Summary
척수 손상은 심각한 이환율과 사망률이 높은 원인 외상 조건이다. 본 연구에서 우리는 구체적으로 신경 줄기 세포를 이식 하였다 마우스 척수 손상의 타박상 모델을 설명한다.
Abstract
척수 손상은 신경 기능 장애의 복잡한 특징으로하는 파괴적인 임상 상태입니다. 척수 손상의 동물 모델은 부상 생물학적 반응을 조사하고 치료 가능성을 테스트하기 위해 모두 사용될 수있다. 수술로 노출 된 척수에 전달 타박상 또는 압축 부상 병리의 가장 널리 사용되는 모델입니다. 이 보고서에서 실험 타박상 특정 상해 매개 변수의 정의를 통해 재현 손상 동물 모델을 만들 수있는 무한 호라이즌 (IH) 충격기 장치를 사용하여 수행됩니다. 줄기 세포 이식이 일반적 쇠약 상태를 경화시키기위한 전략 잠재적으로 유용한 것으로 간주된다. 많은 연구는 줄기 세포 이식의 다양한 효과를 평가했다. 여기에서 우리는 CD1 쥐에서 세포의 꼬리 정맥 주입 다음 척수 손상에 대한 적응 방법을 보여줍니다. ⅰ) 셀 라벨 위스콘신 : 즉, 우리는 절차를 제공중요한 추적 제, II) 마우스의 수술 전 치료, contusive 척수 손상의 III) 실행, 사후 부검 신경 전구체의 IV) 정맥 투여. 이 모델은 타박상 재생 의학 접근법 효능 및 줄기 세포 이식의 안전성을 평가하기 위해 이용 될 수있다.
Introduction
척수 손상 (SCI)은, 운동, 폭력 1, 자동차 사고와 같은 고 에너지 외상으로 인한 가장 흔한 부상이다 빠진다. 심한 SCI에서 부상 힘은 신경 기능의 갑작스러운 손실을 일으키는 신경 조직을 파괴 또는 손상. 외상 SCI 나이 10, 40 세 사이의 젊은 성인에서 자주 발생합니다. 그것은 크게 환자의 정신적, 육체적 조건에 영향을 미치는 사회 2에 엄청난 경제 효과가 발생합니다. 급성기의 치료 방법은 자주 가능성이 더 손상 3-4 감쇠 코르티코 스테로이드, 수술 안정화 및 압축 해제의 고용량에 한정되어 있지만, SCI 후 전위의 복구에 이러한 방법의 역할은 여전히 논란이있다. 급성 조직 손실, 외상 및 여러 세포 유형 5-6의 변성의 원인이 탈수 초화와 죽음의 보조기구의 활성화뿐만 아니라. 기능의 회복 정도의 수열은 부상 사이트 7에서 절약 백질의 정도에 상관 관계.
SCI의 동물 모델은 부상으로 조직의 생물학적 반응을 조사하고 치료 가능성을 테스트하기 위해 모두 사용될 수있다. 또한, 인간 병리 유용한 동물 모델뿐만 아니라 그 상태의 일부 측면을 재현하는 아니라 직접 관찰과 임상 실험에 비해 많은 장점을 제공한다. 척수 손상의 가장 널리 사용되는 모델은 노출 된 척수 수술 8로 전달되는 압축 타박상 또는 부상을 포함한다. 제어 무게 드롭 타박상 부상의 개발은 SCI 연구의 역사에서 중요한 이정표를 나타냅니다. 오하이오 주립대 척수 연구 센터 컴퓨터 (9)에 의해 제어 된 충격 파라미터를 척수의 특정 압축을 유도하기 위해 사용될 수있는 장치의 기술적 과제를 추구하고있다. 이것은 원래 사용 위스콘신 위해 설계되었습니다일 쥐; 나중에 쥐 10으로 적용하도록 수정되었습니다. 이러한 종류의 접근 방식의 이점은 손상의 역학은 더 깊이 연구 할 수 있고 부상 파라미터 재현성 실험 모델을 얻기 위해서 더욱 완벽한 방식으로 정의 될 수 있음을하며, 따라서 효과의보다 정확한 평가를 허용 기능 회복 과정에 대한 시험 처리.
