Summary
לומד את האירועים המוקדמים ביותר של התפתחות תא preneoplastic ואינטראקציה תא חיסון מולדת הוא מרכזי להבנה ולטיפול בסרטן. כאן אנו מתארים שיטה לגרום לתנאי תמורות תאי אפיתל והדמית החיה הבאה של אינטראקציה תא חיסון מולדת עם G12V HRAS לבטא בתאי עור בזחלי דג הזברה.
Introduction
צמיחת היתר של צאצאי תא preneoplastic בתוך גיליון אפיתל אחרת נורמלי מאוד תלויה אינטראקציה עם מייקרו-הסביבה שלה. האינטראקציה עם רקמת המארח שלה עשויה להיות הגורם המכריע באם תא preneoplastic הוא מסוגל להקים נישה משובט כדי לפתח עוד יותר לסרטן מפוצץ מלא. למרות חשיבותה בהתפתחות, שלב ראשוני זה של התקדמות הסרטן אינו נגיש במערכות מודל הנפוצות ביותר, in vivo.
דג הזברה, Danio rerio, הוא אורגניזם מודל מבוסס היטב ללימודי הדמיה לחיות בגלל השקיפות שלה בכל התפתחות, האפשרות למניפולציה גנטית, והנגישות לתרופות מסיסות במים. מחקרים שנעשה לאחרונה תוך שימוש במודל דג הזברה זחל, ביתר אונקוגן אדם HRAS G12V להפוך לתאי האפיתל, הראו כי תא מארח נגזר אותות, בH 2 O מסוים יתרון 2 להגיוס של תאים חיסוניים מולדים. מעניין לציין, כי התאים, נויטרופילים ומקרופגים חיסוניים גייסו, הוצגו ליש להם תפקיד בתמיכה תזונתי תא preneoplastic התפשטות 2,3.
כדי להבין את האירועים המוקדמים של התחלה של גידול והתקדמות, כמו גם את התרומה של תגובה דלקתית, אחד צריך להיות מסוגל תמונת האירועים הללו מנקודת הזמן המוקדמת ביותר ואילך. לכן יש צורך לשלוט בשינויי תא באופן ספציפי זמני ורקמות. אנו מנצלים את המערכת / כטב"מ Gal4 שהותאם בהצלחה מ4 תסיסנית להביע תנאי אונקוגן אדם HRAS G12V תחת שליטתו של קרטין אמרגן ספציפי עור 4 (krt4) 5. הגרסה שונה של activator Gal4 תעתיק, כלומר KalTA4 6, מאפשרת ביטוי של HRAS G12V תחת שליטתו של Upstream ההפעלה של הרצף (כטב"מ). תנאים כדי לגרום לביטוי activator תעתיק, KalTA4 כבר התמזג תחום המוטציה מחייב ליגנד של α קולטן אסטרוגן האנושי (T2 ER) 7 אשר נקשר באופן ספציפי 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT) 1. בהעדר 4-OHT T2 ER כרוך בציטופלסמה על ידי חלבוני חום-הלם. על 4-OHT מחייב חום-הלם חלבונים לנתק, המאפשר טרנסלוקציה גרעינית של KalTA4-ER T2 והפעלה הבאה של כטב"מ המבוקר גן של עניין 8 (איור 1 ג, ב). כמערכת ביטוי, זה תלויה בנוכחות של 4-OHT, ביטוי KalTA4 המבוקר של גן של עניין הוא הפיך. בניגוד לT2 Cre-ER / המערכת לקס, מה שמוביל לאירוע רקומבינציה בלתי הפיך, האינדוקציה של הפעלת תעתיק ידי KalTA4-ER T2 היא הפיכה על ידי תוספת או גריעה של 4-OHT.
Allo הפרוטוקול הבא ws שינוי מותנה של תאי עור בזחלי דג הזברה וניטור הבא של האינטראקציה עם תאים חיסוניים מולדים על ידי ביטוי חלבון פלואורסצנטי. מתודולוגיות הבסיסיות המועסקות בפרוטוקול זה דומות לכמה טכניקות נפוצות בקהילת דג הזברה 9-13.
הדור ושימוש הקומבינטורית של קווים מהונדסים יחד עם microinjection של מבנים מהונדסים מאפשרים גישה חולפת להפוך רק תאים בודדים באופן פסיפס. חדירות החמצן של עור דג הזברה העוברי וזחל מעלה את האפשרות ללימודי הדמיה לחיות זמן לשגות על ידי מיקרוסקופ ברזולוציה גבוהה משעות עד ימים. יתר על כן, נגישותו לתרופות מסיסות במים תאפשר מחקרים מכניסטית עתיד והניטור של אירועים ביולוגיים תא in vivo שעלול להוביל להבנה טובה יותר של השלבים המוקדמים ביותר של התפתחות הסרטן.
_content "> פרוטוקול זה יכול להיות מותאם כדי לבצע ביטוי גנים מותנה בכל רקמות של עניין בזחלי דג הזברה, באופן פסיפס. אפשר גם לייעל את מיקרוסקופ הגדרה כדי לחיות תמונת רקמות עמוקות יותר אחרות מאשר עור.Protocol
הפרוצדורות הבאות נערכו בהתאם קפדן עם בעלי חיים (הליכים מדעיים) Act 1986.
