Introduction
Los liposomas se han investigado intensamente y servir como uno de los sistemas de administración de fármacos biomédicos más biocompatibles para aplicaciones clínicas 1,2. Ellos se componen principalmente de fosfolípidos y colesterol, ambos de los cuales son compuestos biocompatibles que imitan partes de las membranas celulares naturales. Considerando que las sustancias hidrófilas pueden ser atrapados en el interior acuoso, agentes lipófilos pueden incorporarse dentro de la bicapa fosfolipídica liposomal 3. La encapsulación de sustancias dentro del interior acuoso de los liposomas otorga protección contra la degradación in vivo y también evita que el sistema anfitrión de los efectos tóxicos de los fármacos citotóxicos utilizados para la terapia de enfermedades, por ejemplo agentes quimioterapéuticos destinados a destruir las células tumorales. La modificación de la superficie liposomal con polímeros como el polietilenglicol (PEGilación) se extiende aún más el tiempo de circulación de la sangre liposomal in vivo debido a la estabilización estérica 4. Moreover, los liposomas pueden secuestrar altas concentraciones de varias sustancias como proteínas 5,6, sustancias hidrófilas 7,8 y enzimas 9. Por lo tanto, sirven como herramientas terapéuticas y de diagnóstico clínico como fiables que merecen su aprobación para la entrega de fármacos citotóxicos tales como doxorrubicina para la terapia del cáncer 4. Debido a su flexibilidad, los liposomas también se pueden cargar con fluorocromos para fines de diagnóstico y quirúrgicos guiados por imagen.
Imágenes de fluorescencia proporciona una solución rentable y no invasiva herramienta de diagnóstico in vivo que, sin embargo, exige algunos requisitos básicos en. Se pudo demostrar que fluorocromos que se adaptan mejor para formación de imágenes in vivo tienen una absorción característica y máximos de emisión en el rango donde dispersión de la luz y la dispersión, así como la autofluorescencia de tejidos de origen del agua y de la hemoglobina es baja. Por lo tanto, dichas sondas tienen sus máximos de abs / em entre 650 y 900 nm 10. Además de esto, la estabilidad de los fluorocromos tanto in vitro como in vivo es crítica, como la opsonización y eliminación rápida pueden limitar en gran medida su aplicación para las imágenes in vivo 11. Otros efectos como la mala estabilidad y baja sensibilidad o efectos citotóxicos en órganos diana como se ha visto con el verde de indocianina (ICG) 12-16, son no deseados y deben tenerse en cuenta al diseñar sondas para imágenes in vivo. Estas observaciones han conducido al desarrollo activo de varios fluorocromos NIR preclínicos, nanopartículas, así como nuevas técnicas para la formación de imágenes in vivo de procesos inflamatorios, cáncer y para la cirugía guiada por imagen 17-20. A pesar de la estabilidad de la mayoría (fluorescencia del infrarrojo cercano) NIRF preclínica colorantes in vitro, su rápida perfusión y el aclaramiento a través del hígado y el riñón impiden su uso en la formación de imágenes ópticas in vivo de enfermedades y procesos inflamatorios.
ntent "> Por lo tanto, presenta un protocolo para la encapsulación de fluorocromos como el bien caracterizado en el infrarrojo cercano tinte fluorescente DY-676-COOH, conocido por su tendencia a la auto-interferencia a concentraciones relativamente altas 21 en liposomas. En altas concentraciones H- la formación de dímero y / o pi-interacciones de apilamiento entre las moléculas fluoróforo situadas dentro de resultado de cada uno radio de Förster en Förster de transferencia de energía de resonancia (FRET) entre las moléculas de fluorocromo. A baja concentración el espacio entre las moléculas de fluoróforo se incrementa, impidiendo de este modo la interacción pi-apilado y -H formación de dímero y resultando en una alta emisión de fluorescencia. El interruptor entre alta y baja concentración y la extinción de la fluorescencia que acompaña y la activación es una estrategia prometedora que puede ser explotado para la formación de imágenes ópticas 22. A este respecto, la encapsulación de altas concentraciones del colorante NIRF DY-676-COOH en el interior acuoso de los liposomas es más favorable para formación de imágenes in vivo que el colorante libre. El desafío del método radica en primer lugar en la encapsulación correcta y en segundo lugar, en la validación de los beneficios resultantes de la encapsulación de altas concentraciones de colorante. La comparación de las propiedades de formación de imágenes de liposomas se inactivó con la del colorante libre y también con una formulación no liposómica se inactivó con bajas concentraciones del colorante es indispensable. Mostramos por un protocolo de hidratación de película y extrusión simple, pero muy eficaz combinado con congelación y descongelación ciclos alternos que la encapsulación de las concentraciones de extinción de DY-676-COOH en liposomas es factible. Otros métodos utilizados para preparar liposomas, tales como el método de evaporación de fase inversa 23, así como el método de inyección de etanol 24 permiten preparación de liposomas con altas eficiencias de encapsulación para muchas sustancias hidrófilas. Sin embargo, la naturaleza de la sustancia a encapsular puede influir en la eficiencia de encapsulación. En efecto,el protocolo de hidratación de película y extrusión que aquí se presenta reveló la más alta eficiencia de encapsulación de DY-676-COOH. Para ilustrar los beneficios de la encapsulación liposomal de DY-676-COOH, un modelo de edema inducido por zymosan, que permite el estudio de los procesos inflamatorios dentro de unas pocas horas, fue utilizado. Aquí, se demuestra que los liposomas con altas concentraciones del encapsulado DY-676-COOH son más adecuados para todo el cuerpo en imágenes ópticas vivo de los procesos inflamatorios que el colorante libre o la formulación liposomal no se inactivó con bajas concentraciones de colorante. Así, el protocolo subyacente proporciona un método sencillo y rápido para producir liposomas fluorescentes Templado y la validación de su potencial de activación y de formación de imágenes tanto in vitro como in vivo.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOTA: Todos los procedimientos son aprobados por el comité regional de los animales y de acuerdo con las directrices internacionales sobre el uso ético de los animales.
1. Preparación de los materiales e instrumentos
- Preparación de la dispersión de vesículas formada espontáneamente (SFV)
- Disolver y preparar soluciones madre de las siguientes fosfolípidos: 214 mg / ml de fosfatidilcolina de huevo (EPC), 134 mg / ml de colesterol, 122 mg / ml de 1,2-distearoyl- sn -glicero-3-phosphoethanolamine- N - [metoxi (polietileno glicol) -2000] (sal de amonio) (mPEG 2000 DSPE) y 2 mg / ml de 1,2-dioleoyl- sn -glicero-3-phosphoethanolamine- N - (7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4 il) (sal de amonio) (NBD-DOPE) en cloroformo y guardar en frascos de vidrio.
