Summary
At studere de tidligste begivenheder af præneoplastiske celle progression og medfødte immunforsvar interaktion celle er afgørende at forstå og behandle kræft. Her beskriver vi en metode til betinget fremkalde epitelcelletyper transformationer og den efterfølgende live-billeddannelse af medfødte immunforsvar interaktion celle med HRAS G12V udtrykker hudceller i zebrafisk larver.
Introduction
Overvækst af en afkom præneoplastiske celle i en ellers normal epitelial ark stærkt afhængig af et samspil med dens mikromiljø. Samspillet med sin vært væv vil sandsynligvis være den afgørende faktor for, om en præ-neoplastisk celle er i stand til at etablere en klonal niche til at videreudvikle sig til en fuldstændig blæst kræft. På trods af sin betydning i udviklingen, denne første fase af cancer progression er utilgængelige i de fleste almindeligt anvendte modelsystemer, in vivo.
Zebrafisken, Danio rerio, er en veletableret model organisme for levende billeddiagnostiske undersøgelser på grund af sin gennemsigtighed udvikling, muligheden for genetisk manipulation, og tilgængelighed for vandopløselige stoffer. Nylige undersøgelser ved hjælp af en larve zebrafisk model, overudtrykker den humane onkogen HRAS G12V at transformere epitelceller, viste, at værtscelle afledt signaler, især H 2 O 2 fører tilrekruttering af medfødte immunceller. Interessant, de rekrutterede immunceller, neutrofiler og makrofager, viste sig at have en trofisk rolle i at støtte præneoplastiske celleproliferation 2,3.
For at forstå de tidlige begivenheder af tumor initiering og progression samt indskud af et inflammatorisk respons, er man nødt til at være i stand til at afbilde disse begivenheder fra det tidligste tidspunkt og fremefter. Det er derfor nødvendigt at kontrollere celle transformationer i en tidsmæssig og vævsspecifik måde. Vi udnytter Gal4 / UAS system, der er med succes blevet tilpasset fra Drosophila 4 til betinget udtrykke den menneskelige onkogen HRAS G12V under kontrol af huden promotor keratin 4 (krt4) 5. Den modificerede version af den transskriptionelle aktivator Gal4, nemlig KalTA4 6, muliggør ekspression af HRAS G12V under kontrol af den opstrøms aktiverende sekvens (UAS). Om betinget inducere transkriptionsaktivator udtryk har KalTA4 blevet fusioneret til mutant ligand-bindende domæne af den humane østrogen-receptor α (ER T2) 7, som binder specifikt 4-hydroxytamoxifen (4-OHT) 1. I fravær af 4-OHT ER T2 er bundet i cytoplasmaet af varmechokproteiner. Ved 4-OHT binding af varme-shock-proteiner dissocierer, hvilket tillader en nuklear translokation af KalTA4-ER T2 og efterfølgende aktivering af UAS kontrollerede gen af interesse 8 (figur 1C, b). Da dette ekspressionssystem afhænger af tilstedeværelsen af 4-OHT, den KalTA4 kontrolleret ekspression af et gen af interesse er reversibel. I modsætning til den Cre-ER T2 / Lox-system, hvilket fører til en irreversibel rekombination omstændigheder induktion af transkriptionel aktivering med KalTA4-ER T2 er reversibel ved tilsætning eller fjernelse af 4-OHT.
Følgende protokol allo ws en betinget transformation af hudceller i zebrafisk larver og en efterfølgende kontrol af samspillet med medfødte immunceller ved fluorescerende protein udtryk. De grundlæggende metoder, der anvendes i denne protokol ligner nogle almindeligt anvendte teknikker inden for zebrafisk samfund 9-13.
Frembringelsen og kombinatoriske anvendelse af transgene linier sammen med mikroinjektion af transgene konstruktioner muliggør en forbigående tilgang til kun at transformere enkelte celler i en mosaik måde. Ilt permeabilitet embryonale og larver zebrafisk hud rejser muligheden til tidsforskudte levende billeddiagnostiske undersøgelser foretaget af høj opløsning mikroskopi fra timer til dage. Desuden vil dens tilgængelighed for vandopløselige stoffer tillade fremtidige mekanistiske undersøgelser og overvågning af cellebiologiske hændelser in vivo, som kunne føre til en bedre forståelse af de tidligste stadier af kræft udvikling.