1. הכנת פלסמיד DNA לMicroinjection
- לטהר את הפלסמיד pTol2-krt4: T2 KalTA4-ER; cmlc2: eGFP עם ערכת טיהור פלסמיד דנ"א מסחרית בהתאם להוראות היצרן ולדלל את ה- DNA פלסמיד לריכוז פתרון המניות סופי של 100 ng / μl.
- Linearize transposase מכיל pT3TS פלסמיד / 14 Tol2 ידי עיכול הגבלת BamHI, בעקבות הפרוטוקול של היצרן. ניתן להאריך צעד זה לילה. להאיץ את ה- DNA לינארית על ידי מיצוי פנול / כלורופורם, בעקבות הפרוטוקול הסטנדרטי.
- במבחנה לתמלל mRNA transposase מפלסמיד לינארית עם ערכת שעתוק מסחרית לכמויות גדולות של RNA כתרים על פי הוראות היצרן, לדלל וaliquot לריכוז סופי פתרון מניות של 100 ng / μl במי nuclease חינם. להבטיח את האיכות של RNA המטוהר עם 1-2% ילידי טה (40 מ"מ טריס, חומצה אצטית 20 מ"מ, 1 mM EDTA) אלקטרופורזה agarose ג'ל (80-120 V). אחסן את RNA ב -80 ° C.
2. Microinjection של פלסמיד DNA על ביטוי גני חלוף
- הכן צלחת הזרקת agarose להחזיק את הביצים המופרות במהלך הזרקה. יוצקים agarose 3% נוזל לתוך צלחת פטרי 90 מ"מ. בוא מגניב agarose 40-50 מעלות צלזיוס ומוסיף את עובש microinjection תקוע בצורת TU-1 על גבי agarose הנוזלי. לאחר התקשות בטמפרטורת חדר, בואו שאר agarose על 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות לפני הסרת העובש. תבניות microinjection החנות ב 4 ° C ושימוש חוזרים.
- הכן aliquot של פתרון ההזרקה. בצע את השלבים הבאים על קרח. פיפטה 1 μl של DNA פלסמיד (ריכוז סופי של 10 ng / μl), 2 μl של mRNA transposase (ריכוז 20 ng / μl סופי), 2μl של 10 מ"ג / Rhodamine B isothiocyanate-Dextran μl, 2 μl של פתרון 5x Danieau (290 מ"מ NaCl, 3.5 מ"מ KCl, 2 מ"מ MgSO 4, 3 מ"מ Ca (NO 3) 2, 25 מ"מ HEPES, pH 7.6) ל נפח סופי של 10 μl במי nuclease חינם.
- הכן מחטים מנימי זכוכית בורוסיליקט בקוטר 1 מ"מ המכילות חוט להט פנימי על ידי משיכת הנימים בכיוונים מנוגדים עם חולץ micropipette. השתמש בתכנית הבאה: חום 530, למשוך 200, מהירות 80 וזמן 150.
- מלא מחט אחת עם 2 μl של פתרון ההזרקה (כל הזמן על קרח). הימנע מבועות על ידי משיכת בזהירות את קצה microloader תוך שחרור הפתרון לנימים. זהירות לשבור את קצה המחט עם מלקחיים.
- להסדיר את גודל הטיפה עם משאבת pico פנאומטי. מדוד את קוטר טיפה / הנפח (V = 4/3 πr 3) ולהתאים את גודל הטיפה עם מיקרומטר עיני תחת stereoscope בdimethylpolysiloxane. אנו ממליצים100 מיקרומטר, מקביל לרמה של 0.5 nl. זה מבטיח ריכוזים אחידים ושחזור לכל עובר מוזרק. לכייל הריכוז המוזרק ולהתאים לכל מבנה והכנת פלסמיד.
- הנח את zygotes (איור 1 א) המתקבל מצלב של Tg (כטב"מ: eGFP-HRAS G12V) io006 15 עם Tg (lysC: dsRed2) nz50Tg 16 לתוך התבניות של צלחת ההזרקה ידי שימוש בpastette 3 מיליליטר. בינתיים, לשמור על קצה מחט הזריקה מוכנה מראש בdimethylpolysiloxane כדי למנוע את הפתרון מהתייבשות וקרישה.
- להזריק את ירידת premeasured (100 מיקרומטר המקביל לרמה של 0.5 nl) תחת stereoscope הדרך סיסית לblastodisc 17, (איור 1 א) לפני המחשוף הראשון. הזרקה לתוך השלב אחד התא מגדילה את הפוטנציאל של התפלגות אחידה של פלסמיד דנ"א ורנ"א במסת תאי פיתוח והאפשרות לשידור בתאי מין. זהראוי לציון כי הביטוי של מבנים לעתים קרובות יותר נוטה להיות פסיפס.