- Proporcionar aproximadamente 3 ml de cloroformo en un matraz de fondo redondo y transferir el volumen apropiado de solución madre de fosfolípidos en el matraz de fondo redondo para preparar liposomas compuestos de EPC: Chol: mPEG 2000 DSPE en una relación molar de 6,5: 3: 0,5. Para el marcaje doble fluorescencia de los liposomas añadir 0,3% en moles NBD-DOPE a la solución de los lípidos.
- Evaporar el cloroformo de la solución de fosfolípido orgánico bajo presión reducida (300 mbar) a 55 ° C usando un evaporador rotatorio.
- Después se forma una película homogénea de fosfolípidos, reducir la presión a 10 mbar durante 1-2 horas para eliminar el depósito de cloroformo residual.
- Mientras que el cloroformo se evapora, se disuelve DY-676-COOH (6,181 M) en 10 mM de tampón Tris pH 7,4 y llenar un recipiente Dewar con nitrógeno líquido. Encienda un baño de ultrasonidos y se fijará en 50 ° C.
- Transferir un volumen apropiado (0,5-1 ml) de solución al matraz de fondo redondo para hidratar la película de fosfolípidos seco y agitar vigorosamente hasta que una vesícula formada espontáneamente (SFV) formas de dispersión DY-676-COOH (6,181 M). Asegúrese de que todos los fosfolípidos se dispersan para evitar la pérdida de lípidos.
- Cuidadosamente transfer el matraz de fondo redondo que contiene la dispersión SFV en nitrógeno líquido y congelar la dispersión durante 3-5 min. Colocar el matraz de fondo redondo en un baño de ultrasonidos a 50 ° C para descongelar la dispersión luego agite la dispersión vigorosamente durante 1-2 minutos. Repita este procedimiento seis veces, haciendo un total de siete ciclos de congelación y descongelación.
- Extrusión de SFV para formar vesículas de liposomas homogéneos
- Transferir la dispersión de SFV en un 1 ml jeringa (jeringa a) y extruir la dispersión a través de una membrana de policarbonato de 100 nm utilizando un extrusor de LiposoFast básica en la jeringa-b.
- Extruir la dispersión de la jeringa-b, de nuevo en una jeringa, y luego repetir el ciclo de diez veces. Debido a la extrusión, la solución en los cambios de jeringa de un aspecto turbio a una dispersión clara con el tiempo. Después de diez ciclos (veinte pasos de extrusión individuales) retire la jeringa-b del dispositivo y extruir la dispersión por última vez desde una jeringa directamente en una estéril1,5 ml tubo de reacción.
- Purificación de encapsulado liposomal DY-676-COOH de colorante libre
- Preparar una columna de cromatografía de gel utilizando cuentas G25 empapados en 10 mM Tris pH 7,4 (columna de longitud 28 cm, diámetro 0,8 cm).
- Transferir 0,5 ml de dispersión vesicular extruido sobre la cama de gel y dejar que el drenaje de la muestra en la matriz de gel.
- La elución de los liposomas con 10 mM tampón Tris pH 7,4 (Figura 1A) y se lava la columna hasta los drenajes colorante libre completamente fuera de la columna. Si es necesario, recoger y reciclar el tinte libre por la desalación y la deshidratación de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
- Concentrar los liposomas eluidas por ultracentrifugación (200.000 xg, 2 horas a 8 ° C) a continuación, dispersarlos en el volumen adecuado de pH estéril 10 mM de tampón Tris, 7,4.
- La cuantificación de la concentración de encapsulado DY-676-COOH
- Preparar una curva de calibración mediante la disolución de DY-676-COOH (0, 82, 124,247, 494, 988 nM) en 10 mM de tampón Tris, pH 7,4 que contiene 0,1% de Triton X100.
- Disolver 2 l (100 nmol final de lípidos de un / L de stock 50 mmol) de los liposomas durante 5 min a temperatura ambiente en 100 l de tampón Tris que contiene 1% de Triton X100 para destruir las vesículas y suelte el colorante encapsulado. Luego diluir las muestras con 10 mM de tampón Tris, pH 7,4 a una concentración final de Triton-X100 de 0,1% (v / v) hacer un volumen total de 1 ml. Preparar todas las muestras por duplicado.
- Medir la absorción y emisión de todas las muestras (gratis DY-676-COOH y Triton-X100 tratada liposomas) a una excitación λ = 645 nm y una emisión λ = 700 nm. Establecer y utilizar una curva de calibración del tinte libre de determinar la concentración de colorante encapsulado.
- Caracterización de liposomas
- Determinar el tamaño y el potencial zeta de los liposomas mediante dispersión de luz dinámica. Diluir las muestras de liposomas con filtro esterilizado (0,2 micras) tampón 10 mM Tris pH 7,4 a aconcentración de 100-300 micras (lípidos). Transferir las muestras diluidas en una cubeta desechable de bajo volumen y medir la muestra de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
- Caracterizar los liposomas por microscopía electrónica para sustanciar el tamaño, la integridad y la homogeneidad de las vesículas liposomales de acuerdo con protocolos estándar.
2. Validación de fluorescencia de enfriamiento rápido y activación de los liposomas preparados
- Análisis físico-químico de extinción de la fluorescencia y la activación
- Prepare dos tubos de 1,5 ml para el Lip-Q y 2 tubos para la libre DY-676-COOH. Transferencia de 100 nmol de lípidos totales (2,38 l de una solución / L Lip-Q Stock 42 mmol, que contienen 138 mg / ml del encapsulado DY-676-COOH) en los tubos correspondientes. Traslado gratuito DY-676-COOH equivalente al contenido de colorante de Lip-Q (0,38 g que se traduce, por ejemplo, de 138 g / l 1,000 x 2,38 l Lip-Q se utiliza). Incubar una bañerae de cada sonda a 4 ° C y congelar el segundo tubo a -80 ° C durante la noche (16 hr).
- Calentar un bloque de calentamiento a 30 ° C. Llenar una caja de enfriamiento con hielo triturado y equilibrar una alícuota de tampón Tris 10 mM pH 7,4 a temperatura ambiente.
- Retire las sondas de 4 ° C y se equilibren a temperatura ambiente (envuelto en papel de aluminio para protegerlo de la luz) y rápidamente descongelar sondas de -80 ° C a 30 ° C durante 5 min. Enfríe las sondas descongelados en hielo durante 1 minuto antes de transferirlos a la temperatura ambiente (también envuelto en papel de aluminio para protegerlo de la luz).
- Añadir 10 mM de tampón Tris (pH 7,4) a cada una de las sondas a 100 l de volumen final y equilibrar todas las sondas a temperatura ambiente durante 10 min.
- Pipetear 80 l de cada sonda en una cubeta de vidrio de bajo volumen y medir la absorción de cada sonda 400 a 900 nm en un espectrómetro. Devuelva la sonda a sus correspondientes tubos.