_content "> Denne protokol kan tilpasses til at udføre betinget genekspression i hvilket som helst væv af interesse i zebrafisk larver i en mosaik måde. Man kan også optimere mikroskopet indstilling for at leve billedet dybere end huden væv.Protocol
De følgende eksperimentelle procedurer blev udført i nøje overensstemmelse med Dyr (Videnskabelige procedurer) Act 1986.
1. Fremstilling af plasmid-DNA til mikroinjektion
- Oprens plasmidet pTol2-krt4: KalTA4-ER T2; cmlc2: eGFP med et kommercielt plasmid DNA oprensningskit ifølge producentens anvisninger og fortyndes plasmid-DNA'et til en endelig stamopløsning koncentration på 100 ng / pl.
- Linearisere transposasen indeholdende plasmid pT3TS / Tol2 14 af BamHI restriktionsspaltning efter producentens protokol. Dette trin kan udvides natten over. Udfælde lineariseret DNA med en phenol / chloroform-ekstraktion efter standardprotokol.
- In vitro transskribere transposasen mRNA fra det lineariserede plasmid med et kommercielt transskription kit til store mængder af udjævnede RNA i overensstemmelse med producentens anvisninger, fortynde og prøve aten endelig stamopløsning koncentration på 100 ng / pl i nuclease-frit vand. Sikre kvaliteten af det oprensede RNA med en nativ 1-2% TAE (40 mM Tris, 20 mM eddikesyre, 1 mM EDTA) agarosegelelektroforese (80-120 V). Opbevar RNA ved -80 ° C.
2. Mikroinjektion af plasmid-DNA for Transient Gene Expression
- Forbered en agarose indsprøjtning plade til at holde de befrugtede æg under injektion. Hæld væsken 3% agarose i en 90 mm petriskål. Lad agarose afkøles til 40-50 ° C og tilsæt det kileformede mikroinjektion støber TU-1 på toppen af det flydende agarose. Efter hærdning ved stuetemperatur, lad agarose resten ved 4 ° C i 30 minutter før fjernelse af formen. Store mikroinjektion forme ved 4 ° C og genbrug.
- Forbered en portion af injektionsopløsningen. Udfør følgende trin på is. Pipette 1 pi plasmid-DNA (slutkoncentration på 10 ng / ul), 2 pi transposase mRNA (slutkoncentration 20 ng / pl), 2pi 10 mg / pl rhodamin B isothiocyanat-Dextran, 2 pi 5x Danieau opløsning (290 mM NaCl, 3,5 mM KCI, 2 mM MgSO4, 3 mM Ca (NO3) 2, 25 mM HEPES, pH 7,6) til en slutvolumen på 10 pi i nuclease-frit vand.
- Forbered nåle af borsilikatglas kapillærer med en diameter på 1 mm, der indeholder en indre filament ved at trække den kapillære i modsatte retninger med en mikropipette Puller. Brug følgende program: varme 530, træk 200, hastighed 80 og tid 150.
- Fyld en nål med 2 pi af injektionsopløsningen (holdt på is). Undgå bobler ved omhyggeligt tilbagekalde microloader spids, mens frigive opløsningen i kapillarrøret. Bryde forsigtigt spidsen af nålen med en tang.
- Reguler dråbe størrelse med en pneumatisk pico pumpe. Mål drop diameter / volumen (V = 4/3 πr 3), og juster drop størrelse med en okulær mikrometer under en stereoskop i dimethylpolysiloxan. Vi anbefaler100 um, svarende til 0,5 nl. Dette sikrer ensartede og reproducerbare koncentrationer pr hver injicerede embryon. Den injicerede koncentration titreres og justere for hver konstruktion og plasmidpræparat.
- Placer zygoter (figur 1A) opnået fra en krydsning af Tg (UAS: eGFP-HRAS G12V) io006 15 med Tg (lysC: dsRed2) nz50Tg 16 i formene i injektionspladen ved brug af en 3 ml pastette. I mellemtiden holder spidsen af præ parat kanyle i dimethylpolysiloxan at undgå løsning fra udtørring og koagulation.
- Injicer afmålt dråbe (100 um svarer til 0,5 nl) under en stereoskop gennem chorion i blastocysten 17, før den første spaltning (figur 1A). Injektion i en celle stadiet øger muligheden for en ensartet fordeling af plasmid-DNA og RNA i udviklingslandene cellemasse og mulighed for kønscelleoverførsel. Det erbemærkelsesværdigt, at ekspressionen af konstruktionerne mere ofte tendens til at være mosaik.