3. שינוי תא עור מותנה על ידי 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT)
- מעביר את העוברים הוחדרו לתוך פתרון 0.3x Danieau ולשמור אותם על 28.5 מעלות צלזיוס בחממה. הסר ביצים מופרה מהצלחת בשלב תחום 17. -הזריק שיתוף Rhodamine B isothiocyanate-dextran יכול להיות מנוצל כמו הזרקת שליטה תחת stereoscope ניאון.
- עוברי מסך ב 24 hpf (שעות שלאחר הפריה) לביטוי לב של eGFP. תמשיך להעלות cmlc: עוברי דג הזברה חיוביים eGFP עד 72 hpf. לפקח בזהירות את המים באיכות (0.3x Danieau).
- הסר את סיסית מאותם עוברים שלא בקעו עם מלקחיים ב 72 hpf. לתקוע בזהירות סיסית עם 1 מלקחיים ולפרק אותו על ידי שימוש באחר. עוברים בחרו לlysC: ביטוי dsRed2 באמצעות stereoscope ניאון.
- הוסף 10 μl של 10 מ"מהמניה של (Z) -4-Hydroxytamoxifen 20 מיליליטר של תמיסת 0.3x Danieau (ריכוז סופי של 5 מיקרומטר). השתמש באינדוקצית פתרון 4-OHT לצלחת אחת סטנדרטית פטרי (90 מ"מ) בקבוצה של 40-60 עוברים.
- מעביר את העוברים לתוך צלחת פטרי המכילה חדשה 20 מיליליטר של אינדוקצית פתרון טרי. 4-OHT יש לאחסן וטפל בחושך. הסימנים הראשונים של ביטוי ניתן לזהות תחילת לאחר אינדוקציה שעה 2. ניתן להאריך האינדוקציה-צעד לילה, תוך התחשבות כי תא מארח ראשוני: אינטראקציות תא preneoplastic יכולים להתרחש כבר כמה שעות לאחר טיפול.
4. הרכבה והדמיה חיה של דג הזברה זחלים
- הכן צלחת פטרי 60 מ"מ על ידי החדרת חור בקוטר של 18-20 מ"מ. השתמש גריז סיליקון ואקום גבוה כדי לכסות ולאטום את החור בתחתית החיצונית של צלחת פטרי עם מכסה זכוכית 25 מ"מ (איור 1).
- הכן 1% agarose נקודת התכה נמוך (LMP). שמור צינור 1.5 מיליליטר אחדשל agarose LMP על 37 מעלות צלזיוס בבלוק חימום.
- מיון הקפדני Tg (krt4: T2 KalTA4-ER; כטב"מ: eGFP-HRAS G12V; lysC: dsRed2) זחלים לתא ירוק ניאון עור וביטוי dsRed2 חיובי מולדים תאים חיסוניים, תחת stereoscope ניאון. להרדים זחלים על ידי התוספת של 1 מיליליטר של 0.4% tricaine 18 לפתרון האינדוקציה 20 מיליליטר.
- העבר את הזחלים שנבחרו מראש עם pastette לagarose LMP הנוזלי. בואו הזחלים לשקוע LMP agarose ולהעביר אותם על מכסה הזכוכית (איור 1). להתמצא עובר תחת stereoscope. הזחלים צריכים להיות ממוקמים על משטח הזכוכית ישירות להפחית את מרחק העבודה (עד 6 זחלים).
- לכסות את agarose LMP עם tricaine מכילה פתרון אינדוקציה לאחר שהתקשה (חץ איור 1).
- תמונת הזחלים המוטבעים באמצעות ניאון הפוך, לייזר סריקה או מיקרוסקופ confocal דיסק מסתובב. השתמש 40X או 63Xמטרה כמטרות במרחקים ארוכה עובדים מאפשרת התמקדות בכל הזחלים.
Representative Results
Zygotes של הכלאה בין Tg (כטב"מ: eGFP-HRAS G12V) io006 וTg (lysC: dsRed2) nz50Tg נאסף 10-15 דקות לאחר הפריה (איור 1 א) כדי לקבל עוברי תא בשלב 1. לאחר הזרקת העוברים הועלו עד 3 DPF, לפני גיוס עם 4-OHT והרכבת הדמיה חיה (איור 1). 2-6 שעות לאחר אינדוקציה העוברים רכובים הונחו גם תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך (איור 2 א) או מיקרוסקופ הפוך confocal (איור 2 ב-ג) וצלמתי במשך שעה 2-3 במרווחי 1.5 דקות. ניתן לזהות תאי עור שטחיים Preneoplastic ידי המורפולוגיה המעוגלת יותר שלהם בהשוואה לקרטינוציטים רגילים, כמו גם את פליטת הניאון הירוקה של הקרום המקומי eGFP-HRAS G12V. תחומי ההדמיה, שנבחרו לשיתוף לוקליזציה של תאי עור ותאי preneoplastic מולדים חיסוניים (חץ איור 2 א). בשל mig המהירתהליך המנה של נויטרופילים מרווחי הזמן לשגות נבחרו להיות בין 1-1.5 דקות עם גדלי צעד ערימת Z של .7-1.7 מיקרומטר להשיג תחזיות מרבי עוצמה (איור 2, 1 וידאו). יש מגוון רחב של התנהגויות שניתן לראות בזמן ההדמיה חיה: נויטרופילים להעביר ליד ותחת תאי preneoplastic (איור 2 ג, 1 וידאו), יוצרים קשר ישיר לתאים (איור 2 ו- C), להסיר שאריות של תאי preneoplastic שעוברים אפופטוזיס (וידאו 1), או באופן פעיל לבלוע חלקים של תאי preneoplastic (לא מוצג). כדי ללכוד את הספקטרום המלא של אינטראקציות, רצוי לעקוב ההתנהגויות שלהם על ידי הדמיה לחיות זמן לשגות.