많은 연구 SCI 모델 (11)에서 줄기 세포의 다양한 이식 효과를 평가했다. 우리는 최근에 마우스 기증자 (12 ~ 13)의 죽음 이후 하위 심실 구역 (SVZ) 몇 시간에서 성인 신경 줄기 세포를 격리했다. 이 절차는 SCI 치료를위한 재생 의학의 접근에 유리한 것으로 보인다 신경 줄기 세포라는 사후 신경 전구 물질 (PM-의 NPC)의 인구를 제공합니다. 본 논문에서는 설명 할 것이다 : ⅰ) 중요한 추적 PKH26와 셀 라벨을위한 프로토콜, ⅱ) surg적인 절차는 외상 SCI에 수행하고, 표지 세포의 ⅲ) 정맥 주사 (IV) 관리합니다. 또한,이 연구에서 우리는 이식 된 세포가 척수 병변 사이트로 마이그레이션 및 미세 소관 관련 단백질 (MAP)이 양성 세포에 주로 차별화 것을 보여줍니다. 또한, 분화는 뒷다리 기능의 안정 회복 촉진 수반한다.
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Protocol
참고 : 모든 절차는 밀라노 대학의 심의위원회의 승인을 유럽 공동체 지침 일자 1986년 11월 (6백9분의 86 / EEC)을 준수하여 실험 동물에 대한 이탈리아의 가이드 라인을 충족했다.
이식 용 세포의 1. 준비
참고 : 5,이 실험에 대한 문화에서 9 통로 사이에 사용 신경 줄기 세포; 이식 표지되기 전에 증식 및 분화 능력에 대한 문화를 테스트합니다. (12)를 면역 세포로 분화의 정도를 결정합니다.
- 1 × 106 세포 / 150 μL (이식 마우스 1 마리당 1 × 106 세포)의 농도로 세포를 재현 탁. 세포의 과잉이 주사기 로딩을 위해 필요하기 때문에 마우스 당 최소 1.2 × 10 6 세포를 준비합니다.
- 10 ML 원뿔 유리 병에서 세포를 신경 줄기 세포 매체 (13)를 사용하여 3 회 반복한다. 각에서세척 단계를 원심 분리에 의해 침전물을 셀 (500 XG 5 분간 RT).
- 마지막 스핀 전에 세포를 계산합니다.
- 세포 (5 분 500 XG)를 원심 분리기하고 모든 세포를 제거하지 않도록주의하면서 그러나 상층 액의 25 개 미만 μl를 떠나, 뜨는을 대기음.
- 부드럽게 피펫 팅과 세포 펠렛을 재현 탁하고 희석액 C 1 ㎖를 첨가하여 2 배 세포 현탁액을 제조.
- 튜브에 희석제 C 1 ㎖에 PKH26 에탄올 염료 용액의 4 μl를 추가하여 희석제 C에서 - (6 M 4 × 10)과 분산 잘 혼합 즉시 염색을하기 전에, 배 염료 솔루션을 준비합니다.
- 신속 배 염료 액 1ml에 2 배 세포 현탁액 1ml를 추가하고 즉시 (ML 1.2 × 10 7 세포 / 2 × 10이 될 것이다 최종 세포 밀도 - 6 M PKH26) 피펫으로 시료를 혼합한다.
- 1-5 분 동안 셀 / 염료 서스펜션을 품어.
- (동일한 부피를 첨가하여 2 염색을 중지mL) 중 HBSS에 1 % BSA 용액 1 분 동안 배양한다.
- 원심 분리기 세포 (500 XG 분 10) 조심스럽게 뜨는을 제거합니다.
- HBSS 원심 분리 (5 분, 500 XG) 10ml에 재현 탁 된 세포 펠렛.
- 결합되지 않은 염료의 제거를 보장하기 위해 완전 배지 10 mL로 세포 펠렛을 2 번 더 세척 하였다.
- 복구 세포, 세포 생존 및 형광 강도의 평가를위한 완전 배지 10ml에 세포 펠렛을 재현 탁. 세포는 이식을 위해 필요한 경우, 세척 및 3.3 X 105 세포 / 50 μL의 농도로 멸균 된 생리 용액에서 그들을 재현 탁.
수술 2. 준비
- 청소 및 소독 수술 장비.
- 무균 에이전트 닦아 수술 영역을 준비합니다. IH 임팩터 장치를 설정합니다.
