 ul karıştırılarak Dulbecco Modifiye Eagle ortamı (DMEM) Supplement. % 100 HEPES, 5 ml ile 495 ml HBSS karıştırılmasıyla Hank Dengeli Tuz Solüsyonu (HBSS), Supplement.
- Cam alt kültür yemekleri hazırlayın:
- Bir laminar akış başlığı içinde, 5 ml DMEM içinde 200 ul bazal membran ekstraktıdır alt-tabakanın yeniden süspanse edin. 10 mm kuyu ile 35 mm çapındaki cam alt kültür yemekleri hazırlayın. Her cam merkezi için pipet 150 ul alt tabaka / DMEM dipli çanak. Bu yemekler 40 dakika inkübe edildikten sonra kullanılabilir, veya bir CO 2 depolanabilir NOT: çanak taban şeffaf ve görüntüleme için uygun olduğundan emin olmak için, iyi eksplantlar nihayet kolayca bulunduğu alanda yerleşmek için izin verir ve yemeğin ortasında bir oluşturmak için: Cam yemekler aşağıdaki nedenlerle kullanılır dipli bu nedenle, bir deneyden sonra numune immüno-boyama ve bir sonraki analiz için işlenebilmesidir.
- Iş istasyonu ve araçları hazırlayın:
- Laminer akımlı temiz tezgah açın ve temiz bir çalışma alanı oluşturmak için% 70 EtOH ile aşağı püskürtün. % 70 EtOH (madde (1 kısım) ve kömür tozu (2.5 g), sertleştirme 184 silikon elastomer (10 kısım) bir karışımı) forseps, kaşık ve siyah 184 silikon elastomer çanak bekletin.
- Temiz çalışma istasyonu, deney için hasat embriyolar. Soğuk HBSS% 1 HEPES buz uygun gebeliğin embriyolar toplayın.
- Göstereceğiz harici veya görünür organını belirleyinmuhabir aktivitesi ve bir floresan stereo mikroskop kullanılarak embriyolar inceleyin. Deneyin konusu bu olarak% 1 HEPES ile takviye edilmiş olan, soğuk HBSS buz reporter aktivitesini sergileyen embriyolar toplayın.
- Zamansal kemikleri toplayın:
- Serin bir ışık kaynağı ve ince forseps kullanarak, hızlı bir çalışma, yavruların kafalarını toplamak. Temporal kemiklerin zarar görmesini önlemek için servikal omurlar seviyesinde ve çene altında klibi için özen gösterin.
- Dikkatle kafatası açın. , Beyin çıkarın başının ön keserek ve temiz bir tabak% 1 HEPES taze buz HBSS'nin için arka kafatası aktarın. Dikkatle inceliğini vestibüler sistemin tutmaya özen fıstık şeklindeki zamansal kemikleri teşrih.
- Kokleayı ayır:
- Soğuk HBSS,% 1 HEPES, buz içerisinde siyah bir silikon elastomer kaplı tabak ve temporal kemik transfer kemik vestibüler bölgesini pin. Böcek işaretçilerine takıntemporal kemik stabilize ve forseps için bir oda oluşturmak için bir eğik açı. Temporal kemik bir sağlam koklea hasat etmek çok zordur çok fazla hareket etmesine imkân tanınır gibi Sabitleme sürecinde çok önemli bir adımdır.
- Dikkatle kokleayı çevreleyen kıkırdak çıkarın. Koklea tabanının dış kenarında kıkırdağa forseps bir dişe yerleştirin ve kıkırdak içine bir delik klip.
- , Yan bir kapağını Clip forseps tine yerleştirin ve yavaşça kıkırdaktan kanalının çatı ayırın. Çapraz ve üst kısmında yatay Klip ve dikkatle kapsülün ön kısmını kaldırın. Kalan kıkırdak ve kanal arasında forseps bir ucu yerleştirin ve yavaşça son bölümü off klibi. Kokleanın apikal yüzeyi artık maruz kalmaktadır.
- Üssünde başlayan, kanalın çatı koklear epitel karşılayan alanını yakalamak ve koklear kanalı açın. Yavaşça kırparak, çatıdan soymagerektiğinde tamamen kaldırılana kadar. Kanalın medial tarafında sol zarın herhangi bölümlerini keserek. Aşırı mezenkimal doku kanalı temizleyin ve vestibüler sistemden kanalı ayırmak.