איור 1: סכמטי לשינוי תא עור מותנה בזחלי דג הזברה. תמונה של הזיגוטה של Tg (כטב"מ (): eGFP-HRAS G12V; LysC: דג הזברה dsRed2) בשעה 10 דקות שלאחר הפריה (MPF). הביצית המופרית מוקפת סיסית (ראש החץ). האתר להזרקה הוא blastodisc (הכוכבית), שהוקם על ידי זרמי cytoplasmic מהחלמון (החץ) המגדיר את מוט החיה של העובר. הרכבה (B) של זחלי דג הזברה. 60 מ"מ צלחת פטרי עם חור מ"מ 18-20 (ראש חץ) שהוא חתומה על ידי מכסה זכוכית 25 מ"מ. זחלי דג הזברה הם משותקים ורכובים על גבי מכסה הזכוכית ב -1% agarose LMP. פתרון 0.3x Danieau (חץ) המכיל 5 מיקרומטר 4-OHT משמש לכיסוי agarose LMP. (C)-OHT 4 מושרה תמורות של תאי עור שטחיים. (א) פרופיל חתך סכמטי של עור זחל. העור העוברי וזחל מורכב משתי שכבות של תאי האפיתל, שכבת תא שטחית ושכבת תאי בסיס של קרטינוציטים שמחוברים לקרום במרתף הבסיס (BM). T מערכת הביטוי חולף (ב)o לגרום לשיבוט תאי preneoplastic בין תאי עור שטחיים. KalTA4-ER T2 בא לידי ביטוי אך ורק בשכבת העור החיצונית ביותר מונעת על ידי האמרגן krt4 (הצהוב). ביטוי פסיפס של KalTA4-ER T2 מפעיל כטב"מ מבוקר ביטוי G12V (כחול) eGFP-HRAS בתאים שטחיים, שמוביל לשיבוט של תאי preneoplastic (ירוק). (ד) סכמטי של מערכת הביטוי החולפת. (א) קלטת Tol2 של pTol2-krt4: KalTA4-ER T2; cmlc2: וקטור ביטוי eGFP משמש זמני (ב) אינדוקציה מותנית של ביטוי activator תעתיק.. KalTA4 הוא התמזגה לתחום מחייב ליגנד המוטציה של α קולטן אסטרוגן האנושי (T2 ER) אשר נקשר באופן ספציפי 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT). בהעדר 4-OHT T2 ER כרוך בציטופלסמה על ידי חלבוני חום-הלם (Hsp90). על 4-OHT מחייב Hsp90 dissociates, המאפשר טרנסלוקציה גרעינית של KalTA4-ERT2 וההפעלה הבאה של כטב"מ המבוקר ביטוי eGFP-HRAS G12V. בר סולם = 500 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של הדמות.
איור 2: הדמיה חיה של אינטראקציה תא חיסון preneoplastic והמולדת. (AC) תמונות של 4 DPF Tg (כטב"מ: eGFP-HRAS G12V; lysC: dsRed2) עובר, שכבר הזריק עם pTol2-krt4: T2 KalTA4-ER; cmlc2: eGFP וmRNA transposase בשלב תא אחד. תמונות צולמו לאחר 6 שעות של אינדוקציה 4-OHT (א) להציג לרוחבו של אזור הסנפיר ב -6 שעות שלאחר טיפול, מראה כתמי G12V eGFP-HRAS לבטא בתאי עור (חץ), וlysC:. DsRed2 + נויטרופילים (ראש חץ). (BC) נציג תמונות taקן מסרט הזמן לשגות confocal, מראה נויטרופילים (אדום) אינטראקציות עם תאי G12V eGFP-HRAS להביע עור (ירוק). (ב) תא preneoplastic יוצר סיומת filopodial קצרה עם נויטרופילים (ראש החץ) פנייה. (C) נויטרופילים (אדום) נמצא בקשר קרוב לשיבוט של תאי עור preneoplastic (ירוק). בר סולם ב= 100 מיקרומטר; B / C = 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של הדמות.
