Protocol
1 Beredning av Kultur Media, cytokiner och gelatin Plates
- Förbered ES cellmedia med hjälp av Dulbeccos Modifikation av Eagles medium (DMEM) med hög glukoshalt och natriumpyruvat. Lägg 20% ESC Kvalificerad fetalt bovint serum (FBS), 1% penicillin / streptomycin, 1% L-glutamin, 1% Hepesbuffert, 1% icke-essentiella aminosyror, 0,1% Gentamicin (50 mg / ml) och 0,1% ( 55 | iM) β-merkaptoetanol. Sterilisera ES-cellmedia genom filtrering.
- Förbered OP9 media genom att göra 1 liter Alpha Minimum Essential Medium (α-MEM) från pulver enligt tillverkarens anvisningar. Lägg 20% fetalt bovint serum (FBS) och 1% penicillin / streptomycin. Vänd för att blanda. Sterilisera genom filtrering i två 500 ml portioner.
OBS: Användning av media gjorda av pulver rekommenderas och kommer sannolikt att ge förbättrad underhålls OP9 celler och in vitro differentiering resultat. Detta tillvägagångssätt har blivit vår standardprocedur. Men vi noterar också that Vi har ibland använt färdiga flytande α-MEM med tillräcklig framgång. - Förbered frysning media genom att tillsätta 10% dimetylsulfoxid (DMSO) till 90% FBS. Snurra försiktigt och sterilisera genom filtrering. Förvara vid 4 ° C.
- Förbered 2,000x Flt-3 ligand (10 | ig / ml) genom att lösa human rekombinant Flt-3-ligand (Flt-3L) i fullständig OP9 media till 10 pg / ml. Fördela i 1,5 ml mikrocentrifugrör och förvara vid -80 ° C. Följ leverantörens rekommendationer beträffande stabilitet och förvaring.
OBS: Stabiliteten hos Flt-3L är kort (en månad vid 4 ° C eller 3 månader vid -80 ° C). - Förbered 1,000x IL-7 (1 | ig / ml) genom att använda komplett OP9 media. Fördela i 1,5 ml mikrocentrifugrör och förvara vid -80 ° C. Följ leverantörens rekommendationer om stabilitet och lagring (IL-7 är stabil i upp till 12 månader vid -80 ° C).
- Förbered 1,000x Leukemia Inhibitory Factor (LIF) (10 ng / ml) av en 1:10 spädning av 10 7 enheter av LIF in ES-cellmedia. Butiks alikvot vid 4 ° C. Var noga med att notera det utgångsdatum som anges av tillverkaren på alikvoter flaskorna.
OBS: Produkten är stabil i koncentrerade eller utspädd form minst 18 månader från tillverkningsdatum. - Förbered gelatine 6-brunnars plattor genom lägga 1,5 ml av 0,1% gelatinlösning i varje brunn i en 6-brunnsplatta. Lämna rätter i den sterila huven vid rumstemperatur med lock på, så att åtminstone 30 minuter för beläggning. Disken kan även lämnas i en fuktad inkubator över natten. Ta bort all överbliven gelatinlösningen precis innan cellsådd. Låt inte gelatinlösningen helt torka ut i brunnen.
2 Upprättande och underhåll av matarceller och mus embryonala stamceller (Mesc)
OBSERVERA: Inkubera alla celler i en fuktad 37 ° C inkubator med 5% CO2.
- Upptining musen Embryonala fibroblasts (MEF)
- Quick-tina en frusen ampull (~ 5 x 10 6
- Lägg 8 ml ES-cellmedia till de tinade cellerna, i ett droppvis sätt för att gradvis späda ut DMSO från frysmedium.
- Centrifugera cellerna vid 400 x g vid 4 ° C under 5 min. Ta försiktigt bort supernatanten och suspendera cellpelleten i 3 ml ES-cellmedier.
- Förbered en 50 ml centrifugrör med 33 ml förvärmd ES-cellmedier. Tillsätt 3 ml återsuspenderat MEF för att få den slutliga volymen till 36 ml.
- Fördela 3 ml av den återsuspenderade MEFs i varje brunn i två gelatiniserad 6-brunnars plattor. Placera plattorna i inkubatorn under minst sex timmar för att tillåta cellerna att fästa och sprida ut före sådd mESCs på dem. Dessa mitotiskt arrestematarskikt kan vara användbara i flera dagar efter initial sådd, om deras media byts var 2-3 dagar.
OBS: Freshly gripna MEFs kan också användas. </ Ol>
- Seeding mESCs
- Quick-tina en ampull med en fryst Mesc klon i 37 ° C vattenbad och förbereda celler såsom beskrivits i 2.1.1-2.1.3.