- Transferir 80 l de cada sonda en una cubeta de vidrio adecuadoy medir la emisión de fluorescencia en un espectrofluorómetro por emocionantes las sondas a 674 nm y midiendo la fluorescencia de 694 a 800 nm.
- La captación celular y la activación de fluorescencia
- Obtener y la cultura las siguientes líneas de células en su medio de cultivo correspondiente de acuerdo con condiciones estándar (37 ° C, 5% de CO 2 y el 95% atmósfera húmeda). Aquí, utilice el J774A.1 murino línea celular de macrófagos (modificado de Dulbecco medio de Eagle suplementado con 10% (v / v) de suero de ternera fetal), la línea celular de glioblastoma humano, U-118 mg (MEM que contiene vitaminas esenciales y 10% (v / v) de suero de ternera fetal) y la línea celular de fibrosarcoma humano, HT-1080 (RPMI con 5% de FCS).
- Escudo de 8 pocillos cámara de diapositivas con poli-L-lisina (añada 100 l 0,001% de poli-L-lisina a cada pocillo e incubar a 37 ° C durante 10 minutos. Aspirar solución y deje que los portaobjetos de cámara se sequen durante al menos 4 hr a RT sobre un banco de trabajo estéril. Enjuague los portaobjetos de cámara 3veces con solución salina tamponada con 200 l de Hank luego sellar con parafina y papel de aluminio y se almacena a 4 ° C hasta que sea necesario.
- Mientras que los portaobjetos de cámara están secando, filtro-esterilizar los liposomas y solución de colorante y se almacena a 4 ° C hasta que sea necesario.
- Para el análisis de la absorción de la sonda con todo el cuerpo vivo sistema de imágenes de fluorescencia en NIR, preparar 5 matraces de cultivo pequeños para cada una de las 3 líneas celulares de ensayo (15 frascos en total). Seed 2 x 10 6 J774A.1, U-118 mg y células HT-1080 por matraz de cultivo con 5 ml de medio de cultivo respectivo (en quintuplica) y crecen durante 16-24 h. Paralelo a los frascos de cultivo, sembrar 30.000 células de cada línea celular (J774A.1 y HT-1080) o 20.000 células (T-118 mg) a 2 pocillos de la diapositiva cámara respectivamente y crecer en un medio de cultivo de 500 l de 16 a 24 h .
- Al día siguiente, añadir 100 nmol (importe final de lípidos) de Lip-Q para 2 frascos por línea celular y a un pocillo de cada línea celular en la diapositiva cámara.Inmediatamente transferir matraz de 1 por cada línea celular a 4 ° C y el segundo matraz de nuevo a la incubadora.
NOTA: El volumen de las sondas añadió a los matraces y los portaobjetos de cámara son los mismos, haciendo que la concentración en la cámara de diapositivas 10 veces mayor (5 ml es 500 l de medio de cultivo). Esto es necesario porque la detección microscópica es menos sensible que el sistema de imágenes de fluorescencia NIR donde se crean imágenes de sedimentos celulares de los matraces. - Añadir la libre DY-676-COOH en una concentración equivalente al contenido de colorante de Lip-Q a las células en 2 matraces por línea celular y a un pocillo de cada línea celular en el portaobjetos de cámara, a continuación, transferir inmediatamente matraz de 1 por línea celular a 4 ° C (agotamiento de la energía) y el otro matraz junto con la corredera cámara posterior a la incubadora. Incubar todas las células durante 24 horas a las condiciones correspondientes. Las células en el matraz sin sonda servir como control sin tratar.
- NIRF imágenes y análisis semi-cuantitativo
- Después de 24 horas de duración de la incubación, recoger las células en frascos lavando las células 2 veces con solución salina tamponada Hanks (HBSS) luego raspar las células en 500 l HBSS y precipitado mediante centrifugación (5 min a 200 x g) en 500 tubos mL.
- Colocar los tubos con los gránulos de las células (y HBSS) en una cámara NIRF y de imágenes utilizando filtros de excitación (615-665 nm) y emisión (corte de> 700 nm).
- Deducir la autofluorescencia y evaluar la intensidad de la diana frente autofluorescencia de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Esto dará a los niveles semi-cuantitativos de la intensidad de fluorescencia como media de la señal (recuentos de escalado / seg), que representa los niveles de recuento después de la escala de tiempo de exposición, ganancia de la cámara, binning y la profundidad de bits, de modo que las mediciones son comparables entre sí.
- Análisis microscópico confocal
- Después de 24 horas de incubación, recoger las células en la cámara de diapositivas mediante lavado 2 veces con 500 l HBSS.
- Fijar la ceLLS con 200 l de HBSS que contiene 3,7% (v / v) de formaldehído durante 30 min a TA.
- Mientras que la fijación está pasando, diluir la mancha de ADN, Hoechst-33258 1:50 con solución de montaje.
- Después de la fijación, se lavan las células 2 veces con HBSS luego se separan las cámaras de los portaobjetos de vidrio. Añadir solución de montaje 50 l que contiene el ADN de mancha en cada lugar correspondiente a los pocillos de los portaobjetos de cámara. Cubra las células con cubreobjetos de vidrio, sellar los bordes con esmalte de uñas transparente y durante 10 minutos de secado al aire a temperatura ambiente (oscuro).
- Células de imagen en un microscopio de fluorescencia adecuado o un microscopio confocal. Utilice los siguientes parámetros de excitación y emisión para la visualización de los componentes correspondientes: núcleos (Hoechst-33258: excitación 405 nm, emisión 420-480 nm). NBD-DOPE (liposomal de lípido: excitación 488 nm, emisión 530 nm). DY-676-COOH (NIR tinte fluorescente: excitación 633-645 nm, emisión 650-700 nm).
NOTA: Asegúrese de que el microscopio de fluorescencia unvailable está equipado con filtros adecuados que permiten la excitación y emisión de longitudes de onda superiores a 630 nm.
3. liposomas basados en fluorescencia in vivo Imaging de Inflamación
- Preparación de los animales y materiales
- Casa 8-12 semanas de edad, los ratones NMRI macho que pesaban aproximadamente 36 g en condiciones estándar con comida y agua ad libitum.
- Siete días antes del inicio de los experimentos, dar a todos los ratones una dieta baja feofórbido a fin de reducir la autofluorescencia del tejido.
- Veinticuatro horas antes del comienzo de cada experimento, los ratones afeitarse en el área deseada (por ejemplo, zona de la espalda todo si se desea obtención de imágenes de edema pata trasera).
- Pesar los animales y calcular la cantidad de sonda para ser inyectada por ratón (Lip-Q y Lip-dQ a 10 mol (concentración de lípidos) por kg de peso y libre DY-676-COOH (equivalente a teñir contenido de Lip-Q utiliza) .
