Summary
Die Untersuchung der frühesten Ereignisse präneoplastischen Zellprogression und angeborenen Immunzellinteraktion ist von zentraler Bedeutung, zu verstehen und Behandlung von Krebs. Hier beschreiben wir eine Methode, um bedingt induzieren epithelialen Zelltransformationen und der anschließenden Live-Imaging von angeborenen Immunzellinteraktion mit HRAS G12V exprimierenden Hautzellen im Zebrafisch-Larven.
Introduction
Die Überwucherung einer präneoplastischen Zell von ihnen innerhalb einer ansonsten normalen epithelialen Blatt hängt stark von einer Interaktion mit seiner Mikroumgebung. Das Zusammenspiel mit seinen Wirtsgewebe ist wahrscheinlich der entscheidende Faktor, ob ein präneoplastische Zellen in der Lage, eine klonale Nische weiter zu einem ausgewachsenen Krebs entwickeln etablieren können. Trotz ihrer Bedeutung in der Entwicklung, ist diese erste Phase der Tumorprogression in unzugänglichen am häufigsten verwendeten Modellsysteme, in vivo.
Der Zebrafisch, Danio rerio, ist ein gut etabliertes Modellorganismus für Live-Imaging-Studien wegen seiner Transparenz über die Entwicklung, die Möglichkeit der genetischen Manipulation, und Zugänglichkeit für wasserlösliche Medikamente. Jüngste Untersuchungen mit einem Zebrafisch-Larven Modell Expression des menschlichen Onkogen HRAS G12V an Epithelzellen zu transformieren, zeigte, dass Wirtszelle abgeleitet von Signalen, insbesondere H 2 O 2 führen zudie Rekrutierung von angeborenen Immunzellen. Interessanterweise sind die Immunzellen rekrutiert, Neutrophilen und Makrophagen, wurde gezeigt, dass eine trophische Rolle in präneoplastischen Zellproliferation 2,3 unterstützt haben.
Um die frühen Ereignisse der Tumor Initiierung und Progression sowie den Beitrag einer entzündlichen Reaktion verstehen, muss man in der Lage sein diese Ereignisse von den frühesten Zeitpunkt weiter nach Bild sein. Daher ist es notwendig, Zelltransformationen in einem zeitlichen und gewebsspezifischen Weise zu steuern. Wir nutzen die Gal4 / UAS-System, das erfolgreich von Drosophila 4 geeignet ist, bedingt Ausdruck der menschlichen Onkogen HRAS G12V unter der Kontrolle des Hautspezifischen Promotor Keratin 4 (KRT4) 5. Die modifizierte Version des Transkriptionsaktivators Gal4, nämlich KalTA4 6 ermöglicht Expression HRAS G12V unter der Kontrolle der Upstream-Aktivations-Sequenz (UAS). Bedingt induzieren Transkriptionsaktivator Ausdruck hat KalTA4 zum mutierten Ligandenbindungsdomäne des humanen Estrogenrezeptor α (ER T2) 7, die speziell 4-Hydroxytamoxifen bindet fusioniert (4-OHT) 1. In Abwesenheit von 4-OHT die ER T2 wird im Zytoplasma von Hitzeschockproteine gebunden. Nach 4-OHT Bindung des Hitzeschock-Proteinen zu dissoziieren, so dass eine Kerntranslokation KalTA4-ER T2 und anschließende Aktivierung der UAS kontrollierten Gens von Interesse 8 (1C, b). Da dieses Expressionssystems hängt von der Anwesenheit von 4-OHT ist die KalTA4 kontrollierten Expression eines Gens von Interesse reversibel. Im Gegensatz zu dem Cre-ER T2 / Lox-System, das zu einer irreversiblen Rekombinationsereignis führt, ist die Induktion der transkriptionalen Aktivierung durch KalTA4-ER T2 reversible durch Zugabe oder Entfernung von 4-OHT.
Das folgende Protokoll allo ws eine bedingte Umwandlung der Hautzellen in Zebrafisch-Larven und eine anschließende Messung der Interaktion mit Zellen des angeborenen Immunsystems durch fluoreszierende Protein-Expression. Die in diesem Protokoll verwendeten grundlegenden Methoden sind ähnlich wie einige häufig verwendete Techniken innerhalb der Zebrafisch-Community 9-13.