OBS: Vi fryser 2 flaskor Mesc från ett sammanflytande brunn i en 6-brunnar. - Ta ut mediet från en brunn (per Mesc klon) av 6-brunnars platta med gripna MEF monoskikt (framställd i steg 2.1.5) och ympa 3 ml mESCs ovanpå MEF monoskiktet. Lägg 3 pl av 1,000x LIF (10 ng / ml). Återgå rätter i inkubatorn.
- Quick-tina en ampull med en fryst Mesc klon i 37 ° C vattenbad och förbereda celler såsom beskrivits i 2.1.1-2.1.3.
- ES-cell underhåll och trypsin medierad passage
OBS: Byt media dagligen, eller split baserad på sammanflödet av Mesc. Optimalt, skörd och split / åter platta cellerna varannan dag.- Ta ES-cellmedier och tvätta mESCs med 2 ml PBS. Avlägsna PBS. Tillsätt 1 ml 0,25% trypsin och inkubera vid 37 ° C under 3-5 min.
- Samla trypsiniserade celler och överför dem till en 15 ml centrifugrör. Kraftfullt pipettera cellsuspensionen att bryta upp klumpar av mEkonomiska och sociala råd. Tillsätt 2 ml komplett ES-cellmedia till cellsuspensionen för att neutralisera trypsin.
- Spin cellerna vid 400 x g under 5 minuter vid 4 ° C. Avlägsna supernatanten och suspendera pelleten i 3 ml ES cellmedier.
- Ta ut mediet från 6-brunnars plattor innehållande framställda gripna MEF monoskikt. Tillsätt en lämplig mängd av cellsuspensionen (baserat på den önskade delningsfaktorn) i 3 ml av ES-cellmedia till varje brunn som skall ympas. Lägg 3 pl av 1,000x LIF. En sammanflytande Mesc väl delad 1: 6 kommer att vara redo för passage i 2 dagar.
- OP9 / OP9-DL1 cell underhåll
- Tina en flaska med OP9 celler (följ stegen 2.1.1-2.1.3 använder OP9 media)
- Lägg 7 ml OP9 media till 10 cm vävnadsodlingsskål. Tillsätt 3 ml resuspenderade cellerna i ett droppvis sätt distribuera celler genom hela plattan. Placera cellerna över natt i inkubatorn.
- Kontrollera sammanflödet av OP9 cellerna nästa dag. Om skålen innehåller många döda flytande celler, remove medierna och tillsätt 10 ml rent OP9 media. Återgå skålen till inkubatorn om nästan full sammanflödet inte efterlevs. Split (med trypsin) 1: 4 den närmaste sammanflytande OP9 monolager.
OBS: Plattor ska nå samma nivå sammanflödet igen i ca 2 dagar. Se till att inte låta OP9 celler blir översammanflytande. - Frys de tidiga avsnitten i OP9 celler som expansions lager.
OBS: Vi fryser 2 injektionsflaskor med OP9 celler från en nära sammanflytande 10 cm skål. Varje injektionsflaska med expansions lager kan fortplantas vidare för att skapa arbets bestånd som senare används i MESC co-kultur experiment. Förvara alla OP9 lager frysta i flytande kväve i stället för i -80 ° C frys, eftersom fluktuerande temperaturer negativt kan påverka kvaliteten på de fryser.
3 OP9-DL1 Samodling Tillvägagångssätt
- Preparat Co-kultur
- Ungefär en vecka före initieringen av en co-kultur, tina MEF, mESCs och OP9 cell arbetar stocks. Sedan OP9-DL1 celler inte behövs förrän samodling dag 8, tina de OP9-DL1 celler under de första tre dagarna efter samodling inledande. Behåll eller frysa alla celler som behövs.
- Bestäm det ursprungliga antalet 10 cm plattor med OP9 cellmonoskikt beredda att nå 80% sammanflödet på co-kultur dag 0 baserat på omfattningen av experimentet (t.ex. antal MESC kloner som differentieras och antal co-kultur tidpunkter för skall analyseras). För att förbereda för en co-kultur, dela nära sammanflytande maträtt av OP9 celler mellan 1: 4 och 1: 6 två dagar före då monolager kommer att behövas.
OBS: Man kommer att behöva minst en platta per ESC-klon. Typiskt en enda ESC klon ympades på en enda platta (såsom beskrivs nedan) på dag 0 bör ge tillräckligt med celler för att ympa sex plattorna vid dag 5 passagen. Varje dag 5 platta kommer att möjliggöra en efterföljande analys tidpunkt. - Eftersom OP9 monolager kommer att kontinuerligt behövs för samodling passage, vara noga med att alltid maintai ett tillräckligt antal ytterligare OP9 odlingsplattor parallellt med co-kulturen.