- 마취 장비를 준비합니다 VetScav 필터, 연속 흐름 유도 상공 회의소, 산소 진 장치의 무게와 활성 가스 소제rator, 마우스에 대한 저 유량 O 2 미터. 유도 챔버 및 수술시 사용되는 마스크를 청소합니다.
- 2.5 % 산소 (v / v)의 이소 플루 란 (/ 분 1 L)과 동물을 마취하고, 약물을 적용하려면 흐름 유도 후 5 분을 기다립니다. 수염이 꿈틀 경우 확인하거나 발바닥을 곤란에 응답 속도가 느린 뒷다리 철수가있는 경우. 수술하는 동안, 2.0 % 산소 (v / v)의 이소 플루 란 (/ 분 1 L)에 이소 플루 란 농도를 감소.
수술 및 이식을위한 마우스 3. 준비
- 표준 조건에서의 실험 (22 ± 2 ° C, 습도 65 %, 그리고 오전 8시부터 오후 8시까지 사이에 인공 조명) 전에 최소 3 일 동안 성인 남성 CD1 마우스 (25 ~ 30 g)을 유지합니다.
참고 : 봉합으로 수술 준비에서 전체 절차는 약 40 분 소요됩니다.- 동물을 식별하기 위해 방수 색 잉크에 의해 꼬리를 표시합니다.
- ELECTR를 사용하여IC 깎기는 요추 영역에 대한 T2 수준에서, 목에서 마우스의 등 머리를 잘라합니다.
- 요오드 용액 및 에탄올 (멸균 70 %)로 제조 된 영역을 소독.
- (200)의 서브 피부 (SC) 주입 μL 겐타 마이신 (멸균 생리 식염수에 1 ㎎ / ㎖)와 동물을 취급합니다.
- 부 프레 노르 핀을 탈수를 방지하고 주입하는 두 동물의 눈 안과 윤활제를 적용 (피하, 0.03 ㎎ / ㎏)은 통증을 경감 할 수 있도록하고있다.
4. 후궁 절제술
- 수술 중 저체온증의 문제를 방지하기 위해 슬라이드 따뜻한에 마우스를 놓습니다. 등쪽면을 위로하여 동물을 배치합니다.
- T7에서 T12에 관심 영역에 걸쳐 메스와 수직 절개를합니다.
- (일반적으로 흉부 등의 프로세스 번째 5 번째와 6 사이의 공간에 있음) 표준 집게를 사용하여 피부 표면의 지방 패드를 잡습니다.
- T6와 같은 용기하에 프로세스 개수다음 T7로 이동합니다.
- 척추의 만곡을 증가 마우스의 복부 측면에서 작은 베어링을 놓습니다. Graefe 씨 집게로를 차단하여 척수를 고정.
- 라미 접촉 메스 팁의 지느러미 표면까지 메스를 사용하여 T7과 T10 척추 수준에서 양측 척추 주위 근육을 잘라.
- T10까지 T7에서 접합을 체크하기 위해 메스를 사용합니다. T8 및 T9 가시 돌기 사이의 공간에 중지합니다. 마이크로 가위 T8-T9과 T9-T10 사이의 조직을 잘라.
- T9 프로세스를 제거 Rongeur를 사용합니다. 신중 마이크로 가위 근육층 모으기하여 접합을 노출. 뼈가 노출 될 때까지 계속합니다.
- 얇은 판에서 근육을 제거하고 척추 사이의 작은 공간을 열기 위해 집게를 사용합니다. 조심스럽게 뼈 아래에있는 마이크로 가위를 삽입 양쪽에 얇은 판을 잘라 집게로이 부분을 제거합니다.
- F와 라미 제거orceps는 코드를 노출합니다. 뒤에 어떤 무료 또는 톱니 뼈 조각이 남지 않도록해야합니다; Rongeur으로 제거합니다.
- 절개 근처에있는 것입니다 골막뿐만 아니라 뼈 조각이나 근육을 제거하기 위해 작은 팁 집게를 사용합니다.
- T9 지느러미 과정의 위쪽 절반을 제거하고 IH 임팩터 장치 프로토콜로 진행합니다.
5. IH 임팩터 장치 프로토콜 (타박상)
- IH 장치의 임팩터 안정화 플랫폼의 중앙에 마우스를 놓는다.