- Imagen de los animalesun cuerpo entero NIR de fluorescencia de imágenes con los mismos ajustes utilizados para los sedimentos celulares. Esta medida ofrece la autofluorescencia de los animales.
- Disolver 10 mg zymosan A en 1 ml de solución salina isotónica y almacenar durante la noche a 4 ° C.
- La inducción de la inflamación y la formación de imágenes in vivo NIRF
- Preparar 3 jeringas por ratón que contienen las siguientes soluciones. Llene una jeringa con 50 l zymosan Una solución (10 mg / ml) y la segunda jeringa con 50 l de solución salina isotónica. Llene la tercera jeringa con las sondas, por el que Lip-Lip-Q y dQ (10 mmol / kg de peso (lípido)) están designados para animales de prueba y gratis DY-676-COOH (concentración que en Lip-Q) para los animales de control. Asegúrese de que las sondas se diluyeron con HBSS estéril a 150 l de volumen final.
- Aplicar crema para los ojos en los ojos de los animales para evitar la sequedad y anestesiar a los animales con un 2% de isoflurano hasta que están profundamente dormidos y no reaccionan cuando se toca en las patas (esto toma alrededor de 2 minutos).
- Coloque el ratón sobre una estera caliente (todavía bajo anestesia) e inyectar el zymosan-A por vía subcutánea solución en la pata trasera derecha y la solución salina en la pata trasera izquierda. Inyectar inmediatamente la sonda intravenosa y la imagen del animal a partir de entonces a continuación, un tiempo récord de inyección / medición (como t = 0 h). Guarde las imágenes resultantes como cubos de imagen y repita los pasos anteriores para el resto de los animales y de las respectivas sondas.
- Imagen de los animales cada 2 h después de la inyección de 10 horas ya las 24 horas después de la inyección, asegurándose de que la etapa de la cámara de medición está caliente (por ejemplo, mediante la colocación de una alfombra cálida debajo), con el fin de evitar la hipotermia. Después de cada medición, colocar los animales en una jaula con comida y agua ad libitum y colocar la jaula en una cámara de animales templado. La eutanasia a los animales por primera anestesiante con isoflurano al 2% hasta los animales ya no reaccionan al tacto, a continuación, la eutanasia con dióxido de carbono durante 5-10 minutos, lo que haceasegurarse de que los animales dejan de respirar por completo y el rigor mortis se produce.
- Diseccionar los ratones de acuerdo con protocolos estándar, que pueden ser evaluados en línea (http://www.freebookez.com/mouse-dissection-lab-report/) y la imagen de los órganos.
- Evaluar los resultados de medición de acuerdo con las instrucciones del fabricante por primera deducción de la fluorescencia general de los animales (desmezcla), entonces las regiones asignación de interés para la autofluorescencia (de izquierda pata trasera con solución salina) y el objetivo de fluorescencia del área inflamada (pata trasera derecha con zymosan-A).
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Representative Results
La encapsulación de altas concentraciones de colorantes fluorescentes tales como el colorante NIRF DY676-COOH utilizado aquí en el interior acuoso de los liposomas conduce a un alto nivel de extinción de la fluorescencia. Extinción de la fluorescencia, un fenómeno observado con muchos fluoróforos a alta concentración, puede ser explotado en varias en aplicaciones de formación de imágenes in vivo, donde se exigen una alta sensibilidad y detección fiable de la zona objetivo. El uso de liposomas también proporciona protección del tinte que es indispensable para aplicaciones in vivo. Una caracterización exhaustiva de los liposomas es necesario e incluye varios factores tales como el nivel de colorante encapsulado, la estabilidad y el tamaño de los liposomas, extinción de fluorescencia y la actividad de colorante encapsulado in vitro y también in vivo aplicabilidad para los propósitos de formación de imágenes. Una comparación del colorante libre, DY-676-COOH y se inactivó liposomas (Lip-Q), así como un liposoma no se inactivó (Lip-DQ) con muy bajo concentración del colorante encapsulado tanto, es crítico especialmente para caracterizaciones en vivo.
Los liposomas preparados mediante la hidratación de película y la técnica de extrusión con ciclos de congelación y descongelación sucesivos antes de la extrusión contienen moléculas de tinte libres residuales que pueden separarse con éxito de los liposomas debido a su retención más largo en la matriz de filtración en gel, en comparación con los liposomas que eluyen más rápido ( Figura 1B). Dependiendo del nivel de dilución después de la filtración en gel, ultracentrifugación un paso opcional permite la concentración de los liposomas como se ilustra (Figura 1C). Basándose en las propiedades de absorción y emisión del colorante encapsulado, la concentración de colorante encapsulado se determina con la ayuda de una curva de calibración del colorante libre (Figura 1D). Además de la concentración del colorante encapsulado, es importante para determinar el tamaño y la homogeneidad de los liposomas de popapreparación er. Como se ve en la Figura 1E, micrografías electrónicas de los liposomas preparados por el método subyacente revelan una morfología mayoría unilamelar de las vesículas de liposomas, que contiene intravesicular DY-676-COOH ya sea dentro de la gama de concentración de temple (Lip-Q; 606-846 mu M DY-676 ) o en la concentración de colorante no se extinguió (Lip-DQ; 25 mM DY-676). Además, revelan una distribución de tamaño homogéneo de aproximadamente 120 nm y los índices de polidispersidad muy por debajo de 1 (Tabla 1). Debido a extinción de la fluorescencia, Lip-Q muestra dos máximos de absorción en tampón acuoso, por lo que un pico se caracteriza por un cambio hacia las longitudes de onda azules. En línea con esto, la emisión de fluorescencia es muy baja en comparación con el colorante libre (Figura 2A y B, derecha). Freeze-daños de los liposomas como resultado la liberación del colorante, que se diluye en la solución circundante. El pico de absorción azul en diferido, por lo tanto disappears, lo que resulta en un pico de absorción única de Lip-Q. En correspondencia con esto, un aumento en la intensidad de fluorescencia de congelación-dañado Lip-Q se ve, lo que indica que la activación de la fluorescencia de las moléculas de colorante liberado se llevó a cabo. El colorante libre revela sólo una única máxima absorción y alta intensidad de fluorescencia que se mantienen en el mismo nivel, independientemente de congelación (Figura 2A y B, izquierda). Este hallazgo sugiere que la encapsulación del colorante en liposomas, como en Lip-Q protegería el tinte desde el medio ambiente, mantener alta concentración y la extinción de la fluorescencia asociada y si activada por factores desencadenantes objetivo sería permitir la detección debido al aumento en la fluorescencia.