- Dag 0: Inledande av samodling
- Samla Mesc såsom i 2.3.1-2.3.4. Räkna celler.
- För varje Mesc klon förbereda 5 x 10 4 Mesc i 10 ml OP9 media per platta.
OBS: Även om vi inte har använt det, kan vi konstatera att ett alternativt medium bestående av α-MEM, 10% FBS, och 5 x 10 -5 M β-merkaptoetanol har också rapporterats för användning i differentierings samkulturer 10. - Ta bort gammalt material från OP9 rätter och tillsätt 10 ml Mesc suspension till rätter som tar hand för att fördela cellerna jämnt över plattan. Sätt in skålarna i 37 ° C inkubator.
- Dag 3: Byte av media
- Ta bort rätter från inkubatorn och observera i mikroskop. Kolonier bör börjar förlora blankhet och se tillplattat ut.
- Ta ut mediet från disk och försiktigt 10 ml av färsk OP9medier.
- Returnera co-kultur rätter till inkubatorn. Visuellt övervaka mesoderm liknande kolonibildning dagligen för att informera tidpunkten för OP9 matarmonolager förberedelse för nästa passage (dag 5), som inte bör genomföras förrän ~ 80-90% av kolonierna visuellt visa mesoderm liknande morfologi. Högsta senareläggning av dagen 5 cellöverföring steg är 2 dagar.
- Dag 5: Trypsin medierad passage med pre-plating.
OBS: Förbered i förväg ett tillräckligt antal 10 cm skålar med optimalt sammanflytande OP9 celler. Fortsätt med nästa steg endast om samkulturer visar visuellt de funktioner som beskrivs i steg 3.3.3 (se även Representativa resultat).- Ta ut mediet från co-kultur rätter. Lägg 4 ml PBS för att tvätta. Snurra PBS och ta bort. Tillsätt 4 ml 0,25% trypsin och placera disken i inkubator för ~ 5 min.
- Störa skiktet av trypsiniserade celler genom kraftig pipettering, se till att inte införa alltför stora luftbubblor, tills enhomogen, mestadels enkelcellsuspension uppnås.
- Tillsätt 4 ml av kompletta OP9 media och blanda genom att pipettera. Överför celler till en ny, tom 10 cm skål och plats i inkubatorn i 30 minuter för att låta OP9 celler att hålla sig till skålen. Denna "pre-plating" steg reducerar antalet OP9 celler som överförs till nästa steg av samodling.
- Förbered 50 ml centrifugrör med 40 ìm cell silar.
- Samla icke vidhäftande celler från pre-plated skålen och passera dem genom cellfilter in i röret. Tvätta skålen försiktigt med 6 ml PBS och passera den genom samma sil, lämnar bifogade OP9 cellerna bakom.
- Centrifugera cellerna vid 400 x g 5 min vid 4 ° C. Avlägsna supernatanten och återsuspendera pelleterade cellerna i 3 ml komplett OP9 media. Räkna celler.
- Ta bort materialet från 10 cm plattor med optimalt sammanflytande OP9 celler.
- För varje analys tidpunkt, utsäde 5 x 10 5 celler på OP9 monoskikt i 10 ml slutvolym.
- Lägg 5 ng / ml human rekombinant Flt-3L och placera rätter i kuvös.
- Dag 8: Hematopoietic progenitorceller (HPC) samling
OBS: Förbered i förväg ett tillräckligt antal 6-brunnars plattor med OP9 eller OP9-DL1 ceUmonolager så att de kommer att vara ~ 80% sammanflytande i tid för detta steg.- Förbered 50 ml centrifugrör med 40 um silar.
- Ta bort disken från inkubatorn och observera i mikroskop. Blanka kluster av HPC bör löst fäst till OP9 monoskiktet. Samla så många av dessa celler som möjligt genom att tvätta (men inte alltför störande) i OP9 cellslager med en pipett och den befintliga media på skålen. För att förhindra skumbildning, alltid lämna minst 1 ml av media i spetsen på pipett under denna HPC samling / tvättsteg.
- Passera cellerna genom 40 ^ m sil till ett rör. Lägg 8 ml PBS till samma platta och kolla i mikroskop om samtliga HPC vire uppsamlades. Upprepa tvättningen / samlingssteg med PBS och (om nödvändigt) med mer kraftfull tvättning. Sila cellerna in i röret redan innehållande cellerna från samma platta.
- Centrifugera cellerna vid 400 x g under 5 minuter vid 4 ° C.
- Bered en huvudblandning av 3 ml (per platta ympades på dag 5) av OP9 media med 5 ng / ml Flt-3L och 1 ng / ml IL-7.