- 두 공동 위치 무기에 의해 안정화 플랫폼과 연결된 두 치아 집게로 동물 (흉추에 대한 왼쪽 팔, 경추에 대한 오른팔)을 차단합니다.
- 주동이의 추체 (T8)의 측면 가장자리를 파악하는 주동이의 팔을 사용합니다.
- T10 척추체를 파악하는 것이 동일한 방식으로 아암을 조작 꼬리.
- 끝을 장치의 안정화 플랫폼을 놓고 낮은 (직경 0.75mm)을 터치하지 않고 가능한 한 코드에 가깝게.
- 영향을 시작하기 전에 끝을 세 완전한 회전을 올립니다.
- 100mm / sec로 60 kdyn의 힘을 제공하기 위해 설정 충격기와 타박상을 수행합니다.
6. 봉합 및 사후 관리
- 4/0 흡수성 봉합사와 절개를 봉합. 제거 박판의 노출 부위에서 척수를 표지; 작은 바늘을 이용하여 절단 말단에서 조직을 봉합. 바로 위 척수 노출의 사이트에서 두 개의 바늘을 넣습니다.
- 기본 근육을 곤란하게하지 않고 두 개 또는 세 개의 반사 클립을 사용하여 피부를 닫습니다.
- 허리에 주입 된 식염수의 피하에 2 ㎖와 마우스 수술 후 수분을.
- 수술 복구하는 동안 저체온증을 방지하기 위해 다시 예열 케이지에서 마우스를 놓습니다. 가열 패드에 배치 새장.
- 을 확인하여 급성기 이후 부상 동안 마우스를 모니터크기 방광, 봉합사 및 동물 중량 하루에 두번. 부드럽게 (묻은, 흐림이나 침전물을 함유하는 수 소변) 요로의 감염을 방지하기 위해 블래 더 (7 일 동안 하루에 두 번) 짠다.
- 항생제 (이일 수술 후 피하 주입을위한 2 ml)에 생리 식염수 주입으로 하루에 한 번 마우스를 치료 (겐타 마이신 0.2 ml를, SC 주입) 5 일 동안이 부상을 게시 할 수 있습니다.
- 부 프레 노르 핀과 수술 후 통증에 대한 쥐 치료 (0.1 ㎎ / ㎏을, 하루에 두 번) 3 일간 부상을 게시 할 수 있습니다.
세포의 7 꼬리 정맥 주입
참고 : 다음 단계에서 꼬리 정맥 내로 세포를 주입하기위한 절차가 설명된다. 세포는 또한 고정대 15-16을 사용하여 이식 척수 내 투여, 또는 치스 테르 나디 라티 나 마그나 (17) 내로 할 수있다. 이는 다른 세포 유형과 같은 중간 엽 기질 세포와 같이이 방법으로 이식 될 수 있음을 고려해야(예를 들어, 골수 간엽 줄기 세포, 지방 유래 줄기 세포, 세포 양수). 또한, 이러한 나노 입자와 같은 다른 치료 옵션이 척수 손상 후 꼬리 정맥을 통해 주입 될 수있다.
- 사용하기 전에 바늘을 청소하는 70 % 에탄올과 PBS를 사용합니다. 바늘 만 멸균 장갑 주사기를 처리합니다.
- 0.3 ml의 주사기 (29 G 바늘 및 주사기 0.33 CC)로 테스트 튜브 및로드 셀의 75 μl를 세포에 재현 탁.
- 기포가 세포 현탁액 내에 존재 없는지 확인합니다. 세포의 침강을 방지하기 위해 수평 위치에서 주사기 유지.
- 꼬리 정맥을 팽창하기 위해 가열 램프 아래에 마우스를 놓습니다.
- 좁은 파란색 선으로 측면 꼬리 정맥을 시각화하기 위해 마우스 제한 수단으로 조심스럽게 잡아 당겨 마우스를 잡고.
- 알코올 면봉으로 꼬리를 청소합니다. 정맥이 가시화되면, 왼쪽 손의 가운데 손가락과 엄지 손가락 사이의 꼬리 정맥을 잡아.
- 수평선에서 15도 각도로 표면에 바늘을 가져오고 경사가 있는지 확인합니다.
