Summary
إصابة الحبل الشوكي هي حالة الصدمة التي تسبب الاعتلال الشديد وارتفاع معدل الوفيات. في هذا العمل ونحن تصف بالتفصيل نموذج كدمة من إصابة الحبل الشوكي في الفئران تليها زرع الخلايا الجذعية العصبية.
Abstract
إصابة الحبل الشوكي هو شرط السريرية مدمرة، وتتميز مجموعة معقدة من الاختلالات العصبية. نماذج حيوانية من إصابة الحبل الشوكي يمكن استخدام كلا للتحقيق في الاستجابات البيولوجية للإصابة واختبار العلاجات المحتملة. كدمة أو ضغط إصابة تسليمها إلى الحبل الشوكي يتعرض جراحيا هي النماذج الأكثر استخداما على نطاق واسع من الأمراض. في هذا التقرير يتم تنفيذ كدمة التجريبية باستخدام اللانهائي الأفق (IH) جهاز المتصادم، والذي يسمح بإنشاء نموذج حيواني إصابة استنساخه من خلال تعريف المعلمات إصابة محددة. يعتبر زرع الخلايا الجذعية عادة استراتيجية يمكن أن تكون مفيدة لعلاج هذا الشرط المنهكة. وتقييم دراسات عديدة آثار زراعة مجموعة متنوعة من الخلايا الجذعية. نحن هنا لشرح طريقة تكييفها لإصابة الحبل الشوكي يليه الذيل الوريد حقن الخلايا في الفئران CD1. باختصار، نحن نقدم إجراءات ل: ط) وضع العلامات خلية وايعشر التتبع الحيوي، والثاني) الرعاية ما قبل المنطوق من الفئران، الثالث) تنفيذا لإصابة الحبل الشوكي contusive، والرابع) الوريد من بعد الوفاة السلائف العصبية. ويمكن استخدام هذا النموذج كدمة لتقييم فعالية وسلامة زرع الخلايا الجذعية في نهج الطب التجديدي.
Introduction
إصابة الحبل الشوكي (النخاع الشوكي) هو الإصابة الأكثر شيوعا التي تسببها الصدمة ذات الطاقة العالية مثل الحوادث والسيارات، وتقع والرياضة والعنف 1. في SCI شديد، القوة إصابة بتدمير أو أضرار الأنسجة العصبية، مما تسبب في خسارة مفاجئة من وظيفة الجهاز العصبي. صدمة اصابات النخاع الشوكي غالبا ما يحدث لدى البالغين الذين تتراوح أعمارهم بين 10 و 40 سنة من العمر. أنه يؤثر بشكل كبير الحالة العقلية والجسدية للمريض ويسبب تأثير اقتصادي هائل للمجتمع 2. نهج العلاج في المرحلة الحادة غالبا ما يقتصر على جرعة عالية من الستيرويدات القشرية، وتحقيق الاستقرار الجراحي وإزالة الضغط لربما تخفيف مزيد من الضرر 3-4، ولكن أدوار هذه الأساليب على الانتعاش الحركي بعد اصابات النخاع الشوكي لا تزال مثيرة للجدل. بالإضافة إلى فقدان الأنسجة الحادة، والإصابات وتفعيل آليات الثانوية من انحطاط سبب إزالة الميالين والموت من أنواع الخلايا متعددة 5-6. درجة استعادة وظيفة يمكن للعشرة تكون مرتبطة إلى حد المادة البيضاء يدخر في مكان الاصابه 7.