Die Erzeugung und kombinatorische Verwendung von transgenen Linien zusammen mit der Mikroinjektion von transgenen Konstrukten ermöglicht eine vorübergehende Ansatz nur einzelne Zellen zu transformieren in einem Mosaik Weise. Die Sauerstoffdurchlässigkeit der embryonalen und larvalen Zebrafischhaut wirft die Möglichkeit für Zeitraffer-Live-Imaging-Studien, die von der hochauflösenden Mikroskopie von Stunden bis Tagen. Darüber hinaus wird die Zugänglichkeit zu wasserlöslichen Medikamenten Zukunft mechanistische Untersuchungen und die Überwachung der zellbiologischen Ereignisse in vivo, die zu einem besseren Verständnis von den frühesten Stadien der Krebsentstehung führen könnte ermöglichen.
_content "> Dieses Protokoll kann angepasst werden, um bedingte Genexpression in jedem Gewebe von Interesse in Zebrafisch-Larven durchzuführen, in einem Mosaik Art. Man kann auch die Optimierung der Mikroskopeinstellung, um Bild tiefer außer Hautgewebe zu leben.Protocol
Die folgenden experimentellen Verfahren wurden in strikter Übereinstimmung mit den Animals (Scientific Procedures) Act 1986 durchgeführt.
1. Herstellung von Plasmid-DNA für die Mikroinjektion
- Reinige den Plasmid pTol2-KRT4: KalTA4-ER T2; cmlc2: eGFP mit einem kommerziellen Plasmid DNA Purification Kit nach den Anweisungen des Herstellers und verdünnt das Plasmid-DNA bis zu einer endgültigen Konzentration der Stammlösung von 100 ng / ul.
- Linearisierung der Transposase das Plasmid pT3TS / Tol2 14 durch BamHI Restriktionsverdau nach Hersteller-Protokoll. Dieser Schritt kann über Nacht verlängert werden. Fällt die linearisierte DNA durch Phenol / Chloroform-Extraktion wurde nach dem Standardprotokoll.
- In-vitro-Transkription der Transposase mRNA aus dem linearisierten Plasmids mit einem kommerziellen Kit Transkription für große Mengen von verkappten RNA nach den Anweisungen des Herstellers verdünnt und Aliquoteeine endgültige Stammlösung Konzentration von 100 ng / ul in Nuklease-freies Wasser. Sicherzustellen Qualität des gereinigten RNA mit einer nativen 1-2% TAE (40 mM Tris, 20 mM Essigsäure, 1 mM EDTA) Agarose-Gelelektrophorese (80-120 V). Bewahren Sie die RNA bei -80 ° C.
2. Mikroinjektion von Plasmid-DNA für die transiente Genexpression
- Bereiten Sie eine Agarose-Einspritzplatte, die befruchteten Eier während der Injektion zu halten. Gießen Flüssigkeit 3% Agarose in eine 90 mm Petrischale. Lassen Sie die Agarose kühl auf 40-50 ° C und fügen Sie die keilförmige Mikroinjektion Form TU-1 auf der Oberseite des flüssigen Agarose. Nach dem Aushärten bei Raumtemperatur, lassen Sie die Agarose Rest bei 4 ° C für 30 Minuten vor dem Entfernen der Form. Store Mikroinjektion Formen bei 4 ° C und Wiederverwendung.
- Bereiten Sie einen aliquoten Teil der Injektionslösung. Führen Sie folgende Schritte auf dem Eis. Pipette 1 ul Plasmid-DNA (Endkonzentration 10 ng / ul), 2 ul Transposase mRNA (Endkonzentration 20 ng / ul), 2ul 10 mg / & mgr; l Rhodamin B-Isothiocyanat-Dextran, 2 ul 5x Danieau Lösung (290 mM NaCl, 3,5 mM KCl, 2 mM MgSO 4, 3 mM Ca (NO 3) 2, 25 mM HEPES, pH 7,6), um eine Endvolumen von 10 ul in Nuclease-freiem Wasser.
- Bereiten Nadeln aus Borosilikatglas Kapillaren mit 1 mm Durchmesser, die eine innere Faden durch Ziehen des kapillaren in entgegengesetzte Richtungen mit einer Mikropipette Puller. Verwenden Sie das folgende Programm: Wärme 530, 200 ziehen, Geschwindigkeit und Zeit 80 150.
- Füllen Sie eine Nadel mit 2 ul der Injektionslösung (auf Eis gehalten). Vermeiden Sie Luftblasen durch vorsichtiges Herausziehen der Microloader Spitze, während die Freigabe der Lösung in die Kapillare. Vorsichtig brechen die Spitze der Nadel mit einer Pinzette.