- Kültür, eksplantlar:
- Dikkatle, bir alt tabaka kaplanmış cam alt kültür çanak merkezinde, bir eksplantın, lümen yüzeyi yukarı bakacak şekilde yerleştirin sıvının tüm kapalı çizmek ve iki dakika bekletin. Onu rahatsız etmemek için özen DMEM damla-bilge eksplantasyona takviye 150 ul ekleyin. Eksplant, serbest yüzer forseps ile yeniden konumlandırmak, ancak yüzeye tutunur, böylece eksplant yemeğin altına yerleşir dikkat etmelisiniz.
- Nem elde etmek için steril su içinde küçük bir tabak, derin bir 12 cm çaplı bir petri tabağına cam alt yemekler yerleştirin. Gece boyunca eksplant substrata yapışır ve düzleştirmek için sırayla 35 ° C inkübatör içinde kültürleri koyun.
2. Canlı Imaging
- Eksplant örnekleri seçin. Her Eksplante cochlea'nın durumunu değerlendirmek için bir floresan stereo mikroskop kullanın. Kanal bozulmamış ve doruk tabanından camına yapışarak burada sadece eksplantlarını seçin.
- Kültür koklear dokuya% 5 CO2 ile 35 ° C'de kuluçka ayarlayın. Inkübatör mikroskop içine kültürleri koyun:
- Yavaşça takviye DMEM aspire ve en az 500 ul taze medya ile değiştirin. 6 gün kadar görüntüleme için 1-1.5 ml iyidir. Eksplantlar gevşek bir şekilde bağlı olması halinde, çanak kenarı etrafında ortamın bir halka pipetle. Bu matrise eklemek için devam ederken bu ekstra sıvı eksplant bozmadan bir minyatür 'nemlendirilmelidir odasını' yapacak.
- Alternatif olarak, kullanım reaktifler görüntü koleksiyonları arasında aralıklarla sırasında değiş tokuş gerekiyorsa çanak mikroskop kendi uydurma kalır iken çanak kapaklarını açmak için kapakları menteşeli. Menteşeli çanak kapakları kapakları olmasına izinörnekleri rahatsız ya da ayarlarından yemekleri çıkarmadan açıldı. Bu sonraki görüntü yakalar için onların tam konumunu sürdürmektedir.
- Numune çanak tutucu içine uygun örneklerini içeren cam alt yemekleri yerleştirin. Bu örnekte mikroskop sekiz 35 mm numune yemekler sahip dönüşlü bir platform bulunmaktadır.
- Laminer akış kaputun altında cam kapaklı plastik kapaklarını değiştirmek ve numune çanak tutucu içine yemekleri yerleştirin. Yemeğin altından eksplantlarm çıkarmak için ya da medyayı rahatsız değil inkübatör alarak bakımı içinde örnek çanak tutucu yerleştirin.
- Yavaşça takviye DMEM aspire ve en az 500 ul taze medya ile değiştirin. 6 gün kadar görüntüleme için 1-1.5 ml iyidir. Eksplantlar gevşek bir şekilde bağlı olması halinde, çanak kenarı etrafında ortamın bir halka pipetle. Bu matrise eklemek için devam ederken bu ekstra sıvı eksplant bozmadan bir minyatür 'nemlendirilmelidir odasını' yapacak.
- Görüntüleme rutin ayarlayın:
- Mikroskop, UV lamba ve fotoğraf makinesini açın ve görüntüleme yazılımını açın.
- , Örnekleri bulun sırayla her yemek için pozlama süreleri, bir görüntüleme alanı seçin odak düzlemi ve ayarlayın. Odak başlama zamanında eksplant görünüme sadece bağlı düzlemini seç, ancak Elböylece doku nasıl hareket edeceği ve zaman ders çalışacağını ne kadar göz önünde.