ويمكن استخدام النماذج الحيوانية من اصابات النخاع الشوكي على حد سواء للتحقيق في الاستجابات البيولوجية للأنسجة للإصابة واختبار العلاجات المحتملة. وعلاوة على ذلك، وهو نموذج حيواني مفيد لأمراض البشري لديه ليس فقط لإعادة إنتاج بعض جوانب هذا الشرط ولكن أيضا يجب أن توفر المزايا على الملاحظة السريرية المباشرة والتجربة. النماذج المستخدمة على نطاق واسع من إصابة الحبل الشوكي تنطوي كدمة أو ضغط إصابة تسليمها إلى الحبل الشوكي يتعرض جراحيا 8. تطوير اصابة في الوزن الإفلات كدمة تسيطر تمثل معلما هاما في تاريخ البحوث اصابات النخاع الشوكي. مركز أبحاث النخاع الشوكي جامعة ولاية أوهايو انتهجت التحدي التكنولوجي للجهاز والتي يمكن استخدامها للحث على ضغط معين من الحبل الشوكي مع المعلمات من تأثير يسيطر عليها جهاز كمبيوتر 9. وقد تم تصميم هذا أصلا للاستخدام وايالفئران عشر. في وقت لاحق تم تعديله لتطبيق نحو 10 الفئران. مزايا هذا النوع من النهج هي أن الميكانيكا الحيوية الإصابة يمكن دراستها أكثر في العمق ويمكن تعريف المعلمات الإصابة بطريقة أكثر اكتمالا من أجل الحصول على نموذج تجريبي استنساخه، وبالتالي السماح للتقييم أكثر دقة للآثار العلاجات اختبارها على عملية الانتعاش وظيفية.
وتقييم العديد من الدراسات الآثار زرع مجموعة متنوعة من الخلايا الجذعية في النماذج SCI 11. لقد عزل مؤخرا الكبار الخلايا الجذعية العصبية من المنطقة الفرعية البطيني (SVZ) بعد عدة ساعات من وفاة المتبرع الماوس 12-13. يوفر هذا الإجراء السكان من الخلايا الجذعية العصبية، ودعا تشريح الجثة السلائف العصبية (PM-الشخصيات)، والتي يبدو أن من المفيد في نهج الطب التجديدي لعلاج اصابات النخاع الشوكي. في هذه الورقة سوف نظهر: ط) بروتوكول لوصفها خلية مع التتبع PKH26 الحيوي، والثاني) في سورغالإجراء كال لأداء على الصدمة اصابات النخاع الشوكي، والثالث) في الوريد (IV) إدارة الخلايا المسمى. وعلاوة على ذلك، في هذا العمل نظهر أن الخلايا المزروعة تهاجر إلى العمود الفقري مواقع الآفة الحبل وتفرق معظمهم في أنيبيب المرتبطة بروتين (MAP) 2 خلايا إيجابية. وعلاوة على ذلك، ويرافق التفريق من قبل تعزيز انتعاش مستقر في وظيفة هند أطرافهم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وقد وافق جميع الإجراءات من قبل لجنة المراجعة من جامعة ميلان والتقى المبادئ التوجيهية الإيطالية لحيوانات المختبر في الامتثال مع المجتمعات التوجيه الأوروبي بتاريخ نوفمبر 1986 (86/609 / EEC): ملاحظة.
1. إعداد الخلايا لزرع
ملاحظة: استخدام الخلايا الجذعية العصبية بين 5 و مرور 9 في الثقافة لهذه التجارب. اختبار لانتشار الثقافات والقدرة التمايز قبل أن المسمى للزرع. تحديد مدى التمايز التي كتبها مناعية 12.
- Resuspend الخلايا إلى تركيز من 1 × 10 6 خلية / 150 ميكرولتر (زرع 1 × 10 6 خلايا في الماوس). إعداد لا يقل عن 1.2 × 10 6 خلايا في الماوس لأن وجود فائض من خلايا مطلوب لأغراض حقنة التحميل.
- غسل الخلايا 3 مرات باستخدام الخلايا الجذعية العصبية المتوسطة 13 في 10 مل قارورة المخروطية. في كلخطوة الغسيل، وخلايا متهور من قبل الطرد المركزي (500 x ج لمدة 5 دقائق، RT).
- عد الخلايا قبل تدور النهائي.
- أجهزة الطرد المركزي الخلايا (500 x ج لمدة 5 دقائق)، ثم نضح طاف، والحرص على عدم إزالة أي خلايا لكنه ترك ما لا يزيد عن 25 ميكرولتر من طاف.
- إعداد تعليق خلية 2X بإضافة 1 مل من مخفف C إلى الخلية بيليه و resuspend مع pipetting لطيف.
- مباشرة قبل تلطيخ، وإعداد محلول صبغة 2X (4 × 10-6 M) في مخفف C بإضافة 4 ميكرولتر من PKH26 حل الإيثانول صبغ إلى 1 مل من مخفف C في أنبوب وتخلط جيدا لتفريق.