- 0.33 μL / sec의 속도로 세포의 50 μl를 주입한다. 주입 후, 10 초 바늘의 수축을 지연. 천천히 바늘을 후퇴 및 세포 현탁액의 가능한 유출에주의를 기울이십시오.
- 부하 사이의 단계 7.1에서와 같이 주사기를 청소합니다.
8. 행동 테스트 및 뒷다리 기능
- 열기 필드에서 마우스를 놓습니다.
- 바소 마우스 규모 (BMS) (18)에 따라 오픈 필드 테스트와 타박상 후 전위의 기능과 뒷다리 복구를 평가합니다.
참고 : 신경 기능 4 주 (18)에 대한 손상 후 3 일에서, 정기적으로 평가되어야한다.
9. 관류
- 실험 기간의 끝에서, 펜토 바르 비탈 나트륨의 복강 내 주사 (65 ㎎ / kg)에 의해 동물을 마취. evaluat하기 위해 발가락 핀치를 사용전자 마취 수준은 마우스가 유해 자극에 응답하지 후에 만 진행합니다.
- 수술 비행기에 앙와위에서 동물을 제지합니다.
- 흉곽 아래의 외피와 복부 벽을 통해 잘라. 간에서 다이어프램을 분리합니다.
- 흉강을 노출 다이어프램을 잘라 가위를 사용합니다.
- 칼라 뼈까지 흉곽의 측면을 잘라.
- 칼 모양의 연골을 고정하고 머리 지혈을 배치 지혈제를 사용합니다.
- 집게로 횡단하는 비행기에 마음의 바닥 세 번째를 잡습니다. 좌심실에 바늘을 삽입합니다.
- 마음을 고정하는 지혈제를 사용합니다. 이 바늘을 확보하고 유출을 방지 할 수 있습니다.
- 우심방을 잘라 가위를 사용합니다.
- PBS는 동물을 통해 (18 ml / 분)을 펌프 할 수 있습니다. (약 70 ml의 PBS에 해당하는 3-4 분) 버퍼 주입 기간 동안이 압력을 유지한다. 마음이 깨끗해질 때까지 계속합니다.
- 펌프를 통해 정착액 (증류수에서 4 % 파라 포름 알데히드, 4 % PFA)을 허용하는 꼭지를 전환합니다. 4 % PFA는 약 8 ~ 10 분 (300 ml)에 대한 동물을 통해 펌프 할 수 있습니다. 점차적 / 분으로 30 ㎖가 최대에 도달하는 압력을 증가시킨다. 강화 간 성공적인 관류의 가장 좋은 지표이다.
10. 조직 수집 및 처리, 조직학 및 Iimmunohistochemistry
- T5에서 L1에 척수를 해부하다. 그리고 (4 ° C에서 O / N) 4 % PFA 6 ml의 조직을 사후 수정.
- 크라이를 보호하고 동결 중에 결정의 형성을 방지하기 위해 39 ° C에서 72 시간 동안 30 % 수크로오스 용액과 동일한 조직을 넣어.
- 빠른 드라이 아이스를 사용하여 코드를 동결 -80 ° C에서 보관합니다.
- 15㎛의 두께의 저온 유지 장치에 의해 부와 유리 슬라이드 상에 수집하고 섹션을 면역 세포 화학 계속.
- 각의에 대한 PBS 200 μL와 섹션을 씻어LIDE (3 회, 각 5 분, RT).
- (200) 10 % NGS의 μL 및 실온에서 1 시간 동안 PBS에서 0.2 % 트리톤 X-100 각 슬라이드를 Permeabilize 하시려면.
- 각 슬라이드에 대한 PBS 200 μL (5 분마다, RT 3 회)와 섹션을 씻어.
- (; PBS에서 0.1 % 트리톤 X-100 5 % NGS) 30 분 (RT)에 대한 슬라이드 차단 솔루션의 200 μL와 비 특정 사이트를 차단합니다.
- 4 ° C에서 O / N 차 항체 200 ㎕를 각 슬라이드를 품어 (5 % NGS에 항체를 희석; PBS에서 0.1 % 트리톤 X-100).
- 각 슬라이드에 대한 PBS 200 μL로 섹션을 씻으 (3 회, 5 분마다; RT).
- 실온에서 2 시간 동안 적절한 보조 항체를 품어.
- 각 슬라이드에 대한 PBS 200 μL로 섹션을 씻으 (3 회, 5 분마다; RT).