3. Betinget hudcelle Transformation med 4-hydroxytamoxifen (4-OHT)
- Overfør de injicerede embryoner i 0.3x Danieau løsning og holde dem ved 28,5 ° C i en inkubator. Fjern ubefrugtede æg fra skålen på sfære stadium 17. Den co-injicerede Rhodamin B isothiocyanat-Dextran kan udnyttes som en injektion-kontrol under en fluorescerende stereoskop.
- Screen embryoner ved 24 HPF (timer efter befrugtning) for hjerte-ekspression af eGFP. Fortsæt med at hæve cmlc: eGFP positive zebrafisk embryoner indtil 72 HPF. Overvåge forsigtigt vand-kvalitet (0.3x Danieau).
- Fjern chorion disse embryoner, der ikke udklækket med pincet på 72 HPF. Poke forsigtigt chorion med 1 pincet og træk det fra hinanden ved hjælp af anden. Vælg embryoner til lysC: dsRed2 udtryk ved hjælp af en fluorescerende stereoskop.
- Tilsæt 10 gl af en 10 mMlager af (Z) -4-hydroxytamoxifen til 20 ml 0.3x Danieau opløsning (endelig koncentration på 5 uM). Brug 4-OHT-induktion-løsning til en standard petriskål (90 mm) på et parti af 40-60 embryoner.
- Overfør embryoner til en ny petriskål indeholdende 20 ml frisk gjort induktion-løsning. 4-OHT skal opbevares og håndteres i mørke. De første tegn på ekspression kan påvises 2 timer efter induktion påbegyndelse. Induktionen-trin kan udvides natten, holde sig for øje, at de første værtscelle: kan præneoplastiske celleinteraktioner allerede forekomme et par timer efter behandlingen.
4. Montering og live Imaging af zebrafisk Larver
- Der fremstilles en 60 mm petriskål ved at indføre et hul med en diameter på 18-20 mm. Brug høj vakuum silicone fedt at dække og forsegle hullet på den ydre bund af petriskålen med en 25 mm dækglas (figur 1B).
- Forbered 1% lavt smeltepunkt (LMP) agarose. Hold en 1,5 ml rørLMP agarose ved 37 ° C i en varmeblok.
- Forvalg Tg (krt4: KalTA4-ER T2, UAS: eGFP-HRAS G12V; lysC: dsRed2) larver for grønt fluorescerende hudcelle og dsRed2 positiv medfødte immun celle udtryk, under en fluorescerende stereoskop. Bedøver larver ved tilsætning af 1 ml 0,4% tricaine 18 til 20 ml induktion opløsning.
- Overfør det forudvalgte larver med en pastette i væsken LMP agarose. Lad larverne synke ned i LMP agarose og overføre dem på dækglasset (figur 1B). Orientere embryoner under en stereoskop. Larverne skal placeres direkte på glasset for at reducere arbejdsafstand (op til 6 larver).
- Dæk LMP agarose med tricaine indeholder induktion løsning efter det er hærdet (figur 1B pil).
- Billede den integrerede larver ved hjælp af en inverteret fluorescerende, laser-scanning eller spinning disk konfokal mikroskop. Brug en 40X eller 63Xobjektiv som mål med lange arbejdsdage afstande muliggør fokus gennem hele larver.
Representative Results
Zygoter af en krydsning mellem Tg (UAS: eGFP-HRAS G12V) io006 og Tg (lysC: dsRed2) nz50Tg blev indsamlet 10-15 min efter befrugtning (figur 1A) for at opnå 1 celle-embryoer. Efter injektion embryonerne er blevet rejst indtil 3 dpf, før induktion med 4-OHT og montering for billeddannelse (figur 1B). 2-6 timer efter induktion de monterede embryoer blev anbragt enten under et inverteret fluorescensmikroskop (figur 2A) eller en inverteret konfokalt mikroskop (figur 2B-C) og afbildet for 2-3 timer med 1,5 minutters intervaller. Præneoplastiske overfladiske hudceller kan identificeres ved deres mere afrundet morfologi i forhold til de normale keratinocytter, samt grønt fluorescerende emission af membranen lokaliseret eGFP-HRAS G12V. Områder i billeddannelse blev udvalgt til co-lokalisering af præneoplastiske hudceller og medfødte immunceller (figur 2A pilespids). På grund af den hurtige MIGration proces af neutrofiler de time-lapse intervaller blev valgt til at være mellem 1-1,5 min med Z stack trin størrelser på 0,7-1,7 um at opnå maksimal intensitet fremskrivninger (Figur 2, Video 1). Der er en bred vifte af adfærd, der kan observeres, mens billeddannelse: neutrofiler migrere siden og under præneoplastiske celler (figur 2C, Video 1), danner direkte kontakt til celler (figur 2B og C), fjern rester af præneoplastiske celler, der undergår apoptose (Video 1), eller aktivt opsluge dele af præneoplastiske celler (ikke vist). For at fange den fulde spektrum af interaktioner, er det tilrådeligt at følge deres adfærd ved time-lapse direkte billedvisning.