- Avlägsna supernatanten och suspendera pelleten i OP9 media med Flt-3L + IL-7 Master Mix (3 ml för varje 10 cm skål bearbetas). Överför de uppsamlade cellerna från varje platta i en brunn i en 6-brunnars platta med OP9 celler.
- För att driva celler mot monocytisk, B-cell eller erytroida härstamningar, utsäde de insamlade celler på OP9 celler. För att härleda T-celler, utsäde cellerna på OP9-DL1 ceUmonolager.
- Placera 6-brunnars plattor i inkubatorn.
- Dag 10: Byte av media
- Förbered en 15 ml centrifugrör för varje distinkt Mesc klon-feeder celltyp combination i samodling.
- Bered en huvudblandning av OP9 media med 5 ng / ml av Flt-3L och 1 ng / ml IL-7. Bered 3 ml för varje brunn.
- Samla försiktigt media från varje brunn i 6-brunnars platta kombinera material från flera brunnar innehållande samma ESC klon-feeder-cell typ kombination.
- Tillsätt 2 ml OP9 media Master Mix (se 3.6.2) i varje brunn.
- Centrifugera den uppsamlade medier vid 400 x g under 5 minuter vid 4 ° C. Avlägsna supernatanten och suspendera varje pellet (mycket liten om synligt) i 1 ml OP9 media Master Mix (se 3.6.2) per brunn ursprungligen samlats i steg 3.6.3.
- Fördela 1 ml celler tillbaka i varje brunn från vilken media ursprungligen samlades in bringa volymen i varje brunn till 3 ml. Återgå rätter till inkubatorn.
- Dag 12: Ingen trypsin passage
OBS: Förbered i förväg ett tillräckligt antal 6-brunnar med OP9 eller OP9-DL1 celler så att de kommer att optimalt sammanflytande i tid för detta step. Dag 12 är idealisk för flödescytometri analys av utvecklingen av erytroida, monocytisk och tidigt stadium T-celler.- Bered en huvudblandning (3 ml för varje brunn som kommer att fortsätta i samodling) av OP9 media med 5 ng / ml av Flt-3L och 1 ng / ml IL-7.
- Förbered 50 ml centrifugrör med 40 um silar (en för varje ESC-klon-feeder celltyp kombination i samodling).
- Med kraft pipett befintliga media i varje brunn för att dela upp alla celler (inklusive monolagret) i brunnen. Fortsätt med kraftfull pipettering tills ett tillstånd som liknar en enkelcellsuspension uppnås.
- Passera de uppsamlade cellerna genom silen in i röret. Lägg 3 ml PBS i varje brunn för att tvätta och samla in alla återstående celler. Passera celler genom samma sil. Kombinera celler från flera brunnar som innehåller samma ESC klon-feeder celltyp kombination.
- Kasta den använda cellfilter och ta bort en delmängd motsvarande en brunn (~ 6 ml) för varje önskadflödescytometri (eller annat) analyser som skall utföras på den dagen. Förvara dessa alikvoter på is före användning.
- Centrifugera cellerna vid 400 x g under 5 minuter vid 4 ° C. Avlägsna supernatanten. Suspendera pelleten från 50 ml centrifugrör i 3 ml Master Mix per brunn att åter seedade. Tillsätt 3 ml per brunn av varje cellsuspension till lämpligt matar celltyp och placera rätter i inkubatorn.
- Dag 14: Byte av media
- Följ stegen som beskrivs i avsnitt 3.6.
- Dag 16: Ingen trypsin passage
OBS: Förbered i förväg 6 brunnar av optimalt sammanflytande OP9 eller OP9-DL1 celler för detta steg.
OBS: Dag 16 är idealisk för flödescytometri analys av B-lymfocyter och mellersta scen T-celler.- Följ stegen som beskrivs i avsnitt 3.7.
- Dag 18: Byte av media
- Följ stegen som beskrivs i avsnitt 3.6.