- Regulieren Sie die Tropfengröße mit einem pneumatischen pico Pumpe. Messen Sie den Tropfendurchmesser / Volumen (V = 4/3 & pgr; r 3) und stellen Sie die Tropfengröße mit einem Okularmikrometer unter einem Stereoskop in Dimethylpolysiloxan. Wir empfehlen100 & mgr; m, entsprechend 0,5 nl. Dies gewährleistet gleichmäßige und reproduzierbare Konzentrationen für jeden Embryo injiziert. Daraufhin wird die injizierten Konzentration und stellen für jedes Konstrukt und Plasmidpräparation.
- Legen Sie die Zygoten (1A) aus einer Kreuzung an Tg (UAS: eGFP-HRAS G12V) io006 15 mit Tg (lysC: DsRed2) nz50Tg 16 in die Formen der Einspritzplatte durch die Verwendung einer 3 ml pastette. Unterdessen halten die Spitze des vorge vorbereiteten Injektionsnadel in Dimethylpolysiloxan, um die Lösung vor dem Austrocknen und Blutgerinnung zu vermeiden.
- Spritzen den vorher abgemessenen Tropfen (100 & mgr; m entsprechend 0,5 nl) unter einem Stereoskop durch Chorion in die Keimscheibe 17, vor der ersten Spaltung (Figur 1A). Injektion in den Ein-Zell-Stadium erhöht das Potenzial einer Gleichverteilung der Plasmid-DNA und RNA in dem sich entwickelnden Zellmasse und die Möglichkeit für Keimbahntransmission. Es istbemerkenswert, dass die Expression der Konstrukte öfter neigt Mosaik sein.
3. Bedingte Hautzelltransformation durch die 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT)
- Übertragen Sie die injizierten Embryonen in 0,3x Danieau Lösung und halten sie bei 28,5 ° C in einem Inkubator. Entfernen unbefruchteten Eiern aus der Schüssel auf Kugel Stufe 17. Mehrkomponenten-spritz Rhodamin B-Isothiocyanat-Dextran kann als Injektionssteuerung unter einer Fluoreszenz Stereoskop verwendet werden.
- Bildschirm Embryonen bei 24 HPF (h nach der Befruchtung) für kardiale Expression von eGFP. Weiter zur CMLC erhöhen: eGFP positiven Zebrafischembryonen bis 72 HPF. Die Wasserqualität (0,3x Danieau) sorgfältig zu überwachen.
- Entfernen Sie das Chorion dieser Embryonen, die nicht mit einer Pinzette 72 HPF geschlüpft sind. Vorsichtig stecken das Chorion mit 1 Pinzette und ziehen Sie sie auseinander, indem Sie die anderen. Wählen Embryonen für lysC: DsRed2 Ausdruck mit einem fluoreszierenden Stereoskop.
- Zugabe von 10 ul einer 10 mMBestand an (Z) -4-Hydroxytamoxifen zu 20 ml 0,3x Danieau Lösung (Endkonzentration von 5 uM). Verwenden Sie die 4-OHT induktions Lösung für eine Standardpetrischale (90 mm) auf einer Charge von 40-60 Embryonen.
- Übertragen Sie die Embryonen in eine neue Petrischale mit 20 ml frisch zubereitete Induktions-Lösung. 4-OHT eingelagert und in der Dunkelheit behandelt. Die ersten Anzeichen der Expression kann festgestellt werden 2 Stunden nach Induktion Beginn. Die Induktion-Schritt kann über Nacht verlängert werden, wenn man bedenkt, dass die ersten Wirtszelle: präneoplastischen Zellinteraktionen können bereits wenige Stunden nach der Behandlung auftreten.
4. Montage und Live-Imaging von Zebrafisch-Larven
- Vorbereiten einer 60 mm Petrischale durch die Einführung einer Bohrung mit einem Durchmesser von 18-20 mm. Verwenden Sie Hochvakuum-Silikonfett zu decken und versiegeln Sie das Loch auf der äußeren Boden der Petrischale mit 25 mm Deckglas (1B).
- Bereiten Sie 1% niedrigen Schmelzpunkt (LMP) Agarosegel. Halten Sie ein 1,5-ml-TubeLMP-Agarose bei 37 ° C in einem Heizblock.
- Preselect Tg (KRT4: KalTA4-ER T2; UAS: eGFP-HRAS G12V; lysC: DsRed2) Larven für das grün fluoreszierende Hautzelle und DsRed2 positive angeborenen Immunzellexpressions, unter einem Fluoreszenz-Stereoskop. Anesthetize Larven durch die Zugabe von 1 ml 0,4% Tricaine 18 zu der 20 ml Induktionslösung.