Figur 1: Skematisk for betinget hudcelle transformation i zebrafisk larver. (A) Et billede af en zygote af TG (UAS: eGFP-HRAS G12V; LysC: dsRed2) zebrafisk ved 10 minutter efter befrugtning (MPF). Det befrugtede æg omgivet af chorion (pilespids). Webstedet til injektion er blastocysten (stjerne), dannet af cytoplasmatiske streams fra blommen (pil), der definerer det dyr pol af embryoet. (B) Montering af zebrafisk larver. 60 mm petriskål med en 18-20 mm hul (pilespids), der er forseglet med en 25 mm dækglas. Zebrafisken larver immobiliseres og monteret på dækglasset med 1% LMP agarose. 0.3x Danieau opløsning (pil) indeholdende 5 pM 4-OHT bruges til at dække LMP agarose. (C) 4-OHT inducerede transformationer af overfladiske hudceller. (A) Skematisk tværsnitsprofil af larvehud. Den embryoniske og larvehud er sammensat af to epiteliale cellelag, en overfladisk cellelag og en basal cellelag af keratinocytter, der er forbundet til den underliggende basalmembran (BM). (B) Transient ekspression systeo fremkalde en præneoplastiske celleklon blandt overfladiske hudceller. KalTA4-ER T2 udelukkende udtrykkes i det yderste hudlag drevet af krt4 promotoren (gul). Mosaic ekspression af KalTA4-ER T2 aktiverer UAS kontrolleret (blå) eGFP-HRAS G12V ekspression i overfladiske celler, hvilket fører til en klon af præneoplastiske celler (grøn). (D) Skematisk af forbigående ekspression system. (A) Tol2 kassette af pTol2-krt4: KalTA4-ER T2; cmlc2: eGFP ekspressionsvektor anvendes transient (b) Betinget induktion af den transkriptionelle aktivator-ekspression.. KalTA4 er fusioneret til mutant ligand-bindende domæne af den humane østrogen-receptor α (ER T2), som binder specifikt 4-hydroxytamoxifen (4-OHT). I fravær af 4-OHT ER T2 er bundet i cytoplasmaet af varmechokproteiner (Hsp90). Ved 4-OHT bindende Hsp90 dissocierer, tillader en nuklear translokation af KalTA4-ERT2 og efterfølgende aktivering af UAS kontrollerede eGFP-HRAS G12V ekspression. Scale bar A = 500 um. Klik her for at se en større udgave af figuren.
Figur 2: Levende billeder af præneoplastiske og medfødte immunforsvar interaktion celle. (AC) billeder af en 4 dpf Tg (UAS: eGFP-HRAS G12V; lysC: dsRed2) embryo, som er blevet injiceret med pTol2-krt4: KalTA4-ER T2; cmlc2: eGFP og transposase mRNA på en celle stadium. Billeder blev taget efter 6 timer af 4-OHT-induktion (A) sidebillede af Tailfin region på 6 timer efter behandling, viser pletter af eGFP-HRAS G12V udtrykker hudceller (pil), og lysC:. DsRed2 + neutrofiler (pilespids). (BC) Repræsentative billeder taKen fra en konfokal time-lapse film, der viser neutrofil (rød) interaktioner med eGFP-HRAS G12V udtrykker hudceller (grøn). (B) En præ-neoplastisk celle danner en kort filopodial udvidelse med at kontakte neutrofile (pilespids). (C) neutrofiler (rød) er i tæt kontakt til en klon af præneoplastiske hudceller (grøn). Scale bar i A = 100 um; B / C = 50 um. Klik her for at se en større udgave af figuren.
Video 1 : Time-lapse direkte billedvisning af præneoplastiske og medfødte immunforsvar interaktion celle. Time-lapse af en 4 dpf Tg (UAS: eGFP-HRAS G12V; lysC: dsRed2) embryo, injiceret med pTol2-krt4: KalTA4-ER T2, cmlc2: eGFP og transposase mRNA på en celle stadie. Konfokal time-lapse film 6-9 hoUrs efter 4-OHT induktion viser lysC: dsRed2 + neutrofil (rød) interaktioner med eGFP-HRAS G12V udtrykker hudceller (grøn). Neutrofiler migrerer siden og under præneoplastiske celler og fjerne resterne af en præ-neoplastisk celle, der gennemgår apoptose. Time-lapse intervaller på 1,5 minutter i løbet af 3 timer med Z stack trinstørrelser på 1,3 um.