- Dag 20: Ingen trypsin passage
OBS: Dag 20 is idealisk för flödescytometri analys av mitten till sen utveckla T-celler.- Följ stegen som beskrivs i avsnitt 3.7. Om så önskas, bär differentiera cellerna senaste dagen 20 alternerande media förändring och inget trypsin passager varannan dag, med daglig övervakning av lymfocyter expansionstakten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
När odlas på MEFs i närvaro av LIF, kan mESCs bibehållas i ett odifferentierat tillstånd. Under ideala förhållanden, visas de som kompakta kolonier av celler omgivna av en glänsande halo i faskontrast mikroskopi (Figur 1). Dessa kulturer måste övervakas dagligen. Beroende på sammanflödet av celler, kan mediet ändras eller celler kan delas. Grann Mesc kolonier bör inte komma till den punkt i kontakt med varandra. En normal, frisk kultur av odifferentierade mESCs är en viktig utgångspunkt för in vitro-T-celldifferentiering. Vid initiering av samodling, rekommenderas det att cellerna vara helt sammanflytande utan att vara överfulla. Detta är så att majoriteten av celler skördade efter ympning celler på OP9 monoskikt är Mesc (snarare än matarceller). Om stora skillnader i sammanflödet observeras mellan de olika MESC klonerna som ska differentieras på dag 0, då skulle det vara bäst att ta bort MEF med pre-anslutning till tissue odlingsplattor (som i steg 3.4.3-3.4.6 använder komplett ES-cell media) innan räkna mESCs för samodling sådd.
OP9 celler måste vara väl underhållna innan samodlingssystemet initiering (som beskrivs i avsnitt 2.4). Dessutom är det tänkt att OP9 celler förlorar en del av sina egenskaper med förlängd kultur och / eller uttalade ökningarna i deras proliferationshastighet 7 Undvikande split förhållanden bortom en:. 5 under upprätthållande av OP9 celler, och kasta bort kontinuerliga OP9 kulturer efter sex veckor, bidrar till att undvika dessa fallgropar.
Vid initiala cellsådd och cellöverföringsstegen i samodling (dag 0, 5, 8, 12, 16), bör OP9 monoskikten ligga inom ett optimalt område av konfluens. Figur 2 visar låg (Figur 2A) och hög (Figur 2B) ändar intervallet OP9 cellsammanflödet lämpligt för användning som co-kultur monolager. Ett exempel på en över-konfluent platta visas i Figure 2C. Underlåtenhet att bibehålla optimal sammanflödet kan inducera bildning av adipocyter (Figur 2D) som, i stora mängder, negativt kan påverka sam-kulturen.
På dag 0, är co-kulturen började på OP9 celler istället OP9-DL1 celler eftersom mesoderm bildning gynnas på OP9 celler. Cellerna stryks ut på OP9-DL1 celler monolager börjar den dag 8 för att inducera T-cellproduktion. Medan vissa MESC kloner kommer visuellt visa robust och kvantitativ (~ 90%) bildning av mesoderm liknande kolonier vid dag 5 i co-kultur (Figur 3A-B), kan andra visa förseningar vid detta steg (figur 3C-F). Under mikroskop, mesoderm liknande kolonier härledda i denna analys har variabelt beskrivs likna vagnshjul eller kratrar (fig 4A) eller, starbursts eller florets (Figur 4B).
Medan den publicerade OP9-DL1-protokollet speglar en norm för kvantitativ mesoderm formaning vid dag 5 i co-kultur, 7 finner vi att inte alla ESC-kloner uppnå detta norm inom denna tidsram. I dessa fall, vi ändrar mediet på dag 5 och vänta ytterligare 1-2 dagar innan de utför den "dag 5" cellskörd / överföringsprotokoll. Målet med denna fördröjning är att låta ~ 80-90% av ES-cellkolonier att visuellt blir mesodermal före överföringen. Det är viktigt att klargöra att detta 80-90% siffran återspeglar en strikt visuell kriterium urskiljas genom enkel faskontrast mikroskopisk inspektion av kolonimorfologi i co-kultur rätter. Det avser endast den andel av ESK kolonier som liknar de som visas i figur 4. Det är möjligt att vissa ESK-kloner inte kommer att nå denna visuella kriterium, även efter en två dagars fördröjning. I ett sådant fall är det möjligt att anrika blodbildande mesodermala prekursorer med användning av flödescytometri cellsortering för Flk-1 +-celler, såsom har beskrivits tidigare. 6,11 I varje fall för sake av nomenklatur bekvämlighet, vi "ställa om klockan" och hänvisar till dagen för mesoderm liknande koloniöverförings som "dag 5"
När flera ESC kloner som differentieras parallellt, är det möjligt att vissa samkulturer kommer att vara redo för dagen 5 passage på gång, medan andra släpar efter. I detta fall är det lämpligt att fördröja passagen av alla samkulturer tills de långsammare klonerna ikapp de andra. Fördröjningen verkar inte göra någon skada till "i tid" co-kulturer, men gynnar den efterföljande differentiering av de långsammare klonerna en hel del.