Sondas liposomales con la composición lipídica subyacente revelan una absorción fagocítica predominante que es inhibida por agotamiento de la energía. Esto se puede ver a través de la absorción de Lip-Q por la línea celular de macrófagos altamente fagocítica J774A.1 murino, y laligeramente fagocítica línea celular de glioblastoma humano U-118 mg a 37 ° C y la inhibición a 4 ° C (Figura 3A y B). El colorante libre DY-676-COOH revela captación en las líneas de células fagocíticas, tanto a 37 ° C y a 4 ° C, que indica que la sonda liposomal Lip-Q no contiene ningún colorante libre residual en la solución y sólo puede someterse a la absorción activa. Escaneo láser confocal imágenes microscópicas fundamentar aún más la absorción y la activación de Lip-Q en las células fagocíticas (Figura 3C). Además, la falta de fluorescencia en la línea celular de fibrosarcoma humano no fagocíticas, HT-1080 indica que la absorción de Lip-Q es predominantemente por fagocitosis y, por tanto, sería adecuado para formación de imágenes de la inflamación en donde monocitos fagocíticas / macrófagos están implicados.
Consistente con la absorción fagocítica de los liposomas observados en líneas de células cultivadas, y debido a la extinción de la fluorescencia de la inyección intravenosa de cables Lip-Q a un tiempo-aumento dependiente de la intensidad de fluorescencia de edema en los modelos de ratones (Figura 4A, Lip-Q), con muy baja fluorescencia de fondo. La intensidad máxima de la fluorescencia de edema se detecta 08.10 horas después de la inyección de Lip-Q. Por el contrario, relativamente fuerte NIR-fluorescencia de todo el ratón es visto después de la aplicación de la libre DY-676-COOH (Figura 4A, DY-676-COOH) o el siempre-en liposomas, Lip-DQ (Figura 4A, Lip-DQ ). En comparación con Lip-Q, la perfusión rápida y liquidación de la libre DY-676-COOH como se ve de 0-4 horas después de la inyección, interfiere con la formación de imágenes, por lo que la detección fiable de edema no es posible (Figura 4A, DY-676-COOH ). Por otra parte, el liposoma no se extinguió, Lip-dQ revela una fluorescencia máxima de edema dentro de 2-4 horas después de la inyección que se mantiene casi constante hasta las 8 horas, después disminuye gradualmente similar a la fluorescencia edema basado Lip-Q-templado. Realizar anal semicuantitativayses, mediante el cual las regiones de interés (ROI) se establecen para el edema frente a fondo, se puede llegar a conclusiones acerca de los diferentes niveles de detección con diferentes sondas. Según el análisis semi-cuantitativo de 5 animales por grupo (sonda), edema puede ser más significativamente (P = 0,001) detectado con el labio-Q que con la libre DY-676-COOH o la no-templado, Lip-DQ (Figura 4B).
Órganos de formación de imágenes de los ratones sacrificados 24 horas después de la inyección de sondas revelan leve fluorescencia ex vivo del / de la vejiga biliar del hígado y los riñones y una muy baja o ninguna fluorescencia del bazo, los pulmones y el corazón (Figura 5), que sirve como evidencia para la eliminación de las sondas a través de la ruta hepatobiliar.
Figura 1: Preparación de liposoma cargado-DY-676-COOHs. (AC) Esquema general de las etapas de síntesis involucrados. (A) Configuración de la hidratación de película y extrusión con el infrarrojo cercano tinte DY-676-COOH. (B) Imagen de la instalación de filtración en gel hecho a sí mismo que muestra la interfase entre el tinte y liposomas no encapsulado (gratis). Los liposomas eluyen primero y aparecen de color azul-verde debido a la DY-676-COOH (azul) encapsulado y el fosfolípido verde incorporado, NBD-DOPE. (C) Imagen Representante de liposomas sedimentos (Lip-Q) después de la concentración por ultracentrifugación. ( D) curva de calibración Representante de DY-676-COOH en 10 mM Tris pH 7,4 (que contiene 1% de Triton X100) utilizada para la cuantificación del tinte liposomal. (E) micrografía electrónica Cryo-transmisión de Lip-Q. Haga clic aquí para ver una versión ampliada de la figura.
Figura 2:. Determinación fisicoquímicas de extinción de la fluorescencia y la activación in vitro (A) espectros de absorción de Lip-Q (derecha) y libre de DY-676-COOH (izquierda) medido en 10 mM de tampón Tris pH 7,4, antes o después de la congelación a - 80 ° C. Tenga en cuenta el doble pico característico de Lip-Q en comparación con el libre DY-676-COOH y la desaparición del pico azul en diferido después de congelación y daños de Lip-Q. (B) correspondientes espectros de emisión de fluorescencia de Lip-Q (derecha) y DY-676-COOH libre (izquierda) mide en 10 mM de tampón Tris pH 7,4 antes o después de la congelación a -80 ° C.
Figura 3: La captación celular y la fluorescencia activación de labio osomes. Las imágenes en (A) fueron preparados por NIR de imágenes de fluorescencia de los sedimentos celulares después de la exposición a las sondas correspondientes para 24 horas a las temperaturas indicadas. Las células HT-1080 no sobrevivieron a los períodos de incubación de 24 horas a 4 ° C. Los diagramas de barras en (B) representan los niveles semi-cuantitativa de las señales de fluorescencia obtuvieron mediante la asignación de ROIs a los sedimentos celulares en A. Cada barra indica la intensidad media de n = 3 experimentos ± SD. Imágenes en (C) fueron adquiridos por microscopía de escaneo láser confocal de células expuestas a las sondas en portaobjetos de cámara de cultivo durante 24 horas a 37 ° C. Tenga en cuenta el alto nivel de fluorescencia en la alta línea celular de macrófagos murinos J774A.1 fagocítica y la fluorescencia moderada en la fagocitosis línea celular de glioblastoma humano leve U-118 mg. La no fagocítica línea celular de fibrosarcoma humano HT-1080 no muestra fluorescencia de las sondas. NBD-DOPE: fosfolípido fluorescente verde.carga / 52136 / 52136fig3highres.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de la figura.