- Floresan kanal seçilen odak düzlemi etrafında yoğunlaşan Z yığını ayarlayın. Deney için numune alma sıklığını ve uzunluğunu ayarlayın. Örnekleme sıklığı, görüntüleri toplamak için gereken zaman ile sınırlı olacak, bu yüzden bu görüş alanları seçme ve Z yığın ayarlandıktan sonra tespit edilmelidir. Bu durumda örnekleme beş gün boyunca her 30 dakikada bir gerçekleşir. Deney süresi 14 güne kadar olabilir.
- Bir film oluşturmak:
- Zaman atlamalı döneminin sonunda görüntü dosyalarını açmak. Ardışık toplama noktaları açar, bu durumda Metamorph yazılımı kullanılmaktadır. Kare kare ilgi hücre popülasyonu gösteren en iyi odak düzlemi seçin.
- Bir avi dosyası bu görüntüleri dönüştürmek, ya da birden fazla forma açıldı ve analiz görüntü işleme yazılımı veya dönüştürülebilir görüntülerin bir dizi oluşturmak için bir montaj olarak bunları ihraçvideo işleme yazılımı kullanarak ts.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Burada bir montaj (Şekil 1) ve E13.5 üzerine kaplama eğer tipik bir organotipik koklear eksplant büyüyecek nasıl gösteren bir film (Şekil 2) göstermektedir. Bir Sox2 raportör fare prosensory bölge görselleştirmek için kullanılmıştır. Film koklea büyüme ve yakınsama ve uzantısı uğradığını göstermektedir, yeşil Sox2 etki lateral bölgede hücreler genişler çevreleyen doku olarak bölmek için görünmüyor. Bu Corti organı karakteristik bir özelliğidir; E13 üzerindeki muhtemel duyusal epitel hücre döngüsünü çıkar ve takiben çoğalma 13'ün bölgesi olarak bilinir. Farklı bir koklear eksplant orta tabanı (Şekil 3 ve 4) uzanır gibi, prosensory bölge daraltır gösteriyor odaklanma ikinci time-lapse deney. Kültür içinde üç gün sonra doku o Indivi görselleştirmek için mümkün olduğu ölçüde bu yassı unutmayınÇift floresanlama hücreleri, başında nedeniyle doku kalınlığına ışığın iç yansıma mümkün ifadenin bölgelerini ancak bireysel değil hücreleri belirlemek için yapmak bölgeler vardır oysa.
Şekil 1:. Zaman - beş gün boyunca toplanan Sox2 muhabiri koklear doku atlamalı görüntüleri Bu montaj eksplant büyüme sıfır gününde başlayan ve 10X objektif kullanılarak her 30 dakikada bir örnekleme, günde beş biten bir ilerleme gösterir. Eksplant E13 üzerinde kurulmuş ve görüntüleme önce gece boyunca kültüre edildi. Eksplant onu olgunlaştıkça hem büyür ve yakınsak uzatma hareketleri uğrar. 12 saat aralıklarla koklear büyüme boyutlarını gösteren (A) Sıralı görüntüler. Görünür ışık kanal GFP floresan geni ile kaplanmıştırEGFP Sox2 muhabiri tarafından derecelendirildi. (B) GFP floresan kanal sadece. Ölçek çubuğu 200 mikron karşılık gelir. Bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2 :. 5 gün boyunca toplanan Sox2 muhabiri koklear dokusunun Time-lapse animasyon Bu Şekil 1'de gösterildiği aynı eksplant deneydir, bu zaman çerçevesi 5 gün boyunca 30 dakika aralıklarla seçilmiş ve üretmek için bir avi dosyası olarak birleştirilir film.
Şekil 3:. Orta taban CE hareketleri geçiyor ve düzleştirme Sequentiorta tabanın prosensory epitel (EGFP) sınırlandırdığına uzanır ve 5 gün boyunca düzleştirir olduğunu gösteren diğerleri görüntüler. Oklar daralan bölge göstermektedir. 10X objektif kullanılarak, 12 saat aralıklarla 5 gün time lapse dizisi seçilen Çerçeveler. Ölçek çubuğu 200 mikron karşılık gelir. Bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 4 :. orta tabanı CE hareketleri geçiyor ve düzleştirme Hareketli time-lapse dizisi yakınsaması ve 30 dakika aralıklarla seçilen kare ile Şekil 3'te gösterilen duyusal epitel uzantısı gösteren Time-lapse animasyon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kültürler kurulur ve uzun vadeli görüntüleme için sırayla time-lapse mikroskop kurma zaman dikkate alınması gereken birkaç teknik nokta vardır.