Dag 8 (dvs tre dagar efter mesodermal koloniöverförings) ser uppkomsten och ackumulering av HPC. HPC är synliga som blanka kluster av celler som är löst vidhäftade till de OP9 matarceller (figur 5). En noggrann tvättförfarande med hjälp av en pipett och media på skålen, kommer loss och samla HPC medanden OP9 cellslager mestadels intakt (Figur 6A-C). Detta är kanske den mest tekniken känsliga steg i protokollet. Det tar lite övning för att hitta lämpliga rörelser och media utstötnings tryck för att uppnå den önskade balansen mellan maximal skörd av HPC med minimal störning av matarskikt. Det är acceptabelt om en del av OP9 monolager lyfter, eftersom majoriteten av alla herrelösa monolager kommer att fångas i 40 pm nylonnät efter filtrering. Figur 6D visar ett monolager efter driven pipettering leder till större monolager störningar än nödvändigt. Under denna tvättsteg, är det viktigt att kontrollera i mikroskop huruvida alla HPC har samlats in och justera disktrycket i enlighet därmed.
Framsteg av samodling kan övervakas genom flödescytometri. För att särskilt analysera den icke-erytroid hematopoetisk avkomma ESK, är det viktigt att första porten på levande CD45 + celler.Detta steg skärmar ut de OP9 celler från analyserna, medan användning av DAPI eller annan nukleär färgning färgämne möjliggör uteslutande av icke-livsdugliga celler. Vid dag 12, bör många kluster av små, runda, blanka celler synas. Det är inte nödvändigt att räkna cellerna i detta skede. Men vi har observerat att leva, gated flödescytometri händelse räknas är typiskt i intervallet 1-3 x 10 5 per dag 12 samodling väl. Flödescytometri analyser av levande-gated cellerna differentierade på OP9 monolager kommer att ge erytroid (CD45 neg, TER119 +) och monocytiska (CD45 +, CD11b hi) härstamningar (figur 7A). Analyser av levande, CD45 + celler differentierar på OP9-DL1 monolager bör avslöja markörer karaktäristiska för CD4 / CD8 dubbel negativ (DN) -1 (CD44 +, CD25 neg, CD4 neg, CD8 neg) och DN2 (CD44 +, CD25 +, CD4 neg, CD8 neg) stadium T-celler (Figur 7B ng>). Vid dag 16, finns det en betydande ökning av mängden av små, runda, blanka celler i kulturerna. På OP9-DL1s, T-cell differentiering produkter framsteg till DN3 (CD44 neg, CD25 +, CD4 neg, CD8 neg) och DN4 (CD44 neg, CD25 neg, CD4 neg, CD8 neg) stadier. Vissa DP (CD4 +, CD8 +) T-celler kan också börja växa fram vid dag 16 (figur 7B). HPC seedade på OP9 celler ger B-celler (CD19 +) vid dag 16 Vid dag 20 av OP9-DL1-Mesc co-kultur, kommer det att finnas stora mängder DP T-celler och enda positivt (SP) CD8 + T-celler närvarande ( Figur 7B). Figur 8 ger ett diagram som sammanfattar de viktigaste stegen i ovanstående förfaranden, och de föreslagna analys tidpunkter under samodling.
ghres.jpg "/>
Figur 1 faskontrastmikroskopi bild av odifferentierade mESCs (vassa kolonier) växer på en MEF monolager (100 gångers förstoring).
Figur 2:. Faskontrastmikroskopi bilder av OP9 monolager sammanflyt (A) Lägsta och (B) högsta sammanflytnivåer tillrådligt för samodling passage / sådd (40X förstoring) (C) Exempel på en översammanflytande OP9 monolager (40X förstoring. ). (D) Översammanflytande OP9 monolager (200 gångers förstoring) med adipocyt bildning (stor, vesikler innehållande celler).
Figur 3: Faskontrast microscopy bilder av mesoderm liknande kolonibildning vid "dag 5" co-kultur. (A) 40X och (B) 100X vyer av sam-odlingsplattor med> 90% mesodermal koloni differentiering. Dessa plattor är klara för dagen 5 passage. (CF) Exempel på dag 5 co-odlingsplattor som kräver 1-2 dagars uppskjutande före överföring (C & E, 40X förstoring, D & F, 100 gångers förstoring).
Figur 4: faskontrastmikroskopi bilder av olika mesoderm liknande koloniformationer vid dag 5 i co-kultur (A) kolonimorfologi kallas "kratrar" eller (B) kolonimorfologi avses. "Vagnshjul." som "starburst" eller "buketter" (200X förstoring).
Figur 5 faskontrastmikroskopi avbild dag 8 co-odlingsplatta med kluster av små, runda, blanka HPC på en OP9 monolager (40X förstoring).
Figur 6:.. OP9 monolager efter HPC samling på samodling dag 8 (AC) Lämplig utbud av avbrott i OP9 monolager efter noggrann tvättning för att skörda HPC (D) Ett exempel på en OP9 monolager som har över störs av dagen 8 HPC skörd förfarande.