- 4 ', 6- diamidin -2- phenilindole (DAPI) (/ ml의 최종 농도 1 μg의, RT에서 10 분) 200 μL와 얼룩 핵.
- FluorSave 시약을 사용하여 마운트하고 공 초점 현미경으로 분석 할 수 있습니다.
참고 :에서제어 결정, 차 항체를 생략하고 같은 서브 클래스의 무관의 IgG 해당하는 농도로 교체해야합니다. 미세 소관 연관 단백질 2 차 항체를 사용 하였다.
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Representative Results
이식 된 세포의 총 수는 1 × 10 6 세포이며 꼬리 정맥에서 세 개의 연속 주사로 분할 하였다. 우리는 인산 완충 용액 50 μL (PBS)에 3.3 × 105 세포를 투여. 첫 번째 주사는 두 번째 6 시간 후, 손상 후 30 분 내에서 수행 병변 후 지난 18 시간했다. PM-NPC의 SCI에 대한 투여 후 18 시간의 시간 제한의 선택은이 시점에서 14의 혈액 뇌 장벽의 투과성을 최적으로 결정 하였다. 줄기 세포 주입의 효과를 평가하기 위해 또한 양성 대조군 laminectomies 동물이 유용 할 것이다 (N = 14)와 PBS가 음성 대조군 (N = 14)로 주입 된 동물.
PM-의 NPC, 뒷다리 기능의 복구를 향상 병변 사이트로 마이그레이션 및 MAP-2 양성 세포의 분화
T9는 타박상 프로그레시브 g이어서 뒷다리 기능의 과도 손실을 야기radual 복구 (그림 1). 2~3주 내에서, PBS 처리 부상 마우스는 개선 뒷다리 기능은 BMS (또는 무게의 지원이나, 가끔 자주, 또는 일관성 등의 스테핑없이의 발바닥 배치에 해당하지만, 발바닥 18 스테핑되지 않음)의 3 점에 도달 . 대신, 동일한 관찰 기간내 PM-NPC의 처리 부상 생쥐 (조율 또는 어떤 조율 스테핑 빈번한 또는 일관성 발바닥없이 자주 또는 일관된 발바닥 스텝에 대응) BMS 4.5 점에 도달, 더 높은 회복을 보였다. 행동 개선은 SCI 후 7 일 및 14 일 사이의 기간에 특히 분명했다. 이질통 같은 앞다리 하이퍼 감성 (19)의 흔적은 30 일의 관찰 기간 동안 모든 실험군에서 언제든지 기록되지 않았다.
의 가장자리에 축적 PKH26 (그림 2)로 표지 대부분의 접목 PM-의 NPC,병변 클러스터를 형성하는 그들의 관리의 초기에서 (그림 3). 그런 이식 세포 병변 가장자리를 따라 점진적으로 그들이 비대칭 뉴런의 세포 형태를 가정하면,보다 분화 된 확산 방식으로 이주. 병변 및 이식 후 30 일째, PM-의 NPC의 세포체의 크기가 증가하고 대부분의 세포에서 수지상 같은 과정은 분명했고, 완전히 (그림 4)-2 맵에 특이적인 항체에 의해 면역 염색. 형태 학적 복잡성의 성취와 이식 PM-NPC들에 의해 MAP2에 대한 양성는 사용자가 자신을 명확하게 차별화 된 형태와 단일 레이블 셀에 두 개의 핵의 부재에 분명하다 호스트 척수 신경 세포를 생존과 융합에 의한 없습니다.
그림 1. PM-의 NPC 기능 RECOV을 향상부상당한 동물의 ery가. 오픈 필드 운동은 운동 기능 회복 (18)의 측정에 사용되는 시험이었다. 동물 타박상 전날 테스트 BMS 규모에 9 점을 획득했다. 병변 동물 첫날 게시물 부상에서 BMS 점수 0으로 감소했다. 동물 PM-NPC들로 처리했을 때 병변 마우스 뒷다리의 기능 회복 및 장기적인 현저한 개선을 보였다. 분석은 이중 맹검 법으로 수행 한 후, 각 그룹은 14 마리의 동물로 구성시켰다. 값은 평균 ± SEM을 나타냅니다. 우리는 Tukey의 사후 테스트 다음 ANOVA 테스트에 의한 통계적인 차이를 결정했다. *** P <0.001; ** PBS 대 P <0.01.