1 וידאו: הדמיה לחיות זמן לשגות של אינטראקציה תא חיסון preneoplastic והמולדת. זמן לשגות של 4 DPF Tg (כטב"מ: eGFP-HRAS G12V; lysC: dsRed2) עובר, הוזרק לי pTol2-krt4: T2 KalTA4-ER; cmlc2: eGFP וmRNA transposase בשלב תא אחד. סרט הזמן לשגות Confocal ב 6-9 הואורס לאחר 4-OHT אינדוקציה מראה lysC: נויטרופילים dsRed2 + (אדום) אינטראקציות עם תאי G12V eGFP-HRAS להביע עור (ירוק). נויטרופילים להעביר ליד ותחת תאי preneoplastic ולהסיר שאריות של תאי preneoplastic שעוברים אפופטוזיס. מרווחי זמן לשגות של 1.5 דקות על פני 3 שעות עם גדלי צעד ערימת Z של 1.3 מיקרומטר.
Discussion
במהלך embryogenesis ופיתוח זחל, עור דג הזברה העוברי מורכב משתי שכבות אפיתל, periderm נקרא השכבה השטחית ושכבה של קרטינוציטים בסיסיים המחוברים לקרום במרתף הבסיסי 19 (איור 1 ג, א). הפרוטוקול המובא כאן מתאר שיטה פשוטה כדי לגרום לשינוי preneoplastic תאים בשכבת העור השטחית של זחלי דג הזברה על תנאי, ומאפשר ניתוח אינטראקציה שלאחר מכן עם תאים חיסוניים מולדים על ידי הדמיה לחיות. מתודולוגיות הבסיסיות בפרוטוקול שלנו לעקוב אחר טכניקות דג הזברה מבוססות היטב 9-13, והפרוטוקול שלנו יכול להיות מותאם בקלות ובשינוי.
אמרגן krt4 5 משמש כאן מניע ביטוי T2 KalTA4-ER במיוחד בשכבת העור החיצונית ביותר (איור 1 ג, ב). עם זאת, המרובה אתרי Gateway מודולרישיבוט אסטרטגיה, המשמשת לייצור krt4: מבנה T2 KalTA4-ER (1D איור,), מספק את האפשרות לשבט כל אמרגן של עניין מול T2 KalTA4-ER בצעד שיבוט יחיד. הסתגלות של השיטה המוצגת במסמך זה ולכן אפשרי עבור רוב הרקמות בעובר ושלבי זחל. הזמינות של רצפי אמרגן היא זאת הגורם המגביל. יתר על כן, כמעט בכל גן של העניין המשובט מאחורי כטב"מ ניתן ביטוי יתר תנאים בשלבי התפתחותיים שונים על ידי שימוש בביטוי T2 KalTA4-ER המרחבית ובזמן בשליטה. לכן, הפרוטוקול שלנו יכול להיות מותאם כדי לבצע ביטוי גנים מותנה בכל רקמות של עניין בזחלי דג הזברה, באופן פסיפס. אפשר גם לייעל את מיקרוסקופ הגדרה כדי לחיות תמונת רקמות עמוקות יותר כגון כבד או לבלב.
שתארנו יישום אחד תוך שימוש בפרוטוקול שהואמחדש, באופן דומה, ניתן ביטוי יתר מאפנני דלקת אחרים תוך שימוש בפרוטוקול זה כדי ללמוד את הרגולציה של תגובות דלקתיות, כאחד יכול נויטרופילים תמונה בקלות חיים ושינויים התנהגותיים מקרופאג הבא האינדוקציה ומעצרים בביטוי של מאפנן דלקתי מועמד. יתר על כן, הפרוטוקול המותאם יהיה גם מועיל למי שרוצה לעקוב אחר תנועה של תאים ושינוי התנהגות בשלבים שונים של המורפוגנזה רקמה והיווצרות איברים ו, תמונה סוף סוף לחיות את האינטראקציה של אינטראקציות תא חיסון מולדים עם שושלות תאים ספציפיות אחרות שיכולה להיות ממוקדת על ידי מערכת ביטוי T2 / כטב"מ KalTA4-ER מושרה.
השתמשנו וקטור pDestTol2CG מTol2kit דג הזברה 20-23 המכיל cmlc2: eGFP-הרשות הפלסטינית קלטת (1D איור,) המאפשרת בחירה הבאה של עוברים על ידי לב חיובי ניאון ירוק כseסמן lection 20, המפשט את תהליך מיון F0. הכנסה יציבה של גן transposon מוקף עניין לתוך הגנום היא הקלה על ידי הזרקה המשותפת של ה- DNA פלסמיד יחד עם mRNA transposase. ההכנה של ה- DNA פלסמיד וmRNA transposase לmicroinjection כדלקמן פרוטוקולים סטנדרטיים. עם זאת, שילוב מוצלח של המבנה לתוך הגנום תלוי בהעתקה מבוססת Tol2 14. זה מדגיש את תשומת הלב המיוחדת שתשולם לעבודה על קרח בתנאים סטריליים כדי למנוע זיהומים והשפלות על ידי RNases וDNases. Microinjection לעוברי שלב אחד תא הוא טכניקה חזקה ומבוססת היטב לרווח והפסד של מחקרים לתפקד ב9,10 דג הזברה. למרות שאדם מאומן היטב בקלות יכול להזריק לתוך החלמון של מעל 1,000 עוברים בשעה 1, ההזרקה לblastodisc (איור 1 א, כוכבית) דורשת יותר ניסיון והכשרה. קריטי במהלך הליך זה אניזה הטיפול במחט. המחט צריכה להיות דק מאוד לחדור לתא ללא נזק, ולכן צריכה להיות שנשברה רק על הקצה שלה מאוד. חשוב לשלוט באופן קבוע ולמדוד את גודל הירידה במהלך ההזרקה כדי להבטיח הזרקה אחידה לכל עובר. מטופל בזהירות, את המחט ניתן להשתמש כדי לסובב את העובר. זה נחוץ לעתים קרובות כדי למצוא את blastodisc וזווית החדירה האופטימלית.