Figur 7: Representant flödescytometri (FACS) analyser vid vissa tidpunkter underMesc differentiering in vitro. (A) Färgning för erytroid (till vänster), monocytisk (mitten) och B-cell (höger) produkter Mesc-OP9 co-kultur vid dag 12 eller 16 såsom anges. (B) färgning för att utveckla T-celler vid de angivna tidpunkter Mesc-OP9-DL1 co-kultur. Se text för detaljerade beskrivningar av immunfenotyper.
Figur 8 Diagram över stegen i Mesc-OP9 co-kultur förfarande. (A) De viktigaste cellöverföringssteg för de första åtta dagarna av samodling. Det ungefärliga antalet celler sådda på OP9 celler på dag noll och fem indikeras. (B) I 8 överföringssteg och de förväntade cellulära differentieringsprodukter upptäckts av flödescytometri vid viktiga tidpunkter samarbetskultur. Se text för detaljerade beskrivningar av immunfenotyper.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den OP9-DL1 samodlingssystemet har utnyttjats för att studera rollen av olika genprodukter under utvecklingen av blodcelltyper från stamceller. 8,12,13 Det har också visat sig vara en effektiv modell för att studera funktionen av genen reglerande DNA under cellulär differentiering. 9,14 Med hjälp av denna metod som ett alternativ till hela musmodeller kan ge betydande besparingar i tid och kostnader för experiment som adresserar många grundläggande frågor i blodbildningen. Men anpassning av detta protokoll för dessa ändamål krävs kännedom om den potentiella variationsrikedomen bland MESC kloner som skulle användas i dessa förfaranden. Tidslinjen i den publicerade protokollet är expect från genomsnittet, väl underhållna, inte manipuleras Mesc linje. 7 Dessutom MESC kloner valts för generering av chimera möss brukar är av högre kvalitet och kommer att utföra mycket kraftigt i OP9 samodling . Å andra sidan, MESC kloner framväxande direkt från stabilatransfektion med en ectopically integrerad transgen visar varierande grad av initial differentiering effektivitet som sträcker sig från genomsnittliga till genomsnittet. Protokollet som beskrivs här ger en strategisk 1-2 dagars fördröjning av dagen 5 passage steg för att utjämna dessa potentiella skillnader före induktion av blodbildningen in vitro.
Dagen 8 passagen är det steg där verkställandet av detta protokoll har mest potential för fel. Tålamod, praktik och noggrann observation möjliggör en att utveckla den teknik som optimerar HPC skörd samtidigt minimera OP9 monolager störningar. Bortom de viktigaste dag 5 och dag 8 steg, de kritiska parametrarna involverar noggrann cellodling underhåll (särskilt OP9 celler, såsom beskrivits ovan) och särskild uppmärksamhet på de reagenser som används i protokollet. Den mest kritiska reagens är FBS. Distinkta massor av FBS varierar kraftigt i sin förmåga att stödja detta förfarande. Flera partier måste prövas i order att avgöra vilka kommer att ge robust differentiering i denna analys.
Denna samodlingssystemet har sina begränsningar. Exempelvis går denna modell inte stödja differentiering av enstaka positiva CD4-celler. En orsak till detta är bristen på uttryck av MHC (MHC) klass II antigenpresentation infrastruktur i OP9 cellerna. 1 Cell yta presentation av antigener av MHC klass II krävs för korrekt utveckling av CD4 SP-celler. De CD8 SP-celler som gör fram utgör en blandning av mogna och omogna CD8 SP tymocyt steg. 1 Vidare lyckad transplantation av Mesc härledda T-cell stamceller i en mus kräver förhands passage genom foster tymisk organkultur. 1 Trots denna teknik har visat sig lovar som en kraftfull undersökande förhållningssätt till både cellulära och molekylära frågor i blod och immunsystemet utveckling som tidigare endast möjligt att erbjuda vivo. Således bortsett från att ge ett nytt sätt att göra snabbare framsteg i dessa frågor, mer omfattande användning av OP9-ESC samodlingssystemet kommer att ha större påverkan på att minska användningen av försöksdjur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Corning | 15-013-CV | |
| Stem cell qualified FBS | Gemini | 100-125 | Heat inactivated |
| Penicillin/Streptomycin | Corning | 30-002-CI | |
| L-alanyl L-glutamine | Corning | 25-015-CI | |
| HEPES buffer | Millipore | TMS-003-C | |