- Übertragen Sie die vorgewählte Larven mit einem pastette in die Flüssigkeit LMP-Agarose. Lassen Sie sich die Larven in die LMP sinken Agarose und übertragen diese auf das Deckglas (1B). Richten Sie die Embryonen unter einem Stereoskop. Die Larven, die direkt auf dem Glas (bis zu 6 Larven) angeordnet, um den Arbeitsabstand zu verringern.
- Decken Sie die LMP-Agarose mit dem Tricaine haltigen Induktionslösung, nachdem sie (1B Pfeil) gehärtet.
- Bild der eingebettete Larven unter Verwendung eines invertierten Fluoreszenz, Laser-Scanning oder sich drehende Scheibe konfokalen Mikroskop. Verwenden Sie eine 40-fach oder 63XZiel als Ziele mit großen Arbeitsabständen ermöglichen Fokussierung durch den gesamten Larven.
Representative Results
Zygoten einer Kreuzung zwischen Tg (UAS: eGFP-HRAS G12V) io006 und Tg (lysC: DsRed2) nz50Tg wurden gesammelt 10-15 Minuten nach der Befruchtung (1A) bis 1 Zell-Embryonen erhalten. Nach der Injektion wurden die Embryonen bis 3 dpf erhoben, vor der Induktion mit 4-OHT und Montage für die Live-Bildgebung (1B). 2-6 Stunden nach der Induktion wurden die montiert Embryonen wurden unter einem invertierten Fluoreszenzmikroskop plaziert entweder (2A) bzw. eine invertierte Konfokalmikroskop (2B-C) und für 2-3 Stunden mit 1,5 min-Intervallen abgebildet. Präneoplastischen oberflächlichen Hautzellen durch ihre gerundeten Morphologie im Vergleich zu normalen Keratinozyten sowie die grüne Fluoreszenzemission der Membran lokalisierten eGFP-HRAS G12V identifiziert werden. Bereiche Imaging wurden für die Co-Lokalisierung von präneoplastischen Hautzellen und angeborenen Immunzellen (2A Pfeilspitze) ausgewählt. Aufgrund der schnellen migRation Prozess der Neutrophilen die Zeitrafferintervalle wurden ausgewählt, um zwischen 1 bis 1,5 Minuten mit Z-Stack Schrittweiten von 0,7 bis 1,7 & mgr; m sein, um maximale Intensität Projektionen (Abbildung 2, Video 1) zu erhalten. Es gibt eine breite Reihe von Verhaltensweisen, die bei der Echtzeit-Bildgebung beobachtet werden können: Neutrophile migrieren neben und unter präneoplastischen Zellen (2C, Video 1) direkten Kontakt zu den Zellen (2B und C) zu bilden, Reste von präneoplastischen Zellen, unterzogen zu entfernen Apoptose (Video 1), oder aktiv verschlingen Teile präneoplastischen Zellen (nicht gezeigt). Um das gesamte Spektrum der Interaktionen zu erfassen, ist es ratsam, ihr Verhalten durch Zeitraffer-Live-Bildgebung zu folgen.
Abbildung 1: Schematische für bedingte Hautzelltransformation in Zebrafisch-Larven. (A) Ein Bild von einer Zygote von Tg (UAS: eGFP-HRAS G12V, LysC: DsRed2) Zebrafisch in 10 Minuten nach der Befruchtung (MPF). Das befruchtete Ei wird von dem Chorion (Pfeilspitze) umgeben ist. Die Injektionsstelle ist die Keimscheibe (Sternchen), durch zytoplasmatische Ströme aus dem Dotter (Pfeil) gebildet, die das Tier Pol des Embryos definiert. (B) Montage des Zebrafisch-Larven. 60 mm Petrischale mit einem 18-20-mm-Bohrung (Pfeilspitze), die von einem 25 mm Deckglas versiegelt wird. Der Zebrafisch-Larven werden immobilisiert und auf dem Deckglas um 1% LMP-Agarose montiert. 