Bu koklear eksplantların kültürlenmesiyle için bir alt tabaka olarak temel membran matrisi, ancak alt-tabaka, hücre tipi için uygun olmalıdır. Örneğin, görüntü nöron kültürleri ile, bir fibronektin kaplamasının temin edilmesi için daha iyi olabilir. Kuluçka sıcaklık ve gaz bileşimi, aynı zamanda, doku tipine bağlı olarak seçilmelidir. Eksplant yaşı seçimi önemlidir. E12 üzerinde büyüme yönü daha az tahmin edilebilir çünkü erken E13 başlayacak. Bu eksplantlar yüzeye bağlamak için gece boyunca kültürlü olması esastır gibi, deneyler ertesi gün başlamak için planlanmalıdır. Bir deneme E15 ya da daha büyük başlaması isteniyorsa, kültürler, doku düzleştirir ve böylece hücrelerin görüntü daha kolay yayılan zamanla olarak E13 üzerine kurulmalıdır (bakınız Şekil 3). Corti organ yansıması için, bu koklea çok dikkatle kesilmiştir esastır. Eksplant lateral kenarında çentik salyangoz görünümü dışında, ilgili bölgeyi taşıyabilir protrusion.This uzantı şeklinde bir 'V' oluşturan gözyaşı yoluyla hücrelerin dökülme 'morfolojik düzenlenmeleri maruz dolayısıyla zaman, doku iç gerilim kırılmasına . Buna ek olarak, bakım mümkün medial yan kanal çatısının kadar ortadan kaldırmak için dikkat edilmelidir. Bu doku eksplant genişler ve görünümünden obscuring ilgi bölgenin üstünden büyüyebilir olarak çoğalmaya devam ediyor.
Görüntüleme rutin kurarken, koklea morfolojisi büyüme ve değişiklikler dikkatlice ele alınmalıdır. Hedef bölgenin büyüklüğü yansıması için değil, aynı zamanda bu bölge hareket genişletildiklerinde olup olmadığını dikkate alınarak göre seçilmelidir. Orta bölümünde hücrelerböylece yüksek bir büyütme (20X, 40X, 60X) kullanılabilir koklea (Şekil 1 ve 2) böl ve sınırlı bir alanda hareket, bir. Eksplant büyüdükçe Corti veya yanal epitelin organ hücreleri Ancak, hareket edecektir; hücreler görüş alanında kalır başarı oranı çok yüksektir gibi bir düşük büyütme (10X ya da 20X), daha iyidir. Kokleanın sabit bölgelerinin Görüntüleme yüksek büyütme mümkündür. Biz bütün eksplant göstermek istediği için temsili sonuçlar bölümünde bir 10X objektif kullanmayı seçti ve doku hareketi erken dönemlerinde dinamik çünkü.
Dikkate yanındaki odak düzlemi olduğunu. Eksplant dışa büyüyecek ve dümdüz olacak düşünüldüğünde, odak düzlemi süresi boyunca önemli ölçüde değişecektir olasıdır. Ilgi bölgesi Corti veya lateral epitel organı, bu tahmin ve yardımcı olabilir eksplant dışına göç eden hücreler üzerinde duruluyor ise. Bu, el olduğuböylece alt büyütme hedefleri kullanarak bir argüman. Bu floresan ve DIC hem de Z yığınları ayarlamak mümkündür. Ilgi hücreleri son adım kapak cam düzleminde, özellikle de bu karşı olabilir adım başı 3-5 mikron Z yığını kurma, odak dışında hareket olasılığı varsa. Bu hücrelerin paketleme yoğunluğu gibi, günün birinde kültürleri izlerken doğru uçağı seçmek zor olabilir ve net bir görüş önleyebilir çevreleyen dokudan yansıyan ışığı olabilir. Daha sonra bir film ya da montaj oluşturmak için kareleri incelerken, Z-uçakları dikkatli seçilmesi de üç boyutlu hücre hareketlerinin izlenmesine olanak sağlar. Deney numune aralığının dışında hareket ederse odak ayarlarını yapmak için herhangi bir noktada durdurulmuş olabilir.