La Figura 4. En la imagen óptica in vivo de edema inducido por zymosan en ratones. (A) La imagen del ratón de la izquierda muestra las posiciones de subcutáneamente aplican zymosan-A (500 mg en 50 l de solución salina) y la solución salina de control (50 l) en el flanco izquierdo. La inyección intravenosa de las sondas indicadas y todo el cuerpo de imágenes de fluorescencia NIR en los puntos de tiempo indicados revelan gradual, pero de alta aumento en las señales de fluorescencia de las señales de edema y bajo fondo de Lip-Q (panel superior) con una fluorescencia máxima después de la inyección 8 hr. El colorante libre revela la perfusión y la rápida eliminación dentro después de la inyección de 4 horas (panel centrall), mientras que Lip-dQ revela la detección de edema con intensidades de señal bajos y una mayor fluorescencia de fondo general. La presentación gráfica en (B) reiterar las señales de fluorescencia observados de edema detectada con cada sonda en comparación con la región de control (solución salina) en n = 5 animales por grupo. Cada parcela representa las señales de fluorescencia media de (n = 5) ± SEM. Con los gráficos, la señal de fluorescencia máxima de edema detectado con cada sonda se distingue fácilmente (Lip-Q, 8 horas; Lip-dQ 2-4 hr y libre DY-676-COOH, después de la inyección de 2 horas). Hay una intensidad de fluorescencia de forma significativa (p = 0,001) más alto del edema con Lip-Lip-Q frente dQ en t = 0 a 24 horas, y con Lip-Q vs libre DY-676-COOH en t = 4.24 h. Haga clic aquí para ver una versión más grande de la figura.
Figura 5: Imágenes de Bio-ópticos ex vivo de órganos de ratones 24 hr aplicación sonda de correos, y los correspondientes análisis semi-cuantitativo de las intensidades de fluorescencia de los órganos. Cada barra representa la media de intensidad de fluorescencia (n = 4) ± SEM. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de la figura.
| Formulación de liposomas | Tamaño [nm] | Índice de polidispersidad (PI) | Potencial Zeta [mV] |
| Lip-DQ (dequenched) | 123,4 ± 0,6 | 0.055 ± 0.02 | -10,6 ± 0,4 |
| Lip-Q (inactivada) | 118,5 ± 0,7 | 0.04 ± 0.02 | -9 ± 2 |
| Lip-NBD (w / o DY-676-COOH) | 123,0 ± 1,4 | 0.04 ± 0.03 | -11 ± 1 |
Tabla 1: Caracterización de los liposomas mediante dispersión de luz dinámica.
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Discussion
Desde liposomas también pueden servir como sistemas de liberación para los tintes fluorescentes, que permiten imágenes de las enfermedades diana. La encapsulación de altas concentraciones de colorantes fluorescentes tales como el colorante NIRF, DY676-COOH se utiliza aquí, conduce a un alto nivel de extinción de fluorescencia del colorante atrapado. Extinción de fluorescencia, un fenómeno visto con muchos fluoróforos en alta concentración puede ser explotado en varias aplicaciones de imagen en vivo, donde se exige una alta sensibilidad y una detección fiable de la zona objetivo. El uso de liposomas también proporciona protección del tinte que es indispensable para aplicaciones in vivo.
La técnica de hidratación de película y la extrusión es un método ampliamente utilizado que permite la preparación con éxito de liposomas con diferentes rangos de tamaño dependiendo de la necesidad, y permite modificaciones tales como la encapsulación de una multitud de diferentes sustancias 25. Por lo tanto, es adecuado para la preparación de labioosomes encapsulado con el colorante fluorescente NIR, DY-676-COOH para los propósitos de formación de imágenes. El método produce liposomas con concentraciones de colorante intravesiculares 600-840 micras, que están dentro de la concentración se inactivó del colorante. El extrusor LiposoFast-Basic mano utilizada para la homogeneización de la dispersión de vesículas formada espontáneamente es adecuado para la preparación de liposomas en pequeña escala de laboratorio, debido a la compatibilidad del dispositivo, con jeringas de volumen hasta 1 ml. Para preparaciones a gran escala, se recomienda el uso de grandes homogeneizadores de alta presión que son capaces de homogeneizar dispersiones de vesículas con una capacidad de 1.000 litros por hora. La cromatografía de filtración en gel (exclusión de tamaño) es un paso crucial que garantiza la separación del colorante encapsulado en liposomas a partir de moléculas no encapsulados (gratis) de tinte 26. La longitud de la columna de filtración en gel es de vital importancia para la separación eficiente de los liposomas de colorante libre. Por lo tanto, es necesario preparar una columna de al menos 28 cm de longitud to separar con éxito los liposomas de la libre DY-676-COOH utilizado aquí. Curiosamente, esta longitud es dos veces más largo que el utilizado para purificar carboxifluoresceína (CF) liposomas cargados de carboxifluoresceína libre. El principal inconveniente de filtración en gel es una dilución de cinco y cincuenta y cinco veces de las muestras purificadas. Esto puede ser compensado por ultracentrifugación, si se necesitan liposomas altamente concentrados. Durante ultracentrifugación los liposomas sedimento y el sobrenadante se puede quitar fácilmente 27. Otras formas de concentrar liposomas, tales como por diálisis 28 son más tiempo que la ultracentrifugación.
Además el método de hidratación de película y la extrusión, el método de evaporación en fase inversa 23, así como el método de inyección de etanol 24 permiten preparación de liposomas con una alta eficiencia de encapsulación para muchas sustancias hidrófilas. Sin embargo, nuestras investigaciones revelaron la hidratación de película combinada con el ciclo de congelación y descongelacións para ser el método más adecuado para una encapsulación intraliposómica suficiente de DY-676-COOH. El aumento de la concentración DY-676-COOH de partida utilizado para la hidratación de película aumenta la eficacia y la concentración del colorante intraliposómica, cuando se utiliza una concentración de lípidos fijo de 30 mM. A pesar de esta eficacia de la encapsulación con el método de congelación y descongelación es inferior al 10% de la concentración de colorante de partida usado, pero sin embargo es suficiente para la encapsulación de la concentración de extinción requerida para la formación de imágenes. Además, el colorante libre separado de los liposomas por filtración en gel puede ser reciclado por la desalinización y la deshidratación de acuerdo con las instrucciones del fabricante, por lo que re-encapsulación posible y una pérdida global de colorante mínimo. La encapsulación del colorante por el protocolo subyacente no tiene influencia sobre el tamaño y la morfología de los liposomas como se ve por los índices de polidispersidad y la micrografía electrónica de Lip-Q.