Discussion
Under embryogenese og larveudvikling, er den embryoniske zebrafisk hud består af to epiteliale lag, det overfladiske lag kaldet periderm og et lag af basale keratinocytter, der er fastgjort til den underliggende basalmembran 19 (figur 1C, a). Protokollen præsenteres her beskriver en enkel metode til betinget inducere præneoplastiske-celle transformation i det overfladiske hudlag af zebrafisk larver, og giver mulighed for efterfølgende interaktionsanalyse med medfødte immunceller ved direkte billedvisning. De grundlæggende metoder i vores protokol følger veletablerede zebrafisk teknikker 9-13, og vores protokol kan let tilpasses og ændres.
Den krt4 promotor 5 anvendes her driver KalTA4-ER T2 ekspression specifikt i det yderste hudlag (figur 1C, b). Men den modulære MultiSite Gatewaykloning strategi, der anvendes til at generere krt4: KalTA4-ER T2 konstrukt (figur 1D, a), giver mulighed for at klone en hvilken som helst promotor af interesse foran KalTA4-ER T2 i et enkelt kloningstrin. En tilpasning af metoden præsenteret heri er derfor muligt for de fleste væv under embryogenese og larvestadier. Tilgængeligheden af promotorsekvenser er herved den begrænsende faktor. Desuden kan næsten alle gen klonet bag en UAS interesse betinget overudtrykt på forskellige udviklingsstadier ved brug af den rumlige og tidsmæssigt styret KalTA4-ER T2 udtryk. Derfor kan vores protokol tilpasses til at udføre betinget genekspression i hvilket som helst væv af interesse i zebrafisk larver i en mosaik måde. Man kan også optimere mikroskopet indstilling for at leve billedet dybere væv, såsom lever eller bugspytkirtel.
Vi har beskrevet en ansøgning ved anvendelse af protokollen hanre, på samme måde kan man overudtrykke andre inflammatoriske modulatorer ved hjælp af denne protokol til at studere reguleringen af inflammatoriske reaktioner, som man nemt kan levende billede neutrofile og makrofag adfærdsændringer efter induktion og anholdelse i udtrykket for en kandidat inflammatorisk modulator. Desuden ville den tilpassede protokol også være til gavn for dem, der ønsker at spore celle bevægelse og adfærdsændring i forskellige stadier af vævsmorfogenese og dannelse orgel og endelig levende billede samspillet mellem medfødte immun celle interaktioner med andre specifikke cellelinier, der kan målrettes af det inducerbare KalTA4-ER T2 / UAS ekspressionssystem.
Vi brugte pDestTol2CG vektor fra zebrafisk Tol2kit 20-23, der indeholder en cmlc2: eGFP-pA kassette (figur 1D, a) som gør det muligt efterfølgende udvælgelse af embryoner af grønne fluorescerende positive hjerter som en selvlektion markør 20, som forenkler F0 screening proces. En stabil insertion af transposonet flankeret genet af interesse i genomet lettes ved co-injektion af plasmid-DNA sammen med transposase mRNA. Fremstillingen af plasmid-DNA og transposasen mRNA for mikroinjektion følger standardprotokoller. Men en vellykket integration af konstruktionen i genomet afhænger Tol2-baserede gennemførelse 14. Dette understreger den særlige opmærksomhed til at arbejde på is under sterile forhold for at undgå forureninger og forringelser af RNaser og DNaser. Mikroinjektion i én-celle embryoer er en robust og veletableret teknik for gevinst og tab af funktion studier i zebrafisk 9,10. Selvom en veluddannet person let kan tilføre blommen af over 1.000 embryoner i 1 time, det injektion i blastocysten (figur 1A, stjerne) kræver mere erfaring og uddannelse. Kritisk under denne procedure is håndtering af nålen. Nålen skal være meget tynd for at trænge ind i cellen uden beskadigelse og skal kun brydes på spidsen derfor. Det er vigtigt at regelmæssigt kontrollere og måle dråbestørrelsen under injektionen at sikre en ensartet injektion i hvert foster. Håndteres forsigtigt, nålen kan anvendes til at rotere embryoet. Dette er ofte nødvendigt for at finde den blastocysten og den optimale penetration vinkel.