- بسرعة إضافة 1 مل من تعليق خلية 2X إلى 1 مل من محلول صبغة 2X وخلط فورا العينة من قبل pipetting (كثافة الخلية النهائية ستكون 1.2 × 10 7 خلية / مل و 2 × 10-6 M PKH26).
- احتضان تعليق خلية / صبغ لمدة 1-5 دقيقة.
- وقف تلطيخ بإضافة حجم مساو (2مل) من 1٪ محلول BSA في HBSS واحتضان لمدة 1 دقيقة.
- خلايا الطرد المركزي (500 x ج لمدة 10 دقيقة) وإزالة بعناية طاف.
- بيليه الخلية resuspend في 10 مل من HBSS وأجهزة الطرد المركزي (500 x ج لمدة 5 دقائق).
- غسل بيليه الخلية 2 مرات أكثر مع 10 مل من المتوسط الكامل لضمان إزالة الصبغة غير منضم.
- resuspend الكرية خلية في 10 مل من المتوسط الكامل لتقييم الانتعاش الخلية، وبقاء الخلية وكثافة مضان. إذا كانت هناك حاجة لزرع خلايا، وغسل و resuspend لهم في حل الفسيولوجية العقيمة بتركيز 3.3 × 10 5 خلايا / 50 ميكرولتر.
2. إعداد لجراحة
- معدات جراحة نظيفة وتعقيم.
- اعداد منطقة الجراحة بواسطة المسح مع وكيل العقيم. إعداد الجهاز IH المتصادم.
- إعداد المعدات التخدير: والزبال الغاز نشطة مع VetScav تصفية (فلترة) زنها الأجهزة، تدفق مستمر التعريفي غرفة، الأكسجين جينRATOR، انخفاض تدفق O 2 متر عن الفئران. تنظيف غرفة تحريض وقناع استخدمت خلال عملية جراحية.
- تخدير الحيوانات مع 2.5٪ (ت / ت) الأيزوفلورين في الأكسجين (1 لتر / دقيقة)، وانتظر 5 دقائق بعد تحريض تدفق للدواء نافذة المفعول. معرفة ما اذا كان شعيرات والوخز أو إذا كان هناك بطء هند انسحاب الطرف ردا على معسر قاطع الطريق. أثناء الجراحة، والحد من تركيز الأيزوفلورين إلى 2.0٪ (ت / ت) الأيزوفلورين في الأكسجين (1 لتر / دقيقة).
3. إعداد الفئران لجراحة وزرع
- الحفاظ على الذكور البالغين CD1 الفئران (25-30 ز) لمدة 3 أيام على الأقل قبل التجارب في الظروف القياسية (22 ± 2 ° C، الرطوبة 65٪، والضوء الاصطناعي بين 8:00 حتي 8:00).
ملاحظة: إن الإجراء بأكمله من إعداد جراحية لخياطة يستغرق حوالي 40 دقيقة.- للتعرف على الحيوانات، بمناسبة الذيل بواسطة الحبر الملون مقاومة للماء.
- استخدام إلكترونياتجيم المقص لقطع الشعر الظهرية من الفأرة من الرقبة، وحول على مستوى T2، إلى منطقة أسفل الظهر.
- تعقيم المنطقة مستعدة بمحلول يوديد والإيثانول (70٪ في الماء المعقم).
- علاج الحيوان مع حقن الجلدي الفرعي (الشوري) 200 ميكرولتر الجنتاميسين (1 ملغ / مل في محلول ملحي معقم).
- تطبيق مواد التشحيم العيون لكلتا العينين الحيوان لمنع جفاف وحقن البوبرينورفين (تحت الجلد، 0.03 ملغ / كلغ) لتخفيف الألم.
4. استئصال الصفيحه
- ضع الماوس على أكثر دفئا الشريحة لتجنب مشكلة انخفاض حرارة الجسم أثناء الجراحة. ضع الحيوان مع الجانب الظهري تصل.
- جعل شق عمودي مع مشرط على المنطقة من الفائدة، من T7 إلى T12.