| Non-Essential Amino Acids | ThermoScientific | SH30853.01 | |
| Gentamicin Regent Solution (50 mg/ml) | Life Technologies | 15750-060 | |
| β-mercaptoethanol (55 mM) in DPBS | Life Technologies | 21985-023 | |
| Filter Unit | Millipore | SCGPU05RE | 0.22 μm PES membrane |
| Cell Culture Grade Water | Corning | 25-055-CM | |
| α-MEM | Life Technologies | 12000-022 | Powder, reconstitute per manufacture recommendation |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S5761-500G | |
| FBS | ThermoScientific | SH 30396.03 | Testing of individual lots required |
| Dimethyl Sulphoxide | Sigma | D2650 | |
| Recombinant Human Flt-3 Ligand | R&D Systems | 308-FK | |
| Recombinant Murine IL-7 | PeproTech | 217-17 | |
| LIF | Millipore | ESG1107 | |
| Utrapure water with 0.1% gelatin | Millipore | ES-006-B | |
| MEFs mitomycin C treated | Millipore | PMEF-CF | Any mitotically arresteded MEFs can be used |
| DPBS | Corning | 21-031-CV | |
| Cell strainer (40 μm) | Fisher | 22363547 | |
| Tissue culture dish 100 x 20 mm | BD Falcon | 353003 | |
| Multiwell 6-well | BD Falcon | 353046 | |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1615-5500 | |
| 15 ml centrifuge tubes | BD Falcon | 352096 | |
| 50 ml centrifuge tubes | BD Falcon | 352070 | |
| 5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer Cap | BD Falcon | 352235 | Tubes for FACS |
| ES R1 cells | ATCC | SCRC-1011 | |
| OP9 cells | Cells can be obtained from the Riken Laboratory Cell Repository (Japan). | ||
| OP9-DL1 cells | Cells can be requested from the Zúñiga-Pflücker laboratory. | ||
| FlowJo software | Tree Star | FACS data analyses | |
| Flow Cytometer | BD | FACScan, FACSCalibur and FACSVantage have been used in our lab |
References
- Schmitt, T. M., et al. Induction of T cell development and establishment of T cell competence from embryonic stem cells differentiated in vitro. Nat Immunol. 5, 410-417 (2004).
- Pui, J. C., et al. Notch1 expression in early lymphopoiesis influences B versus T lineage determination. Immunity. 11, 299-308 (1999).
- Nakano, T., Kodama, H., Honjo, T. Generation of lymphohematopoietic cells from embryonic stem cells in culture. Science. 265, 1098-1101 (1994).
- Schmitt, T. M., Zuniga-Pflucker, J. C. Induction of T cell development from hematopoietic progenitor cells by delta-like-1 in vitro. Immunity. 17, 749-756 (2002).
- Chen, J., Lansford, R., Stewart, V., Young, F., Alt, F. W. RAG-2-deficient blastocyst complementation: an assay of gene function in lymphocyte development. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90, 4528-4532 (1993).
- de Pooter, R. F., Cho, S. K., Carlyle, J. R., Zuniga-Pflucker, J. C. In vitro generation of T lymphocytes from embryonic stem cell-derived prehematopoietic progenitors. Blood. 102, 1649-1653 (2003).
- Holmes, R., Zuniga-Pflucker, J. C. The OP9-DL1 system: generation of T-lymphocytes from embryonic or hematopoietic stem cells in vitro. Cold Spring Harb Protoc. 2009, (2009).
- Arsov, I., et al. A role for autophagic protein beclin 1 early in lymphocyte development. J Immunol. 186, 2201-2209 (2011).
- Lahiji, A., et al. Complete TCR-alpha gene locus control region activity in T cells derived in vitro from embryonic stem cells. J Immunol. 191, 472-479 (2013).
- Hirashima, M., Kataoka, H., Nishikawa, S., Matsuyoshi, N., Nishikawa, S. Maturation of embryonic stem cells into endothelial cells in an in vitro model of vasculogenesis. Blood. 93, 1253-1263 (1999).
- Nishikawa, S. I., Nishikawa, S., Hirashima, M., Matsuyoshi, N., Kodama, H. Progressive lineage analysis by cell sorting and culture identifies FLK1+VE-cadherin+ cells at a diverging point of endothelial and hemopoietic lineages. Development. 125, 1747-1757 (1998).
- de Pooter, R. F., et al. Notch signaling requires GATA-2 to inhibit myelopoiesis from embryonic stem cells and primary hemopoietic progenitors. J Immunol. 176, 5267-5275 (2006).
- Watarai, H., et al. Generation of functional NKT cells in vitro from embryonic stem cells bearing rearranged invariant Valpha14-Jalpha18 TCRalpha. 115, 230-237 (2010).
- Pipkin, M. E., et al. Chromosome transfer activates and delineates a locus control region for perforin. Immunity. 26, 29-41 (2007).