Varios métodos simples se pueden utilizar para evaluace la actividad de preparados fluorescente liposomes.DY-676-COOH tiene una alta tendencia a la auto-enfriamiento rápido a altas concentraciones de 21,29 probablemente resultan de la formación de H-dímero y las interacciones pi-apilamiento entre moléculas de colorante. Estas interacciones, que se producen debido a la proximidad de los radios Förster de moléculas de colorante en altas concentraciones, pueden ser aniquiladas por dilución 30. Por lo tanto, la encapsulación de altas concentraciones de DY-676-COOH no sólo protege el tinte de opsonización in vivo, sino también desde el tampón circundante, lo cual mantiene su alta concentración y la retención de extinción de la fluorescencia que, puede ser detectada como una absorción de azul desplazado pico y baja emisión de fluorescencia como se ve en la Figura 2. Congelación liposomas gradualmente a -80 ° C conduce a la formación de cristales de hielo dentro del interior acuoso 31 que causa daño a la membrana liposomal cuando se descongela precipitadamente a 30 ° C. La liberación, la dilución y la fluorescencia activación de la intra-liposomal DY-676-COOH en tampón después de la congelación se revela en un único pico de absorción y aumento de casi 2,5 veces en la intensidad de fluorescencia (Figura 2), lo que indica que Lip-Q secuestra por lo tanto un alto, apagando concentración de DY-676-COOH y es activable. Otros métodos para dañar bicapa lipídica liposomal, tales como el uso de detergentes o disolventes orgánicos no revelan diferencias claras entre el colorante libre y el colorante encapsulado liposomal, ya que tanto influyen en las propiedades espectrales de muchos tintes fluorescentes 32. La congelación lenta y método de descongelación dura informó aquí, por tanto, sirve como un método más fiable y prometedor para validar la alta encapsulación de fluoróforos en liposomas y la consiguiente extinción de la fluorescencia. De los espectros de absorción y emisión de intacta Lip-Q (Figura 2), un cierto nivel de fluorescencia residual puede ser detectado. Esto puede resultar de los monómeros no se inactivó tinte dentro de la liposomes y también de la interacción electrostática y la influencia de colorante encapsulado por grupos de cabeza polares de fosfolípidos 33.
Como puede verse en la Figura 3, una acumulación distinta de Lip-Q en el macrófago murino altamente fagocítica y suave línea celular de glioblastoma humano fagocítica, U-34 118 mg, pero no en el no fagocíticas línea celular de fibrosarcoma humano HT-1080, indica que Lip-Q- imágenes basado de la inflamación sería favorable, ya que los fagocitos son los principales actores de los procesos inflamatorios. El hecho de que el agotamiento de la energía suprime la captación de Lip-Q pero no absorción de la libre DY-676-COOH, demostrando la especificidad de la absorción fagocítica de Lip-Q y revela que Lip-Q permanece intacto durante el experimento, de lo contrario la liberación del colorante y captación de energía independiente tendría lugar conduce a la fluorescencia de detección. Inserción de la fosfolípido fluorescente verde, NBD-DOPE en la bicapa de liposomas permite imágenes microscópicas y discrimination entre la no-degradados de liposomas degradadas celulares especialmente si los experimentos de absorción en función del tiempo se hacen como se informó anteriormente 32. Las imágenes microscópicas revelan NIR-fluorescencia de DY-676-COOH que, se correlaciona con los niveles de intensidades de fluorescencia de los sedimentos celulares, tal como se determina por análisis semi-cuantitativo después de incubación a 37 ° C. De acuerdo con esto, las líneas celulares de macrófagos murinos muestran la fluorescencia más elevada, mientras que el glioblastoma humano revelan menor de fluorescencia de ambos DY-676-COOH y NBD-DOPE que el primero. Como era de esperar la línea celular de fibrosarcoma humano, HT-1080 no muestran fluorescencia de cualquiera de los tintes de liposomas o la libre DY-676-COOH, que refuerza el hecho de que la absorción de Lip-Q, es predominantemente por fagocitosis.
Para investigar el potencial de Lip-Q-basa fagocitosis impulsada imágenes in vivo de la inflamación, se consideraron varios controles. Teniendo en cuenta que la libre DY-676-COOH puede ser absorbido por phagocytosis, opsonización de Lip-Q puede llegar a desprender el tinte, que puede ser absorbido por los fagocitos. Para evitar esto, Lip-Q se preparó con 5% en moles PEGilación. Además, es necesario distinguir entre la absorción debido al efecto EPR basado inflamación y la absorción activa y la activación de fluorescencia. Para solucionar esto, la evaluación y comparación de tres sondas diferentes, a saber, la siempre activa, Lip-DQ, el templado Lip-Q y la libre DY-676-COOH en ratones portadores de edema inducido por zymosan fue necesario. Zymosan-A que se prepara a partir de las paredes celulares de Saccharomyces cerevisiae y Candida albicans es un estimulante natural de la secreción de citoquinas a través de la dectin-1 y el receptor de tipo toll 2/6 (TLR 2/6). Citoquinas secretadas a su vez inducen la activación de cascadas de aguas abajo que dan lugar a fugas vasculares, facilitando de esta manera la intravasación / extravasación de monocitos / macrófagos de un depósito esplénica 35, así como los neutrófilos, y su migración a los sitios de inflamación(Edema) 36-39. El proceso basado en los monocitos zimosán / extravasación de macrófagos y la migración necesita sólo 4,5-6 horas que hace zimosan una herramienta estratégica para el estudio de los procesos inflamatorios 36-39. Debido a las fugas vasculares que resultan durante la inflamación, inyectados por vía intravenosa sondas pueden o bien ser absorbidos por los monocitos / macrófagos (fagocitos) durante su migración al sitio de la inflamación o extravasación y deben abordarse en el sitio de edema (efecto EPR) 40. El uso de la no-templado Lip-dQ revela un fondo fuerte en general a las señales de edema que Lip-Q, y un aumento de fluorescencia de edema que refleja la migración de monocitos y macrófagos. En efecto, la fluorescencia máxima de edema se ve ya la aplicación posterior 02.04 h de Lip-DQ y permanece casi constante hasta las 8 h. Opuesto a Lip-DQ y Lip-Q, la libre DY-676-COOH se somete a perfusión rápida después de la inyección y se borra dentro de 4 horas, de modo que distinta de formación de imágenes de edema no es posible. Enterestingly, el uso de los resultados de Lip-Q en aumento persistente en la intensidad de fluorescencia de edema y señales muy bajas de fondo. Este aumento persistente en la intensidad de fluorescencia con Lip-Q se atribuye a la fluorescencia de activación del colorante liposomal en libertad. En conjunto, se puede concluir que la contribución de EPR-efecto en imágenes basado Lip-Q es mínima ya Lip-dQ revelan una fluorescencia máxima (efecto EPR y la migración de monocitos) después de la inyección de 4 horas. Por lo tanto, la encapsulación liposomal proporciona protección y la entrega distinta de DY-676-COOH, que a su vez permite una más fiable de imágenes in vivo de edema, exclusivamente después de la internalización y la degradación (activación de fluorescencia) por las células fagocíticas. Hasta ahora, el uso de edema pata trasera inducida por zymosan para validar las propiedades de formación de imágenes de liposomas fluorescentes es nuevo. El protocolo reportado en la presente memoria se puede ampliar tanto por encapsulación de diferentes colorantes fluorescentes y la formación de imágenes por el efecto de diferentes Dru inhibidorags sobre la inducción de la inflamación, y por lo tanto representa una herramienta útil para la preparación y caracterización de sondas adecuadas para la formación de imágenes biomédicas.