- عقد الجلد وسطحية سادة الدهون باستخدام ملقط القياسية (وعادة ما توجد في الفضاء بين ال 5 و ال 6 عمليات الظهرية الصدرية).
- عد عملية تحت السفينة كما T6ثم الانتقال إلى T7.
- ضع لها تأثير ضئيل تحت الجانب البطني من الماوس لزيادة انحناء العمود الفقري. لشل حركة الحبل الشوكي من خلال منع ذلك مع ملقط غريف.
- قطع عضلات مجاورة للفقرة ثنائيا من T7 وT10 مستوى الفقري باستخدام مشرط حتى السطح الظهري للاتصالات الصفيحة طرف مشرط.
- استخدام مشرط لوضع علامة قبالة مفترق من T7 حتى T10. وقف في الفضاء بين T8 وT9 نتوءات شائك. قطع الأنسجة بين T8-T9 وT9-T10 مع المقص الصغير.
- استخدام مقراض لإزالة عملية T9. فضح تقاطع طريق كشط بعناية بعيدا طبقة العضلات مع المقص الصغير. تستمر حتى يتعرض العظام.
- استخدام ملقط لإزالة العضلات من الصفيحة وفتح مساحة صغيرة بين الفقرات. إدراج بلطف المقص الصغير تحت العظم، وقطع الصفيحة في كلا الجانبين وإزالة هذا الجزء بالملقط.
- إزالة الصفيحة مع وorceps لفضح الحبل. تأكد من عدم ترك أي شظايا العظام مجانا أو خشنة وراءها؛ إزالتها مع مقراض.
- استخدام ملقط غيض صغيرة لإزالة السمحاق، فضلا عن أي شظايا العظام أو العضلات التي قد تكون بالقرب من شق.
- إزالة النصف العلوي من عملية الظهرية T9، والشروع في بروتوكول جهاز IH المتصادم.
5. بروتوكول جهاز IH المتصادم (كدمة)
- ضع الماوس في وسط منصة استقرار الجهاز IH المتصادم.
- منع الحيوان مع اثنين من أسنانه ملقط على اتصال مع منصة لتحقيق الاستقرار من قبل اثنين من المواقع مشترك الأسلحة (الذراع الأيسر للفقرة الصدرية، الذراع اليمنى للفقرة الرقبية).
- استخدام الذراع منقاري لفهم الحافة الجانبية من الجسم الفقري منقاري (T8).
- التلاعب الذراع الذيلية بنفس الطريقة لفهم الجسم الفقري T10.
- وضع منصة لتحقيق الاستقرار في الجهاز وخفض الحافة (قطر 0.75مم) أقرب إلى الحبل ممكن دون لمسها.
- رفع طرف ثلاث لفات كاملة قبل الشروع في التأثير.
- أداء كدمة مع المسبار المقرر أن يلقي قوة من 60 kdyn في 100 ملم / ثانية.
6. الغرز والرعاية في مرحلة ما بعد
- خياطة شق مع 4/0 امتصاص خيوط الجروح. تغطية الحبل الشوكي يتعرض في موقع الصفيحة إزالتها؛ خياطة الأنسجة في الحدود القصوى من قطع عن طريق إبرة صغيرة. وضع غرز اثنين على الفور فوق وتحت موقع التعرض الحبل الشوكي.
- إغلاق الجلد باستخدام اثنين أو ثلاثة مقاطع رد الفعل دون معسر قبالة عضلات الكامنة.
- هيدرات الماوس ما بعد الجراحة مع 2 مل من محلول ملحي تحت الجلد حقن في أسفل الظهر.
- ضع الماوس مرة أخرى في قفص قبل تحسنت لتجنب انخفاض حرارة الجسم أثناء الشفاء الجراحي. مكان أقفاص على منصات التدفئة.
- مراقبة الفئران أثناء المرحلة الحادة بعد التعرض للإصابة عن طريق التحقق منحجم المثانة، وخياطة ووزن الحيوان مرتين في اليوم. الضغط بلطف المثانة (مرتين في اليوم لمدة 7 أيام) لتجنب التهابات المسالك البولية في (البول يمكن أن يكون غائم، دموية أو تحتوي على أي رواسب).