그림 2. PM-의 NPC의 PKH26 표시. PKH26와 라벨 과정을 거친 후, PMNPCS는 VISU은 라이브 영상 현미경 플로리다 EVOS alized 및 현미경가 같은 악기 (스케일 바 = 50 μm의)로 촬영했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
병변 사이트 PM-NPC가도 3의 현지화. PKH26로 표지 된 PM-NPC들 (적색)들은 정맥 내 주사 후 30 일째에 병변 부위의 가장자리에 걸쳐 존재한다. 이미지가 한 마우스를 대표하지만, 비슷한 이미지는 적어도 5 동물 (스케일 바 = 50 μm의)에 대한 얻었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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이식 PM-NPC들. 대부분의 PKH26 표지 PM-의 NPC (빨간색) 그림 4. MAP2 식 수지상 같은 프로세스와의 연결과 같은 형태를 인수 MAP-2 양성 세포 (녹색)을 차별화했다. 핵은 파란색 (DAPI)에서 염색. 이미지가 한 마우스를 대표하지만, 비슷한 이미지는 적어도 5 동물 (스케일 바 = 25 μm의)에 대한 얻었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
본 논문에서는 (중증) 70 kdyne의 힘에 무한 호라이즌 임팩터를 이용하여 외상성 척수 손상 모델의 재현성을 얻기위한 방법을 설명했다. 더 큰 힘 패러다임 (80 kdyne)를 사용하여, 우리는 불행하게도 더 높은 마우스의 사망률보다 심각한 부상을 입을 수 있습니다. 이 문제를 방지하기 위해, 우리는 일반적으로 기능 및 저급 사망률의 점진적인 회복 반복 환부에 연관된 적당한 힘 패러다임 (kdyne 70)를 선택한다. 그것은 임팩터 플랫폼 동물의 정확한 고정에 특히주의하는 것이 매우 중요하다 그러한 안정한 부상을 생성하는 단계; 특히 척수 임팩터 팁 중심되어야하고 임팩터의 2 개의 아암은 서로 평행해야한다. 또한, 관심은 척추가 분쇄 될 수 있으며, 코드가 포셉의 팁에 의해 손상 될 수있는 경우, 임팩터 집게로 동물을 차단에주의해야합니다. 애니의 위치척추 후궁 절제술 후 L이 중요하고,이 과정 중 동물 취급도 매우 중요하다. 특별한주의는 항상 같은 사이트에서 같은 연장을 수행해야하는 후궁 절제술 절차에 부여해야합니다. 이러한 절차는 척추 후궁 절제술을 행하면, 모니터하는 다른 방법론적인 문제는 뼈를 절단 박판의 제거를 통해 코드를 해제하기 Rongeur를 마이크로 가위를 사용하거나, 집게 때 코드의 손상의 위험의 감소는,을 제거 측면 뼈 돌출부와 조각을, 나머지 한 것은 골막을 제거합니다. 위쪽을 가리키는 팁 마이크로 가위와 Rongeur의 사용은 상술 한 문제를 발생의 위험을 줄일 수 있습니다.
이 방법의 중요한 한계는 동물이 포스트 부상 기간에 내부 및 외부의 심한 요로 감염을 개발할 수있는 가능성이 높은 것입니다. 외부 감염 개월에 병변 마우스의 무능력에 기인한다뒷다리 무게 지원했습니다. 반면, 내부 요로 감염은 독립적으로 소변을 부상당한 쥐의하지 못하여 발생하는 문제 일 수 있습니다. 이 지시 된 항생제를 주입 동물 절대적으로 필요하다 이들 문제를 피하고 첫주의 동물 관리 절차 동안 하루에 두 번 방광의 크기를 확인하기 위해. 수화 상태와 무게는 병소 후 처음 세 개의 주 동안주의 깊게 확인해야합니다.