Otro paso crucial hacia la definición de sondas de imagen adecuados es la verificación de sus propiedades farmacológicas y las rutas de eliminación. La distribución de las sondas en los órganos que desempeñan papeles vitales en la excreción, tales como el hígado y los riñones, así como su corta la retención y la eliminación adecuada de estos órganos es generalmente una indicación, que las sondas serán mucho más probable que no muestran efectos adversos en el paciente. De acuerdo con esto, los órganos de los ratones prepararon 24 hr después de la inyección de Lip-Q o la libre DY-676-COOH revelar solamente la fluorescencia leve del hígado / vesícula biliar y los riñones, lo que significa una eliminación preferente de la fluoróforo liposomal a través la ruta hepatobiliar. El alojamiento de corta de las sondas en estos órganos y su eliminación eficaz se fundamenta en un 7-fold mayores señales de fluorescencia de órganos preparados 6 horas después de la inyección de Lip-Q o la libre DY-676-COOH 32. Estas observaciones están de acuerdo con la eliminación de los liposomas 41 y respalda la importancia de incluir los estudios de biodistribución al caracterizar sondas. Aunque los efectos secundarios adversos, tales como irritaciones de la piel y la activación del complemento 42,43 se han reportado para formulaciones liposómicas utilizadas en aplicaciones clínicas, tales efectos no se detectaron con los liposomas subyacentes. Además, la observación de los ratones inmunodeficientes durante dos semanas después de la inyección de la sonda llevado a completar la liquidación de las sondas de los órganos ratones (no se muestra).
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Acknowledgments
Esta labor fue apoyada por las subvenciones de la Deutsche Forschungsgemeinschaft HI-698 / 10-1 y RU-1652 / 1-1. Agradecemos Doreen mayo de asistencia técnica excelente y la compañía Dyomics GmbH, Jena por su amable apoyo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials and equipments for preparation of liposomes | |||
| egg phospahtidylcholine | Avanti Polar Lipids | 840051P | Dissolve in chloroform and store in glass vials (214 mg/ml) |
| cholesterol | Sigma | C8667 | Dissolve in chloroform and store in glass vials (134 mg/ml) |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) | Avanti Polar Lipids | 880120P | Dissolve in chloroform and store in glass vials (122 mg/ml) |
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl) (ammonium salt) | Avanti Polar Lipids | 810145P | Dissolve in chloroform and store in glass vials (2 mg/ml) |
| Sartorius MC1 (d = 0.01 mg) | Sartorius AG | Research RC 210 P | used for weighing the phospholipids |
| Rotavapor | Büchi Labortechnik AG | R-114 | used for hydration of phospholipid film |
| Waterbath | Büchi Labortechnik AG | R-481 | used for hydration of phospholipid film |
| Vacuum Controller | Büchi Labortechnik AG | B-720 | used for hydration of phospholipid film |
| Vacobox | Büchi Labortechnik AG | B-177 | used for hydration of phospholipid film |
| Circulation Chiller | LAUDA DR. R. WOBSER GMBH & CO. KG |
WKL 230 | used for hydration of phospholipid film |
| DY-676-COOH | Dyomics GmbH | 676-00 | Dissolve in 10 mM Tris and store stock at -20°C |
| Tris-(Hydroxymethyl)-aminomethan | Applichem | A1086 | buffer 10 mM, pH 7.4 |
| Trichlormethan | Carl Roth GmbH + Co. KG | Y015.2 | used for liposome preparation |
| Sonicator | Merck Eurolab GmbH | USR 170 H | used for liposome preparation |
| Vortex Genie 2 (Pop-off Cup, No. 146-3011-00) | Scientific Industries Inc. | SI-0256 | used for liposome preparation |
| Sephadex G25 medium | GE Healthcare Europe GmbH | 17-0033-01 | used for liposome purification |
| Triton X100 | Ferak Berlin GmbH | 505002 | used to destruct liposomes for dye quantification |
| LiposoFast-Basic | Avestin Inc. | used for the extrusion of liposomes | |
| Polycarbonate filter membrane, 100 nm (Whatman Nucleopore Trans Etch Membrane, NUCLEPR PC 19 MM, 0.1 U) | VWR | used for the extrusion of liposomes via LiposoFast-Basic | |
| Fluostar Optima | BMG Labtech | used for dye quantification | |
| Zetasizer Nano ZS | Malvern | used for the determination of liposome size and zetapotential | |
| Ultracentrifuge | Beckmann Coulter GmbH | XL 80 | used for concentration of the samples |
| Rotor | Beckmann Coulter GmbH | SW 55 TI | used for concentration of the samples |
| Materials and equipments for the evaluation of liposome and optical imaging | |||
| Zymosan-A from Saccharomyces cereviciae | Sigma | Z4250-250MG | used for induction of inflammation |
| Isotonic Saline (0.9%) | Fresenius GmbH | PZN-2159621 | used for the dilution of Zymosan-A |
| Isoflurane vaporizer | Ohmeda Isotec 4 | used for anesthesizing animals | |
| Isoflurane | Actavis GmbH | PZN-7253744 | anesthesia |
| Thermo Mat Pro 20 W | Lucky Reptile | 61202-HTP-20 | used to keep animals warm during anesthesia |
| Omnican-F (1 ml injection) | Braun | PZN-3115465 | used for subcutaneous and intravenous application of probes |
| Panthenol eye cream | Jenapharm | PZN-3524531 | used to prevent dryness of the eyes of animals during anesthesia |
| Hanks buffered saline solution | PAA Laboratories /Biochrom AG | L2045 | w/o Mg2+, Ca2+ and phenol red. For dilution of probes and for washing of cells |
| 8-Well chamber slides | BD Biosciences | 354108 | used for cell culture followed by microscopy |
| Cell culture flasks | Greiner BioOne | ||
| Cell culture media | Gibco (life technologies GmbH) | ||
| Fetal calf serum | Invitrogen | ||
| Poly-L-Lysine solution (0.01%, 50 ml) | Sigma | P4832 | used to coat cell culture chamber slides |
| Mountant Permafluor | ThermoScientific | S21022-3 | Mounting solution for microscopy |
| Hoechst-33258 | AppliChem | DNA stain for microscopy | |
| Hera-Safe | Heraeus Instruments | sterile work bench used for cell culture | |
| HERA cell | Heraeus Instruments | Incubator used for cell culture | |
| LSM510-Meta | Zeiss | used for confocal microscopy | |
| Maestro-TM in vivo fluorescence imaging system | CRi, Woburn | used for whole body fluorescence imaging of small animals | |
| Spectrophotometer (Ultrospec 4300 pro UV) | GE Healthcare | used for measurement of absorption | |
| Spectrofluorometer (Jasco FP-6200) | Jasco | used for measurement of fluorescence emission | |
| Animals | |||
| NMRI mice (8-12 weeks old, male) | Elevage Janvier, France | used for inflammation trials | |
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