Koncentrationen af DNA og transposasesekvenser mRNA anvendes til injektion næsten helt sikkert påvirker ekspressionen effektivitet. Højere doser kan føre til en øget andel af celler, der udtrykker transgenet, men med højere koncentrationer af DNA (> 50 ng / pl) og transposasen mRNA (> 100 ng / pl) også potentialet for toksiske effekter blandt injicerede embryoner ikke opstår. Vi fremme anvendelsen af 10 ng / pl DNA og 20 ng / pl transposase mRNA til injektion, hvilket svarer til 50 pg af plasmid-DNA og 100 pg af RNA pr injiceret embRyo. 100% af embryoner injiceret med disse koncentrationer kan udvikle sig normalt og mellem 40-70% show eGFP-HRAS G12V ekspression efter 4-OHT-induktion, afhængigt af injektion effektivitet i enkelt celle. Blandt positive embryoner vi normalt finde ca. 30%, der har 1-10 kloner, 40%, der har 10-50 kloner, og 30% har mere end 50 kloner. På grund af vores forsknings målsætninger, vi fremme anvendelsen af embryoner med færre kloner, der udtrykker eGFP-HRAS G12V. Vi udvælger embryoer med 10-50 kloner for vores transiente eksperimenter. Til fremstilling af transgene grundlægger fisk, anbefaler vi at kun vælge fostre med både eGFP positive hjerte- markør og et stort antal eGFP-HRAS G12V positive kloner i deres hud.
(Z) -4-hydroxytamoxifen undergår en cis-trans (EZ) interomdannelse når de udsættes for lys 24. Det blev konstateret, at cis-isomeren (E) er 100x mindre anti-østrogene end trans modstykke 25,26. Exposure for lys skal derfor undgås. 4-OHT stamopløsning opløst i ethanol kan opbevares ved -20 ° C i mørke over en lang tidsperiode. Vi anbefaler brug af en kasse for at beskytte petriskåle mod lys under målgen induktion i inkubatoren og transport. Selvom området billeddannelse er meget lille og eksponering af 4-OHT til UV-lys er reduceret til et minimum, en konstant udveksling af induktion opløsning hver 2 timer, mens billeddannelse over længere tidsperioder anbefales at opretholde maksimale ekspressionsniveauer. 4-OHT effektivt permeabiliserer gennem chorion og de yderste hudlag under zebrafisk embryogenese, det kan derfor inducere genekspression meget hurtigt. Vi kan let observere eGFP emission efter 2 timer af induktion og det er blevet rapporteret, at de første tegn på target-genekspression kan observeres efter 1 time og plateau efter 3 timer af behandlingen 8. Forskellene kan skyldes den anden promotor, der anvendes i vores studie. Som det har været previously rapporteret, at 4-OHT behandling er dosisafhængig 8,27, vi valgte at bruge den højeste rapporterede koncentration på 5 uM at opnå robuste og reproducerbare ekspressionsniveauer i vores forbigående tilgang. Dette skal sikre, at alle celler, der bærer transgenet vil inducere målgenekspression.
Det skal tages i betragtning, at forbigående fremgangsmåde præsenteres her kan føre til varierende ekspressionsniveauer på grund af muligheden af flere og tilfældige genom indsættelse begivenheder. Desuden er brugen af transposase mRNA i Tol2 transgene baggrund af Tg (UAS: eGFP-HRAS G12V) io006 kan føre til potentielle gennemførelser af UAS transgen, som kan resultere i gendæmpning eller forstyrrelser. Men som den metode præsenteres her repræsenterer en forbigående tilgang, den første udvælgelse af embryoner efterfølgende injektion er obligatorisk. Mange laboratorier har fundet, at UAS-sekvenser tendens til at blive bragt til tavshed i transgene afkom dermedprojicere den pTol2-krt4: KalTA4-ER T2, cmlc2: eGFP konstruktion i Tg (UAS: eGFP-HRAS G12V) io006 embryoner måske ikke være så effektive som injektion af en UAS konstruktion i Tg (krt4: KalTA4-ER T2, cmlc2: GFP ) embryoner. Brugen af den stabile transgene linje Tg (krt4: KalTA4-ER T2) krydset med Tg (UAS: eGFP-HRAS G12V) io006 vil tillade en præcis overvågning af ON / OFF-kinetik time-dosis afhængig 4-OHT genaktivering .