0.3x Danieau Lösung (Pfeil), die 5 & mgr; M 4-OHT wird die LMP-Agarose zu decken. (C) 4-OHT induzierten Transformationen der oberflächlichen Hautzellen. (A) Schematische Querschnittsprofil der Larvenhaut. Die embryonale und Larven Haut besteht aus zwei Epithelzellschichten, einer oberflächlichen Zellschicht und einer Basalzellenschicht Keratinozyten, die auf der darunterliegenden Basalmembran (BM) verbunden sind. (B) Transiente Expressionssystem to induzieren eine präneoplastischen Zellklons unter oberflächlichen Hautzellen. KalTA4-ER T2 ausschließlich in der obersten Hautschicht von der KRT4 Promotor (gelb) angetrieben ausgedrückt. Mosaic Ausdruck KalTA4-ER T2 aktiviert UAS gesteuert (blau) eGFP-HRAS G12V Expression in den oberflächlichen Zellen, was zu einem Klon von präneoplastischen Zellen (grün). (D) Schematische Darstellung der transienten Expressionssystem. (A) Tol2 Kassette von der pTol2-KRT4: KalTA4-ER T2; cmlc2: eGFP-Expressionsvektor transient (b) Bedingtes Induktion der Transkriptionsaktivator Ausdruck.. KalTA4 zum mutierten Ligandenbindungsdomäne des menschlichen Östrogenrezeptor α (ER T2), die speziell 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT) bindet fusioniert. In Abwesenheit von 4-OHT die ER T2 wird im Zytoplasma von Hitzeschockproteinen (Hsp90) gebunden. Nach 4-OHT verbindlich Hsp90 distanziert, so dass eine nukleäre Translokation von KalTA4-ERT2 und die anschließende Aktivierung der UAS gesteuert eGFP-HRAS G12V Ausdruck. Maßstabsbalken A = 500 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version der Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Live-Imaging von präneoplastischen und angeborenen Immunzellinteraktion. (AC) Bilder einer 4 dpf Tg (UAS: eGFP-HRAS G12V; lysC: DsRed2) Embryo, der mit pTol2-KRT4 injiziert wurde: KalTA4-ER T2; cmlc2: eGFP und Transposase mRNA an einem Zellstadium. Die Bilder wurden nach 6 Stunden 4-OHT Induktion genommen (A) Seitenansicht der Heckflosse Region bei 6 Stunden nach der Behandlung, welche Patches von eGFP-HRAS G12V exprimierenden Hautzellen (Pfeil), und lysC:. DsRed2 + Neutrophilen (Pfeilspitze). (BC) Repräsentative Bilder taken aus einem konfokalen Zeitraffer-Film, zeigt Neutrophilen (rot) Wechselwirkungen mit eGFP-HRAS G12V Ausdruck Hautzellen (grün). (B) A präneoplastischen Zell eine kurze filopodial Erweiterung mit dem Kontakt Neutrophilen (Pfeilspitze) bildet. (C) Neutrophile (rot) steht in engem Kontakt, um einen Klon von präneoplastischen Hautzellen (grün). Maßstabsbalken in A = 100 & mgr; m; B / C = 50 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version der Abbildung zu sehen.
Video 1 : Zeitraffer-Live-Imaging von präneoplastischen und angeborenen Immunzellinteraktion. Time-lapse eines 4 dpf Tg (UAS: eGFP-HRAS G12V; lysC: DsRed2) Embryo, mit pTol2-KRT4 injiziert: KalTA4-ER T2; cmlc2: eGFP und Transposase mRNA an einem Zellstadium. Die konfokale Zeitraffer-Film 6-9 hours nach 4-OHT Induktion zeigt lysC: DsRed2 + Neutrophilen (rot) Wechselwirkungen mit eGFP-HRAS G12V Ausdruck Hautzellen (grün). Neutrophile Granulozyten wandern neben und unter präneoplastischen Zellen und Reste einer präneoplastischen Zellen, die Apoptose durchläuft entfernen. Zeitraffer-Abständen von 1,5 min über 3 Stunden mit Z-Stack Schrittweiten von 1,3 um.
Discussion
Während der Embryogenese und Entwicklung der Larven wird die embryonale Zebrafischhaut von zwei epithelialen Schichten, die oberflächliche Schicht genannt periderm und eine Schicht aus basalen Keratinocyten, die auf der darunterliegenden Basalmembran 19 angebracht werden (1C, a). Die hier vorgestellte Protokoll beschreibt eine einfache Methode, um bedingt induzieren präneoplastischen-Zelltransformation in der oberflächlichen Hautschicht aus Zebrafisch-Larven und ermöglicht nachfolgende Interaktionsmethoden mit angeborenen Immunzellen durch Echtzeit-Bildgebung. Die grundlegenden Methoden in unserem Protokoll folgen etablierten Techniken Zebrabärbling 9-13 und unser Protokoll kann leicht angepasst und modifiziert werden.