- علاج الفئران مرة واحدة في اليوم مع حقن محلول ملحي (2 مل لمدة يومين بعد الجراحة حقن الشوري) والمضادات الحيوية (الجنتاميسين 0.2 مل، SC الحقن) لمدة خمسة أيام بعد الإصابة.
- علاج الفئران لتسكين الألم بعد العمليات الجراحية مع البوبرينورفين (0.1 ملغ / كغ، مرتين في اليوم) لمدة 3 أيام بعد الإصابة.
7. الذيل الوريد حقن الخلايا
ملاحظة: في الخطوة التالية ويتجلى هذا الإجراء لحقن الخلايا في الوريد الذيل. يمكن أن تدار خلايا أيضا مع زرع داخل النخاع باستخدام إطار التجسيمي 15-16، أو في صهريج ماجنا 17. من المهم أن نعتبر أن أنواع الخلايا الأخرى يمكن زرعها مع هذا الأسلوب، مثل الخلايا اللحمية الوسيطة(على سبيل المثال، ونخاع العظام الخلايا الجذعية الوسيطة، الدهنية المشتقة الخلايا الجذعية وخلايا السائل الذي يحيط بالجنين). وعلاوة على ذلك، وخيارات العلاج الأخرى مثل الجسيمات النانوية يمكن حقن عن طريق الوريد الذيل بعد إصابة الحبل الشوكي.
- استخدام الايثانول 70٪ وPBS لتنظيف إبرة قبل الاستخدام. التعامل مع إبرة وحقنة فقط مع قفازات معقمة.
- Resuspend الخلايا في أنبوب اختبار وتحميل 75 ميكرولتر من الخلايا في 0.3 مل حقنة (29 G إبرة و 0.33 سم مكعب حقنة).
- تأكد من أن عدم وجود فقاعات موجودة داخل الخلية تعليق. الحفاظ على حقنة في وضع أفقي لتجنب الترسيب الخلية.
- ضع الماوس تحت مصباح الحرارة لتمدد الأوردة الذيل.
- الاستيلاء على الماوس واسحبه برفق إلى رادع الماوس لتصور الوريد الذيل الأفقي على شكل خط أزرق ضيق.
- تنظيف الذيل مع مسحة الكحول. بمجرد تصور الوريد، والاستيلاء على الوريد الذيل بين الاصبع الوسطى والإبهام من اليد اليسرى.
- جلب الإبرة إلى السطح في 15 درجة زاوية من الأفق والتأكد من شطبة متروك.
- ضخ 50 ميكرولتر من الخلايا بمعدل 0.33 ميكرولتر / ثانية. بعد الحقن، وتأخير التراجع من الإبرة بنسبة 10 ثانية. التراجع عن إبرة ببطء وإيلاء الاهتمام لهروب رأس المال ممكن من التعليق الخلية.
- تنظيف حقنة كما في الخطوة 7.1 بين الأحمال.
8. الاختبارات السلوكية وهند الاطراف وظيفة
- ضع الماوس في حقل مفتوح.
- تقييم وظيفة الحركي والانتعاش أطرافهم هند بعد كدمة مع اختبار حقل مفتوح وفقا للجدول الماوس باسو (BMS) 18.
ملاحظة: وظيفة العصبية يجب تقييم دوري، من يوم 3 بعد الاصابة لمدة 4 أسابيع 18.
9. الإرواء
- في نهاية الفترة التجريبية، وتخدير الحيوانات عن طريق الحقن داخل الصفاق من بنتوباربيتال الصوديوم (65 ملغ / كلغ). استخدام القرصات أخمص القدمين إلى evaluatالبريد مستوى التخدير والمضي قدما إلا بعد الماوس لا يستجيب للمؤثرات الضارة.
- كبح جماح الحيوان في موقف ضعيف على متن طائرة الجراحة.
- قطع طريق إهاب وجدار البطن فقط تحت القفص الصدري. فصل الحجاب الحاجز من الكبد.
- استخدام مقص لقطع الحجاب الحاجز لفضح التجويف الجنبي.
- قطع جانبي القفص الصدري حتى عظام الترقوة.
- استخدام المرقأة لكبح الغضروف الخنجري ووضع مرقئ على رأسه.