Et afgørende skridt under montering af larver er overførslen i LMP agarose og på dækglasset (figur 1B). Der er kun en kort tidsramme for flydende LMP agarose temperatur, der giver en sikker overførsel og orientering af forvalgte larver uden at skade fisk ved enten varme stød eller hærdning af gelen. Larverne bør være orienteret direkte på dækglasset at reducere arbejdsafstanden for den efterfølgende mikroskopisk ANALYsis. Da dette kan være en begrænsende faktor under mikroskopi valget af passende mål er obligatorisk. Når monteret, kan larven opretholdes fra timer til dage.
Betingelserne i modelsystemet præsenteret heri muliggør gentagen transformation ved 4-OHT aktivering af transgen. Ekspressionssystemet afhænger af tilstedeværelsen af 4-OHT og derfor KalTA4 kontrolleret ekspression af et gen af interesse er reversibel (figur 1D, b). I modsætning til den Cre-ER T2 / Lox-system, som letter en irreversibel genomisk rekombinationshændelse 28 kan KalTA4-ER T2 / UAS aktiveres og deaktiveres ved tilsætning eller fjernelse af 4-OHT og dette potentiale til gentagen induktion er en fordel teknikken over Cre-ER T2 / Lox system. Men kravet om konstante niveauer af 4-OHT er en begrænsning, hvis forsøget skal forlænges fra dage til uger.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (Z)-4-Hydroxytamoxifen | Sigma Aldrich | H7904 | dilute in ethanol and store in the dark at -20 °C |
| 20X Objective | Zeiss | 20X/0.5 Ph2 ∞/0.17 | |
| 40X Objective | Zeiss | 40X/1.2W Korr ∞/0.14-0.18 | |
| 63X Objective | Zeiss | 63X/1.4 Oil Ph3 ∞/0.17 | |
| BamHI | New England Biolabs | R0136S | |
| Confocal Microscope | Zeiss | LSM 510 META | |
| Cover glass | VWR | 631-0171 | Diameter 25 mm |
| Dimethylpolysiloxane | Sigma Aldrich | DMPSV | |
| Dow Corning high-vacuum silicone grease | Sigma Aldrich | MKBL4135V | |
| Flaming/Brown P-97 Micropipette Puller | Sutter Instruments Co. | P-97 | Program: heat 530, pull 200, velocity 80, and time 150 |
| Fluorescent stereoscope | Leica | M205 FA | |
| Kwik-Fill Brosilicate Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B100F-4 | |
| Microinjection mold TU-1 | Adaptive Science Tools | TU-1 | |
| Microloader tip | Eppendorf | 930001007 | |
| Microscope | Zeiss | Axiovert 200 | |
| mMESSAGE mMACHINE Kit | Ambion | AM1348 | |
| Nuclease-free water | Invitrogen | AM9937 | |
| Pneumatic pico pump | World Precision Instruments | PV820 | |
| Pneumatic pico pump | Warner Instruments | PLI-90A | |
| pTol2-krt4:KalTA4-ERT2;cmlc2:eGFP | Dr. Thomas Ramezani/Yi Feng Lab/The University of Edinburgh | ||
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Quiagen | 27106 | |
| Rhodamine B isothiocyanate-Dextran | Sigma Aldrich | R8881 | 10 mg/μl in water |
| Stereoscope | Leica | M80 | |
| Tg(lysC:dsRed2)nz50Tg | BMC Developmental Biology 7, 42, doi:10.1186/1471-213X-7-42 (2007) | ||
| Tg(UAS:eGFP-HRASG12V)io006 | PloS One 5 (12), e15170, doi:10.1371/journal.pone.0015170 (2010) | ||
| Tricaine/MS-222 | Sigma Aldrich | A5040 | |
| UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500-100 | |
| UltraPure Low Melting Point Agarose | Invitrogen | 16520-050 | |
| UltraPure Phenol : Chloroform : Isoamyl Alcohol | Invitrogen | 15593-031 | 25:24:1, v/v |
References
- Kajita, M., Sugimura, K., et al. Filamin acts as a key regulator in epithelial defence against transformed cells. Nature communications. 5, 4428 (2014).
- Feng, Y., Santoriello, C., Mione, M., Hurlstone, A., Martin, P. Live imaging of innate immune cell sensing of transformed cells in zebrafish larvae: parallels between tumor initiation and wound inflammation. PLoS Biology. 8 (12), e1000562 (2010).
- Feng, Y., Renshaw, S., Martin, P. Live Imaging of Tumor Initiation in Zebrafish Larvae Reveals a Trophic Role for Leukocyte-Derived PGE 2. Current Biology. 22 (13), 1253-1259 (2012).
- Halpern, M. E., Rhee, J., Goll, M. G., Akitake, C. M., Parsons, M., Leach, S. D. Gal4/UAS transgenic tools and their application to zebrafish. Zebrafish. 5 (2), 97-110 (2008).