הריכוז של mRNA DNA וtransposase המשמש להזרקה כמעט בודאות משפיע על יעילות הביטוי. מינונים גבוהים יותר יכולים להוביל לעליית משקלם של תאים המבטאים את הגן, אבל עם ריכוזים גבוהים יותר של ה- DNA (> 50 ng / μl) וtransposase mRNA (> 100 ng / μl) גם הפוטנציאל להשפעות רעילות בקרב עוברים מוזרקים אינו מתעורר. אנחנו בעד השימוש של 10 ng / μl DNA ו- 20 ng / μl transposase mRNA להזרקה, אשר תואם את 50 pg של פלסמיד דנ"א ורנ"א 100 pg לEMB הזריקryo. של עוברים מוזרקים עם ריכוזים אלה 100% מפתחים בדרך כלל, ובין 40-70% ביטוי G12V תכנית eGFP-HRAS, לאחר אינדוקציה 4-OHT, בהתאם ליעילות ההזרקה לתוך התא הבודד. בין עוברים חיוביים שאנחנו בדרך כלל למצוא כ -30% שיש לי 1-10 שיבוטים, 40% שיש לי 10-50 שיבוטים ו -30% שיש יותר מ 50 שיבוטים. בשל מטרות המחקר שלנו, אנו דוגלים בשימוש בעוברים עם פחות שיבוטים להביע G12V eGFP-HRAS. אנו בוחרים עוברים עם 10-50 שיבוטים לניסויים חולפים שלנו. עבור הדור של דגי מייסד מהונדסים, אנו ממליצים לבחור עוברים עם שני סמן eGFP החיובי הלב ומספר גדול של שיבוטים חיוביים eGFP-HRAS G12V באפידרמיס בלבד.
(Z) -4-Hydroxytamoxifen עובר מרה הדדית cis-טרנס (EZ) כאשר הם נחשפים לאור 24. נמצא כי האיזומר cis (E) הוא 100x אנטי-אסטרוגניים פחות מעמיתו טרנס 25,26. Exposurדואר לאור ולכן יש להימנע. פתרון מניות 4-OHT מומס באתנול ניתן לאחסן ב -20 ° C בחושך על פני תקופה ארוכה. אנו ממליצים על השימוש בתיבה כדי להגן על צלחות פטרי מהאור במהלך האינדוקציה גן המטרה בחממה והתחבורה. למרות שהשטח של הדמיה הוא מאוד קטן וחשיפה של 4-OHT לאור UV מצטמצם למינימום, חליפין קבועים של פתרון אינדוקציה כל 2 שעות בזמן הדמיה פני תקופות זמן ארוכות יותר מומלצת כדי לשמור על רמות ביטוי המרביות. 4-OHT permeabilizes יעילות הדרך סיסית ושכבות העור החיצוניות ביותר בעובר דג הזברה, ולכן זה יכול לגרום לביטוי גנים בקצב מהיר מאוד. אנחנו בקלות יכולות לראות פליטת eGFP לאחר 2 שעות של אינדוקציה וזה כבר דווח כי סימנים הראשונים של ביטוי היעד-גן ניתן לצפות לאחר שעה 1 ורמה לאחר 3 שעות של טיפול 8. ההבדלים יכולים להיות בגלל האמרגן שונה ששמש במחקר שלנו. כיש יחסי ציבור היהדיווחו eviously ש4-OHT טיפול במינון 8,27 תלויים, בחרנו להשתמש בריכוז המדווח הגבוה ביותר של 5 מיקרומטר להשיג רמות ביטוי חזקות ושחזור בגישה החולפת שלנו. זה צריך להבטיח שכל התאים הנושאים את הגן יגרמו לביטוי גן המטרה.
יש לה שיש לקחת בחשבון שהגישה החולפת הציגה כאן עלולה להוביל לרמות ביטוי שונות בשל האפשרות של אירועי החדרת הגנום מרובים ואקראיים. יתר על כן, השימוש בmRNA transposase ברקע המהונדס Tol2 של Tg (כטב"מ: eGFP-HRAS G12V) io006 יכול להוביל לחילופים ופוטנציאל של transgene כטב"מ שעלול לגרום להשתקת גנים או שיבוש. עם זאת, כשיטת המוצגת כאן מייצגת גישה חולפת, המיון המוקדם של עוברים לאחר הזרקה הוא חובה. מעבדות רבות מצאו כי רצפי כטב"מ נוטים להיות מושתקים בצאצאים מהונדסים, ומכאן בjecting pTol2-krt4: T2 KalTA4-ER; cmlc2: eGFP לבנות לתוך Tg (כטב"מ: eGFP-HRAS G12V) io006 עוברים לא יכול להיות יעיל כמו הזרקת כטב"מ לבנות לתוך Tg (krt4: T2 KalTA4-ER; cmlc2: GFP עוברים). השימוש בקו המהונדס היציב Tg (krt4: T2 KalTA4-ER) חצה עם Tg (כטב"מ: eGFP-HRAS G12V) io006 יאפשר ניטור מדויק של קינטיקה / כיבוי של זמן מינון הפעלת גן 4-OHT תלוי .