Die KRT4 Promotor 5 hier verwendeten antreibt KalTA4-ER T2 Expression spezifisch in der äußersten Hautschicht (1C, b). Jedoch ist die modulare Multisite-GatewayKlonierungsstrategie, verwendet, um die KRT4 erzeugen: KalTA4-ER T2 Konstrukt (1D, a), bietet die Möglichkeit, jeden Promotor von Interesse vor KalTA4-ER T2 in einem einzigen Klonierungsschritt zu klonen. Eine Anpassung des hier offenbarten Verfahrens ist für die meisten Gewebe während der Embryogenese und Larvenstadien daher möglich. Die Verfügbarkeit von Promotorsequenzen ist hiermit der begrenzende Faktor. Des Weiteren waren fast jedes Gen von Interesse hinter einer UAS kloniert kann bedingt in verschiedenen Entwicklungsstadien unter Verwendung der räumlichen und zeitlich kontrollierte KalTA4-ER T2 Expression überexprimiert werden. Daher kann unser Protokoll angepasst, um bedingte Genexpression in jedem Gewebe von Interesse in Zebrafisch-Larven durchzuführen, in einem Mosaik Weise werden. Man kann auch die Optimierung der Mikroskopeinstellung, um die Bild tieferen Gewebe wie Leber oder der Bauchspeicheldrüse zu leben.
Wir haben eine Anwendung, die das Protokoll von ihm beschriebenenwieder in ähnlicher Weise kann man andere Entzündungsmodulatoren überexprimieren die dieses Protokoll verwenden, um die Regulierung von Entzündungsreaktionen zu studieren, da kann man einfach Live-Bild von Neutrophilen und Makrophagen Verhaltensänderungen nach der Induktion und der Festnahme in der Expression eines Kandidaten Entzündungsmodulator. Darüber hinaus würde die angepasst Protokoll auch von Vorteil für diejenigen, die Zellbewegung und Verhalten zu ändern während verschiedener Phasen der Morphogenese und Organbildung und Spuren wollen schließlich Livebild das Zusammenspiel der angeborenen Immunzellinteraktionen mit anderen spezifischen Zelllinien, die ausgerichtet werden kann von dem induzierbaren KalTA4-ER T2 / UAS-Expressionssystem.
Wir nutzten die pDestTol2CG Vektor vom Zebrafisch Tol2kit 20-23, die eine cmlc2 enthält: eGFP-pA-Kassette (1D, a) die anschließende Selektion von Embryonen mit grün fluoreszierenden positive Herzen als se erlaubtwahl Markierung 20, die die F0 Screening-Prozess vereinfacht. Eine stabile Insertion des Transposons flankierte Gen von Interesse in das Genom wird durch Co-Injektion der Plasmid-DNA zusammen mit Transposase mRNA erleichtert. Die Herstellung von Plasmid-DNA und das Transposase-mRNA für die Mikroinjektion folgt den Standardprotokollen. Eine erfolgreiche Integration des Konstrukts in das Genom hängt jedoch von der Tol2 basierte Umsetzung 14. Dies unterstreicht die besondere Aufmerksamkeit gewidmet werden, um auf dem Eis unter sterilen Bedingungen arbeiten, um Verschmutzungen und Verschlechterungen von RNasen und DNasen vermeiden. Mikroinjektion in einem Zellstadium Embryonen ist eine robuste und gut etablierte Technik für Gewinn und Verlust von Funktionsprüfungen im Zebrafisch 9,10. Obwohl eine gut ausgebildete Person kann leicht in den Dotter von über 1.000 Embryonen in 1 Stunde zu injizieren, die Injektion in die Keimscheibe (1A, Sternchen) erfordert mehr Erfahrung und Ausbildung. Während dieses Verfahrens kritisch is den Umgang mit der Nadel. Die Nadel hat, sehr dünn, um die Zelle ohne Schaden durchdringen und weist nur auf seiner äußersten Spitze gebrochen werden daher. Es ist wichtig, regelmäßige Kontrolle und Messung der Tröpfchengröße während der Injektion, um eine gleichmäßige Injektion in jedem Embryo gewährleisten. Sorgfältig behandelt, kann die Nadel verwendet, um den Embryo zu drehen. Dies ist oft notwendig, um die Keimscheibe und die optimale Durchdringung Winkel zu finden.