우리 바소 및 동료 (BMS) (18)에 의해 개발 된 특정 행동 시험을 통하여 평가 하였다 뒷다리 함수 재현성 적자를 얻을 수 있었다 기재된 절차를 적용. 즉시 손상 후 기능의 뒷다리 손실은 제 2-3주 중에 가장 중요한 점차 회복 뒤에 완전하게 수행된다. 병변은 성인 쥐의 NPC-PM (도 1로 처리 할 때 행동 복구 높은 수준에 도달 (그림 3)의 가장자리에서 공 초점 현미경을 이용하여 PKH26 긍정적 인 PM-의 NPC를 발견했습니다. 우리는 중요한 그래프트 PM-의 NPC의 갯수가 앞서 연구 그룹에 의해보고 20-21 그래프트는 ESC 성인 NSCs의보다 큰 것으로 추정 하였다. 병소 및 이식 후 사주에서 가장 PM-NPC의 큰 몸이 완전히 (그림 4)-2 맵에 특이적인 항체에 의해 면역 염색 수지상 같은 프로세스를 확장 가지고있다.
외상성 척수 손상 모델의 주요 이점은 손상의 표준화이다. 함수의 뒷다리 회복 시간 관련 재현 곡선도 달성된다. 이러한 재현성은 재생 의학의 STUDIE에 대한 세포의 이식을 포함하여 조사 처리에 대한 원리 증명 연구를 정의하는 것을 가능하게경우의 수가 줄어든의. 또한, 척수 손상의 병태 생리의 여러 측면이보다 상세히 분석 할 수있다.
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Disclosures
저자는 더 경쟁 재정적 이해 관계를 선언합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PKH26GL-1KT | Sigma | 091M0973 | |
| Infinite horizon (IH) Impactor device | Precision Systems and Instrumentation, LLC | Model 0400 Serial 0171 | |
| Gentamycin 10 mg/ml | Euroclone | ECM0011B | 1 mg/ml in sterile saline solution |
| Isoflurane-Vet 250 ml | Merial | B142J12A | |
| Blefarolin POM OFT 10 g | |||
| Slide Warmer | 2Biological Instruments | HB101-sm-402 | |
| Scalpel, size 10 | Lance Paragon | 26920 | |
| Small Graefe Forceps | 2Biological Instruments | 11023-14 | |
| Rongeur | Medicon Instruments | 07 60 07 | |
| Micro scissors | 2Biological Instruments | 15000-00 | |
| Absorbable sutures (4/0) | Safil Quick | C0046203 | |
| Hemostat | 2Biological Instruments | 13014-14 | |
| Reflex 7 wound clip applicator | 2Biological Instruments | 12031-07 | |
| 7 mm Reflex wound clips | 2Biological Instruments | 12032-07 | |
| NGS | Euroclone | ECS0200D | |
| Triton X 100 | Merck Millipore | 1086431000 | |
| Anti Microtubule Assocoated Protein (MAP) 2 | Millipore | AB5622 | |
| Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11008 | |
| FluorSave Reagent | Calbiochem | 345789 | |
| Neural stem cells medium | DMEM-F12 medium (Euroclone) containing 2 mm l-glutamine (Euroclone), 0.6% glucose (Sigma-Aldrich), 9.6 gm/ml putrescine (Sigma-Aldrich), 6.3 ng/ml progesterone (Sigma-Aldrich), 5.2 ng/ml sodium selenite (Sigma-Aldrich), 0.025 mg/ml insulin (Sigma-Aldrich), 0.1 mg/ml transferrin (Sigma-Aldrich), and 2 μg/ml heparin (sodium salt, grade II; Sigma-Aldrich), bFGF (human recombinant, 10 ng/ml; Life Technologies) and EGF (human recombinant, 20 ng/ml; Life Technologies) | ||
| DMEM-F12 | Euroclone | ASM5002 | |
| l-glutamine | Euroclone | ECB3000D | |
| glucose | Sigma-Aldrich | G8270-100G | |
| putrescine | Sigma-Aldrich | P5780-25G | |
| progesterone | Sigma-Aldrich | P6149-1MG | |
| Sodium-selenite | Sigma-Aldrich | S9133-1MG | |
| transferrin | Sigma-Aldrich | T 5391 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I1882 | |
| Heparin sodium-salt | Sigma-Aldrich | H0200000 | |
| bFGF | Life Technology | PHG0024 | |
| h-EGF | Life Technology | PHG6045 | |
| Syringe 0.33 cc 29 G | Terumo | MYJECTOR | |
| buprenorphine | Schering Plough SpA | TEMGESIC | |
| eye gel | Bausch & Lomb | LIPOSIC |
References
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