Bir hafta boyunca koklear eksplant Canlı görüntüleme konfokal canlı görüntüleme tamamlayacak Kokleanın gelişimini anlamak için yeni bir boyut ekler. Bu geniş, uzun, organ kullanmak için mükemmel bir yöntemdir-vadedeki muayene yapılması gereklidir, ancak kısa vadeli tek bir hücre çalışmaları için yüksek büyütme confocal görüntüleme yerine geçmez. Tekniğin seçimi, görüntülenecek doku türüne ve deney bağlamında bağlıdır. Bu teknik, araştırmacılar, gerçek zamanlı olarak raportör gen ekspresyonu, hücre proliferasyonu ve göçünde uzay-zaman değişiklikleri incelemek ve daha önce mümkün olandan daha ayrıntılı olarak hücrelerin farmasötik maddeler ve canlılığı için raportör gen cevabın çalışma olanak sağlayacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Yararlı yorumlar ve yapıcı tavsiye için üç anonim yorumcular teknik yardım için Willy Güneş ve Dr. Kris Gellynck için teşekkür ederiz. Bu çalışma Sunnybrook İşitme Yenilenme Girişimi tarafından finanse edildi
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle media | Gibco | 12430 | Multiple brands manufacture this |
| Basement membrane extract | Corning | 354230 | Matrigel. Alternative similar products are available from other suppliers. http://catalog2.corning.com/Lifesciences/en-US/Shopping/Product.aspx?categoryname=Cell+Culture+and+Bioprocess%28Lifesciences%29|Extracellular+Matrix+Proteins+ECMs+and+Attachment+Factors%28Lifesciences%29|Matrigel+Basement+Membrane+Matrix+%28Lifesciences%29 |
| Fetal bovine serum | Gibco | 16000044 | Multiple brands manufacture this http://www.lifetechnologies.com/search/global/searchAction.action?query=fbs&resultPage=1&results PerPage=15&autocomplete= |
| HEPES | Gibco | 5630080 | Multiple brands manufacture this http://www.lifetechnologies.com/search/global/searchAction.action?query=hepes&resultPage=1&results PerPage=15&autocomplete= |
| 100 x N2 supplement | Gibco | 17502-048 | Multiple brands manufacture this http://www.lifetechnologies.com/search/global/searchAction.action?query=n2&resultPage=1&results PerPage=15&autocomplete= |
| Ciprofloxacin | Sigma Aldrich | 17850-5G-F | Multiple brands manufacture this http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/17850?lang=en®ion=CA |
| Hank's balanced salt solution | Gibco | 14170161 | Multiple brands manufacture this. Should be refidgerated before use. http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/life-science/cell-culture/mammalian-cell-culture/reagents/balanced-salt-solutions/hbss-hanks-balanced-salt-solution.html?s_kwcid=AL!3652!3!26107410508!e!!g!!hbss&ef_id=xoFOglw2s UMAAMU8:20140228185720:s |
| Fine Forceps | Fine Science tools | 11254-20 | Size number 5 http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=350&CategoryId=29 |
| Curette | Fine Science Tools | 10080-05 | size 1 mm http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=91&CategoryId=118 |
| Insect Pins | Fine Science Tools | 26001-35 | Must be stainless Steel http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=124 |
| 50 mm plastic dishes | Corning/Falcon | 351006 | Multiple brands manufacture this |
| charcoal | Sigma Aldrich | 05105-250G | Multiple brands manufacture similar items http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/05105?lang=en®ion=CA |
| 184 silicone elastomer | Dow/Corning | SYLGARD® 184 SILICONE ELASTOMER KIT | Dishes are home made several weeks in advance. Silicone elastomer can be from any supplier.http://www.dowcorning.com/applications/search/products/Details.aspx?prod=01064291 |
| Glass bottom dishes | MatTek | P35G-0-10-C | The dimensions of the dish are determined by the specifications of the imaging system. 35 mm diameter, 10mm well, number 0 coverslip fits Olympus Vivaview FL. http://glass-bottom-dishes.com/catalog/index.php?main_page=product_info&cPath= 1_4_15&products_id=2 |