Die Konzentration von DNA und Transposase mRNA Injektions fast sicher verwendet beeinflusst die Expressionseffizienz. Höhere Dosen können zu einem erhöhten Anteil an Zellen, die das Transgen exprimieren, aber mit höheren Konzentrationen an DNA (> 50 ng / ul) führen und Transposase mRNA (> 100 ng / ul) auch das Potential für toxische Wirkungen bei injizierten Embryonen auftreten sollte. Wir bevorzugen die Verwendung von 10 ng / & mgr; l DNA und 20 ng / ul Transposase mRNA für die Injektion, die 50 & mgr; g Plasmid-DNA und 100 & mgr; g RNA pro injizierter emb entsprichtryo. 100% von Embryonen mit diesen Konzentrationen injiziert sie normal zu entwickeln und zwischen 40-70% Show eGFP-HRAS G12V Ausdruck, nach 4-OHT Induktion, abhängig von der Injektionseffizienz in die Einzelzelle. Unter positiven Embryonen wir in der Regel finden etwa 30%, die von 1 bis 10 Klone, 40%, die 10 bis 50 Klone und 30% mit mehr als 50 Klone. Durch unsere Forschungsziele, bevorzugen wir die Verwendung von Embryonen mit weniger Klone eGFP-HRAS G12V auszudrücken. Wir wählen Embryonen mit 10 bis 50 Klone für unsere transiente Experimente. Für die Erzeugung von transgenen Gründer Fisch, empfehlen wir nur wählen Embryonen sowohl mit dem eGFP positiven Herzmarker und einer großen Anzahl von eGFP-HRAS G12V positive Klone in ihrer Epidermis.
(Z) -4-Hydroxytamoxifen erfährt eine cis-trans (EZ) Umwandlung, wenn sie Licht ausgesetzt sind 24. Es wurde festgestellt, dass das cis-Isomer (E) 100-fach weniger anti-östrogene als trans-Pendants 25,26. Exposure Licht muss daher vermieden werden. Das in Ethanol gelöste 4-OHT-Stammlösung bei -20 ° C in der Dunkelheit über einen langen Zeitraum gelagert werden. Wir empfehlen die Verwendung einer Box, um die Petrischalen von Licht während Zielgen Induktion innerhalb des Inkubators und des Transports zu schützen. Obwohl das Gebiet von Abbildungs sehr klein ist und die Belichtung von 4-OHT mit UV-Licht wird auf ein Minimum, ein ständiger Austausch von Induktionslösung reduziert alle 2 Stunden während Bildgebung über längere Zeiträume ist, um eine maximale Expressionsspiegel aufrechtzuerhalten. 4-OHT effektiv permeabilisiert durch das Chorion und die äußersten Hautschichten während der Zebrafischembryogenese, kann daher Genexpression sehr schnell zu induzieren. Man kann leicht erkennen, eGFP Emission nach 2 h Induktion und es wurde berichtet, dass die ersten Zeichen der Zielgenexpression kann nach 1 Stunde und nach 3 h Plateau Behandlungs 8 beobachtet werden. Die Unterschiede können aufgrund der unterschiedlichen Promotor in unserer Studie verwendet werden. Wie bereits previously berichtet, dass 4-OHT Behandlung dosisabhängig ist 8,27, haben wir uns um die höchste berichtete Konzentration von 5 uM verwenden, um zuverlässige und reproduzierbare Expressionsniveaus in unserer transiente Ansatz zu erreichen. Dies soll gewährleisten, dass alle Zellen, die das Transgen Zielgenexpression induzieren.
Es ist zu beachten, dass die vorübergehende hier vorgestellte Ansatz könnte zu unterschiedlichen Expressionsniveaus führen, durch die Möglichkeit, mehrere und zufällige Genom Insertionsereignisse genommen werden. Weiterhin ist die Verwendung der Transposase mRNA im Tol2 transgenen Hintergrund der Tg (UAS: eGFP-HRAS G12V) io006 kann, um mögliche Umsetzungen der UAS Transgen, das in das Gen-Silencing oder Störungen zur Folge haben kann. Als das hier vorgestellte Verfahren stellt eine vorübergehende Ansatz ist jedoch die Vorauswahl von Embryonen im Anschluss an Injektion zwingend. Viele Labors haben gezeigt, dass UAS-Sequenzen sind in der Regel in der transgenen Nachkommen zum Schweigen gebracht werden, damit inProjizieren des pTol2-KRT4: KalTA4-ER T2; cmlc2: eGFP Konstrukts in Tg (UAS: eGFP-HRAS G12V) io006 Embryonen möglicherweise nicht so effizient wie eine Injektion von UAS in Tg (KRT4 konstruieren: KalTA4-ER T2; cmlc2: GFP ) Embryonen. Die Verwendung des stabilen transgenen Linie Tg (KRT4: KalTA4-ER T2) gekreuzt mit Tg (UAS: eGFP-HRAS G12V) io006 Eine genaue Überwachung der Ein- / Aus-Kinetik der zeitabhängige Dosierung 4-OHT Genaktivierung ermöglichen .