צעד קריטי במהלך ההרכבה של זחלים הוא ההעברה לagarose LMP ועל מכסה הזכוכית (איור 1). יש רק פרק זמן קצר לטמפרטורת agarose LMP נוזלית המאפשר העברה וכיוון בטוחה של הזחלים שנבחרו מראש מבלי לפגוע בדגים או על ידי הלם חום או התקשות של ג'ל. הזחלים צריכים להיות מכוון ישירות על גבי מכסה הזכוכית כדי לצמצם את מרחק העבודה לanaly המיקרוסקופי שלאחר מכןsis. כמו זה יכול להיות גורם מגביל במיקרוסקופיה בחירת המטרות המתאימות היא חובה. ברגע שעלה, הזחל יכול להישמר משעות עד ימים.
ההתניה של מערכת המודל שהוצגה במסמך זה מאפשרת לשינוי חוזר ונשנה של הפעלת 4-OHT של transgene. מערכת הביטוי תלויה בנוכחות של 4-OHT ולכן ביטוי KalTA4 המבוקר של גן של עניין הוא הפיך (1D איור, ב). בניגוד לT2 Cre-ER / המערכת לקס, המאפשרת אירוע רקומבינציה הגנומי בלתי הפיך 28, יכול להיות מופעל על KalTA4-ER T2 / כטב"מ ומנוטרל על תוספת או גריעה של 4-OHT ופוטנציאל זה לזירוז חוזר ונשנה הוא יתרון של הטכניקה מעל T2 המערכת / קס Cre-ER. עם זאת, הדרישה לרמות קבועות של 4-OHT היא מגבלה אם הניסוי צריך להיות ממושך מימים עד שבועות.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (Z)-4-Hydroxytamoxifen | Sigma Aldrich | H7904 | dilute in ethanol and store in the dark at -20 °C |
| 20X Objective | Zeiss | 20X/0.5 Ph2 ∞/0.17 | |
| 40X Objective | Zeiss | 40X/1.2W Korr ∞/0.14-0.18 | |
| 63X Objective | Zeiss | 63X/1.4 Oil Ph3 ∞/0.17 | |
| BamHI | New England Biolabs | R0136S | |
| Confocal Microscope | Zeiss | LSM 510 META | |
| Cover glass | VWR | 631-0171 | Diameter 25 mm |
| Dimethylpolysiloxane | Sigma Aldrich | DMPSV | |
| Dow Corning high-vacuum silicone grease | Sigma Aldrich | MKBL4135V | |
| Flaming/Brown P-97 Micropipette Puller | Sutter Instruments Co. | P-97 | Program: heat 530, pull 200, velocity 80, and time 150 |
| Fluorescent stereoscope | Leica | M205 FA | |
| Kwik-Fill Brosilicate Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B100F-4 | |
| Microinjection mold TU-1 | Adaptive Science Tools | TU-1 | |
| Microloader tip | Eppendorf | 930001007 | |
| Microscope | Zeiss | Axiovert 200 | |
| mMESSAGE mMACHINE Kit | Ambion | AM1348 | |
| Nuclease-free water | Invitrogen | AM9937 | |
| Pneumatic pico pump | World Precision Instruments | PV820 | |
| Pneumatic pico pump | Warner Instruments | PLI-90A | |
| pTol2-krt4:KalTA4-ERT2;cmlc2:eGFP | Dr. Thomas Ramezani/Yi Feng Lab/The University of Edinburgh | ||
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Quiagen | 27106 | |
| Rhodamine B isothiocyanate-Dextran | Sigma Aldrich | R8881 | 10 mg/μl in water |
| Stereoscope | Leica | M80 | |
| Tg(lysC:dsRed2)nz50Tg | BMC Developmental Biology 7, 42, doi:10.1186/1471-213X-7-42 (2007) | ||
| Tg(UAS:eGFP-HRASG12V)io006 | PloS One 5 (12), e15170, doi:10.1371/journal.pone.0015170 (2010) | ||
| Tricaine/MS-222 | Sigma Aldrich | A5040 | |
| UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500-100 | |
| UltraPure Low Melting Point Agarose | Invitrogen | 16520-050 | |
| UltraPure Phenol : Chloroform : Isoamyl Alcohol | Invitrogen | 15593-031 | 25:24:1, v/v |
References
- Kajita, M., Sugimura, K., et al. Filamin acts as a key regulator in epithelial defence against transformed cells. Nature communications. 5, 4428 (2014).