| Stereomicroscope | Zeiss | 495101-9804-000 | Stemi 2000 model. multiple brands manufacture similar items http://microscopy.zeiss.com/microscopy/en_de/products/stereo-zoom-microscopes/stemi-2000.html |
| Cold Light Source | Zeiss | 000000-1063-182 | Multiple brands manufacture similar items http://microscopy.zeiss.com/microscopy/en_de/products/microscope-components/lightsources.html |
| Fluorescent Stereomicroscope | Leica microsystems | Contact Leica microsystems | Leica M165-FC. Multiple brands manufacture similar items http://www.leica-microsystems.com/products/stereo-microscopes-macroscopes/fluorescence/details/product/leica-m165-fc/ |
| Incubator Microscope +imaging software | Olympus | Contact Olympus | Inverted microcope sealed inside a Co2 incubator. Vivaview FL incubator microscope with proprietry Metamorpoh imaging software. http://olympuscanada.com/seg_section/product.asp?product=1055&c=0 |
| Clean bench | Thermo Scientific | 51029701 | Multiple brands manufacture similar items http://www.thermoscientific.com/en/product/heraguard-eco-clean-bench.html |
| CO2 incubator | Thermo Scientific | 3310 | Multiple brands manufacture similar items http://www.thermoscientific.com/en/products/co2-incubators.html |
| Laminar Flow hood | Thermo Scientific | 51026651 | Multiple brands manufacture similar items http://www.thermoscientific.com/en/products/biological-safety-cabinets-clean-benches.html |
References
- Wu, D. K., Kelley, M. W. Molecular mechanisms of inner ear development. Cold Spring Harbor perspectives in biology. 4, (2012).
- Shim, K. The auditory sensory epithelium: the instrument of sound perception. The international journal of biochemistry & cell biology. 38, 1827-1833 (2006).
- Van de Water, T., Ruben, R. J. Growth of the inner ear in organ culture. The Annals of otology, rhinology, and laryngology. 83, 1-16 (1974).
- Jacques, B. E., et al. A dual function for canonical Wnt/beta-catenin signaling in the developing mammalian cochlea. Development. 139, 4395-4404 (2012).
- Castellano-Munoz, M., Peng, A. W., Salles, F. T., Ricci, A. J. Swept field laser confocal microscopy for enhanced spatial and temporal resolution in live-cell imaging. Microscopy and microanalysis : the official journal of Microscopy. Society of America, Microbeam Analysis Society, Microscopical Society of Canada. 18, 753-760 (2012).
- Szarama, K. B., Gavara, N., Petralia, R. S., Chadwick, R. S., Kelley, M. W. Thyroid hormone increases fibroblast growth factor receptor expression and disrupts cell mechanics in the developing organ of corti. BMC developmental biology. 13, 6 (2013).
- Appler, J. M., et al. Gata3 is a critical regulator of cochlear wiring. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 33, 3679-3691 (2013).
- Wibowo, I., Pinto-Teixeira, F., Satou, C., Higashijima, S., Lopez-Schier, H. Compartmentalized Notch signaling sustains epithelial mirror symmetry. Development. 138, 1143-1152 (2011).
- Hashimoto, S., Kato, N., Saeki, K., Morimoto, Y. Selection of high-potential embryos by culture in poly(dimethylsiloxane) microwells and time-lapse imaging. Fertility and sterility. 97, 332-337 (2012).
- Matsuoka, F., et al. Morphology-based prediction of osteogenic differentiation potential of human mesenchymal stem cells. PloS one. 8, (2013).
- Ma, G. F., et al. et al.Transforming growth factor-beta1 and -beta2 in gastric precancer and cancer and roles in tumor-cell interactions with peripheral blood mononuclear cells in vitro. PloS one. 8, (2013).
- Taranova, O. V., et al. SOX2 is a dose-dependent regulator of retinal neural progenitor competence. Genes & development. 20, 1187-1202 (2006).
- Chen, P., Segil, N. p27(Kip1) links cell proliferation to morphogenesis in the developing organ of Corti. Development. , 1581-1590 (1999).