Ein entscheidender Schritt bei der Montage der Larven ist die Überführung in die LMP Agarose und auf dem Deckglas (1B). Es ist nur eine kurze Zeitrahmen für flüssige LMP-Agarose Temperatur, die eine sichere Übertragung und die Ausrichtung des vorgewählten Larven ermöglicht, ohne die Fische entweder durch Hitzeschock oder Härtung des Gels. Die Larven sollten direkt auf dem Deckglas ausgerichtet, um den Arbeitsabstand für die anschließende mikroskopische analy vermindernsis. Da dies ein limitierender Faktor bei der Mikroskopie ist die Auswahl geeigneter Ziele ist obligatorisch. Einmal montiert, kann die Larve von Stunden bis Tagen eingehalten werden.
Die Konditionalität des Modellsystems hier vorgestellten ermöglicht wiederholte Transformation von 4-OHT Aktivierung des Transgens. Das Expressionssystem ist abhängig von der Gegenwart von 4-OHT und damit die KalTA4 kontrollierten Expression eines Gens von Interesse ist reversibel (1D, b). Im Gegensatz zu dem Cre-ER T2 / Lox-System, das eine irreversible genomische Rekombinationsereignis 28 erleichtert, kann KalTA4-ER T2 / UAS aktiviert und durch Zugabe oder Entfernung von 4-OHT deaktiviert und dieses Potential für wiederholte Induktion ist ein Vorteil der die Technik auf das Cre-ER T2 / lox-System. Die Forderung nach einem konstanten Niveau von 4-OHT ist jedoch dadurch eingeschränkt, wenn der Versuch zu Tage bis Wochen verlängert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (Z)-4-Hydroxytamoxifen | Sigma Aldrich | H7904 | dilute in ethanol and store in the dark at -20 °C |
| 20X Objective | Zeiss | 20X/0.5 Ph2 ∞/0.17 | |
| 40X Objective | Zeiss | 40X/1.2W Korr ∞/0.14-0.18 | |
| 63X Objective | Zeiss | 63X/1.4 Oil Ph3 ∞/0.17 | |
| BamHI | New England Biolabs | R0136S | |
| Confocal Microscope | Zeiss | LSM 510 META | |
| Cover glass | VWR | 631-0171 | Diameter 25 mm |
| Dimethylpolysiloxane | Sigma Aldrich | DMPSV | |
| Dow Corning high-vacuum silicone grease | Sigma Aldrich | MKBL4135V | |
| Flaming/Brown P-97 Micropipette Puller | Sutter Instruments Co. | P-97 | Program: heat 530, pull 200, velocity 80, and time 150 |
| Fluorescent stereoscope | Leica | M205 FA | |
| Kwik-Fill Brosilicate Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B100F-4 | |
| Microinjection mold TU-1 | Adaptive Science Tools | TU-1 | |
| Microloader tip | Eppendorf | 930001007 | |
| Microscope | Zeiss | Axiovert 200 | |
| mMESSAGE mMACHINE Kit | Ambion | AM1348 | |
| Nuclease-free water | Invitrogen | AM9937 | |
| Pneumatic pico pump | World Precision Instruments | PV820 | |
| Pneumatic pico pump | Warner Instruments | PLI-90A | |
| pTol2-krt4:KalTA4-ERT2;cmlc2:eGFP | Dr. Thomas Ramezani/Yi Feng Lab/The University of Edinburgh | ||
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Quiagen | 27106 | |
| Rhodamine B isothiocyanate-Dextran | Sigma Aldrich | R8881 | 10 mg/μl in water |
| Stereoscope | Leica | M80 | |
| Tg(lysC:dsRed2)nz50Tg | BMC Developmental Biology 7, 42, doi:10.1186/1471-213X-7-42 (2007) | ||
| Tg(UAS:eGFP-HRASG12V)io006 | PloS One 5 (12), e15170, doi:10.1371/journal.pone.0015170 (2010) | ||
| Tricaine/MS-222 | Sigma Aldrich | A5040 | |
| UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500-100 | |
| UltraPure Low Melting Point Agarose | Invitrogen | 16520-050 | |
| UltraPure Phenol : Chloroform : Isoamyl Alcohol | Invitrogen | 15593-031 | 25:24:1, v/v |
References
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