- Gong, Z., Ju, B., et al. fluorescent protein expression in germ-line transmitted transgenic zebrafish under a stratified epithelial promoter from keratin8. Developmental Dynamics an Official Publication of the American Association of Anatomists. 223 (2), 204-215 (2002).
- Distel, M., Wullimann, M. F., Köster, R. W. Optimized Gal4 genetics for permanent gene expression mapping in zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (32), 13365-13370 (2009).
- Feil, R., Wagner, J., Metzger, D., Chambon, P. Regulation of Cre recombinase activity by mutated estrogen receptor ligand-binding domains. Biochemical and Biophysical Research Communications. 237 (3), 752-757 (1997).
- Gerety, S. S., Breau, M. a, Sasai, N., Xu, Q., Briscoe, J., Wilkinson, D. G. An inducible transgene expression system for zebrafish and chick. Development. 140 (10), 2235-2243 (2013).
- Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (27), e1113 (2009).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function. J. Vis. Exp. (25), e1115 (2009).
- Eisenhoffer, G. T., Rosenblatt, J. Live Imaging of Cell Extrusion from the Epidermis of Developing Zebrafish. J. Vis. Exp. (52), e2689 (2011).
- Kague, E., Weber, C., Fisher, S. Mosaic Zebrafish Transgenesis for Evaluating Enhancer Sequences. J. Vis. Exp. (41), e1722 (2010).
- Balciuniene, J., Gene Balciunas, D. Trapping Using Gal4 in Zebrafish. J. Vis. Exp. (79), e50113 (2013).
- Balciunas, D., Wangensteen, K. J., et al. Harnessing a high cargo-capacity transposon for genetic applications in vertebrates. PLoS Genetics. 2 (11), e169 (2006).
- Santoriello, C., Gennaro, E., et al. Kita driven expression of oncogenic HRAS leads to early onset and highly penetrant melanoma in zebrafish. PloS One. 5 (12), e15170 (2010).
- Hall, C., Flores, M. V., Storm, T., Crosier, K., Crosier, P. The zebrafish lysozyme C promoter drives myeloid-specific expression in transgenic fish. BMC Developmental Biology. 7, 42 (2007).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics : an Official Publication of the American Association of Anatomists. 203 (3), 253-310 (1995).
- Westerfield, M. THE ZEBRAFISH BOOK: A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , 5th Edition, University of Oregon Press. Eugene. (2007).
- Le Guellec, D., Morvan-Dubois, G., Sire, J. -Y. Skin development in bony fish with particular emphasis on collagen deposition in the dermis of the zebrafish (Danio rerio). The International Journal of Developmental Biology. 48 (2-3), 217-231 (2004).
- Kwan, K. M., Fujimoto, E., et al. The Tol2kit: a multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs. Developmental Dynamics : an Official Publication of the American Association of Anatomists. 236 (11), 3088-3099 (2007).
- MultiSite Gateway Three- Fragment Vector Construction Kit. Protocols and Product Manuals. 12537-023, Invitrogen life technologies. (2010).
- Petersen, L. K., Stowers, R. S. A Gateway MultiSite Recombination Cloning Toolkit). PLoS ONE. 6 (9), e10 (2011).
- Magnani, E., Bartling, L., Hake, S. From Gateway to MultiSite Gateway in one recombination event. BMC Molecular Biology. 7, 46 (2006).
- Robertson, D. W., Katzenellenbogen, J. A. Synthesis of the (E) and (Z) isomers of the antiestrogen tamoxifen and its metabolite, hydroxytamoxifen, in tritium-labeled form. The Journal of Organic Chemistry. 47 (12), 2387-2393 (1982).
- Murphy, C., Langan-Fahey, S. Structure-function relationships of hydroxylated metabolites of tamoxifen that control the proliferation of estrogen-responsive T47D breast cancer cells in vitro. Molecular. 38 (5), 737-743 (1990).
- Furr, B. J. A., Jordan, V. C. The pharmacology and clinical uses of tamoxifen. Pharmacology & Therapeutics. 25 (2), 127-205 (1984).
- Akerberg, A. a, Stewart, S., Stankunas, K. Spatial and Temporal Control of Transgene Expression in Zebrafish. PloS One. 9 (3), e92217 (2014).
- Hans, S., Kaslin, J., Freudenreich, D., Brand, M. Temporally-controlled site-specific recombination in zebrafish. PloS One. 4 (2), e4640 (2009).