- Feng, Y., Santoriello, C., Mione, M., Hurlstone, A., Martin, P. Live imaging of innate immune cell sensing of transformed cells in zebrafish larvae: parallels between tumor initiation and wound inflammation. PLoS Biology. 8 (12), e1000562 (2010).
- Feng, Y., Renshaw, S., Martin, P. Live Imaging of Tumor Initiation in Zebrafish Larvae Reveals a Trophic Role for Leukocyte-Derived PGE 2. Current Biology. 22 (13), 1253-1259 (2012).
- Halpern, M. E., Rhee, J., Goll, M. G., Akitake, C. M., Parsons, M., Leach, S. D. Gal4/UAS transgenic tools and their application to zebrafish. Zebrafish. 5 (2), 97-110 (2008).
- Gong, Z., Ju, B., et al. fluorescent protein expression in germ-line transmitted transgenic zebrafish under a stratified epithelial promoter from keratin8. Developmental Dynamics an Official Publication of the American Association of Anatomists. 223 (2), 204-215 (2002).
- Distel, M., Wullimann, M. F., Köster, R. W. Optimized Gal4 genetics for permanent gene expression mapping in zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (32), 13365-13370 (2009).
- Feil, R., Wagner, J., Metzger, D., Chambon, P. Regulation of Cre recombinase activity by mutated estrogen receptor ligand-binding domains. Biochemical and Biophysical Research Communications. 237 (3), 752-757 (1997).
- Gerety, S. S., Breau, M. a, Sasai, N., Xu, Q., Briscoe, J., Wilkinson, D. G. An inducible transgene expression system for zebrafish and chick. Development. 140 (10), 2235-2243 (2013).
- Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (27), e1113 (2009).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function. J. Vis. Exp. (25), e1115 (2009).
- Eisenhoffer, G. T., Rosenblatt, J. Live Imaging of Cell Extrusion from the Epidermis of Developing Zebrafish. J. Vis. Exp. (52), e2689 (2011).
- Kague, E., Weber, C., Fisher, S. Mosaic Zebrafish Transgenesis for Evaluating Enhancer Sequences. J. Vis. Exp. (41), e1722 (2010).
- Balciuniene, J., Gene Balciunas, D. Trapping Using Gal4 in Zebrafish. J. Vis. Exp. (79), e50113 (2013).
- Balciunas, D., Wangensteen, K. J., et al. Harnessing a high cargo-capacity transposon for genetic applications in vertebrates. PLoS Genetics. 2 (11), e169 (2006).
- Santoriello, C., Gennaro, E., et al. Kita driven expression of oncogenic HRAS leads to early onset and highly penetrant melanoma in zebrafish. PloS One. 5 (12), e15170 (2010).
- Hall, C., Flores, M. V., Storm, T., Crosier, K., Crosier, P. The zebrafish lysozyme C promoter drives myeloid-specific expression in transgenic fish. BMC Developmental Biology. 7, 42 (2007).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics : an Official Publication of the American Association of Anatomists. 203 (3), 253-310 (1995).
- Westerfield, M. THE ZEBRAFISH BOOK: A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , 5th Edition, University of Oregon Press. Eugene. (2007).
- Le Guellec, D., Morvan-Dubois, G., Sire, J. -Y. Skin development in bony fish with particular emphasis on collagen deposition in the dermis of the zebrafish (Danio rerio). The International Journal of Developmental Biology. 48 (2-3), 217-231 (2004).
- Kwan, K. M., Fujimoto, E., et al. The Tol2kit: a multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs. Developmental Dynamics : an Official Publication of the American Association of Anatomists. 236 (11), 3088-3099 (2007).
- MultiSite Gateway Three- Fragment Vector Construction Kit. Protocols and Product Manuals. 12537-023, Invitrogen life technologies. (2010).
- Petersen, L. K., Stowers, R. S. A Gateway MultiSite Recombination Cloning Toolkit). PLoS ONE. 6 (9), e10 (2011).
- Magnani, E., Bartling, L., Hake, S. From Gateway to MultiSite Gateway in one recombination event. BMC Molecular Biology. 7, 46 (2006).
- Robertson, D. W., Katzenellenbogen, J. A. Synthesis of the (E) and (Z) isomers of the antiestrogen tamoxifen and its metabolite, hydroxytamoxifen, in tritium-labeled form. The Journal of Organic Chemistry. 47 (12), 2387-2393 (1982).
- Murphy, C., Langan-Fahey, S. Structure-function relationships of hydroxylated metabolites of tamoxifen that control the proliferation of estrogen-responsive T47D breast cancer cells in vitro. Molecular. 38 (5), 737-743 (1990).
- Furr, B. J. A., Jordan, V. C. The pharmacology and clinical uses of tamoxifen. Pharmacology & Therapeutics. 25 (2), 127-205 (1984).
- Akerberg, A. a, Stewart, S., Stankunas, K. Spatial and Temporal Control of Transgene Expression in Zebrafish. PloS One. 9 (3), e92217 (2014).
- Hans, S., Kaslin, J., Freudenreich, D., Brand, M. Temporally-controlled site-specific recombination in zebrafish. PloS One. 4 (2), e4640 (2009).