- عقد الثلث الاخير من القلب على متن طائرة مستعرضة مع ملقط. ادخال الإبرة في البطين الأيسر.
- استخدام مرقئ لكبح القلب. هذا يضمن الإبرة ويمنع التسرب.
- استخدام مقص لقطع الأذين الأيمن.
- السماح للPBS لضخ (18 مل / دقيقة) من خلال الحيوان. يحافظوا على هذا الضغط طوال فترة عازلة ضخ (3-4 دقيقة، المقابلة لنحو 70 مل PBS). تستمر حتى قلب نظيف.
- تبديل محبس للسماح تثبيتي (4٪ لامتصاص العرق في الماء المقطر، 4٪ PFA) من خلال مضخة. السماح للPFA 4٪ إلى ضخ من خلال الحيوان لحوالي 8-10 دقائق (300 مل). تدريجيا زيادة الضغط من أجل التوصل إلى الحد الأقصى من 30 مل / دقيقة. والكبد تصلب هو أفضل مؤشر على وجود نضح ناجحة.
10. الأنسجة جمع وتجهيز، علم الأنسجة وIimmunohistochemistry
- تشريح النخاع الشوكي من T5 لL1. ثم بعد إصلاح الأنسجة في 6 مل في 4٪ PFA (O / N عند 4 درجة مئوية).
- وضع الأنسجة نفسها في حل 30٪ سكروز لمدة 72 ساعة في 4 درجات مئوية من أجل البرد حمايته ومنع تشكيل بلورات أثناء التجميد.
- تجميد سريعة الحبل باستخدام الثلج الجاف وتخزينها في -80 ° C.
- القسم عن طريق ناظم البرد مع 15 ميكرون سمك وجمع الفروع على الشرائح الزجاجية ويستمر لمدة مناعية.
- شطف المقاطع مع 200 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني لكل الصورةLIDE (3 مرات؛ 5 دقائق لكل منهما، RT).
- Permeabilize كل شريحة مع 200 ميكرولتر من 10٪ NGS و 0.2٪ تريتون X-100 في برنامج تلفزيوني لمدة 1 ساعة على RT.
- شطف المقاطع مع 200 ميكرولتر من PBS لكل شريحة (3 مرات؛ 5 دقائق لكل منهما، RT).
- حجب المواقع غير محددة مع 200 ميكرولتر من عرقلة الحل لشريحة (5٪ NGS؛ 0.1٪ تريتون X-100 في برنامج تلفزيوني) لمدة 30 دقيقة (RT).
- احتضان كل شريحة مع 200 ميكرولتر من الأجسام المضادة الأولية O / N عند 4 ° C (تمييع الأجسام المضادة في 5٪ NGS؛ 0.1٪ تريتون X-100 في برنامج تلفزيوني).
- غسل أقسام مع 200 ميكرولتر من PBS لكل شريحة (3 مرات؛ 5 دقائق لكل منهما؛ RT).
- احتضان مع الأجسام المضادة الثانوية المناسبة لمدة 2 ساعة على RT.
- غسل أقسام مع 200 ميكرولتر من PBS لكل شريحة (3 مرات؛ 5 دقائق لكل منهما؛ RT).
- نوى وصمة عار مع 200 ميكرولتر من 4، 6-diamidin-2-phenilindole (دابي) (1 ميكروغرام / مل تركيز النهائي، و 10 دقيقة في RT).
- جبل باستخدام FluorSave الكاشف وتحليل بواسطة المجهر متحد البؤر.
ملاحظة: فيقرارات السيطرة، والأجسام المضادة الأولية يجب حذف واستبدالها مع تركيزات ما يعادل مفتش لا علاقة لها من نفس فئة فرعية. وقد استخدم المرتبط أنيبيب البروتين 2 الأجسام المضادة الأولية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
العدد الكلي للخلايا المزروعة هو 1 × 10 6 خلايا وقسمت إلى ثلاث حقن متتالية في الوريد الذيل. نحن تدار 3.3 × 10 5 خلايا في 50 ميكرولتر من حل العازلة الفوسفات (PBS). تم إجراء الحقن الأولى في غضون 30 دقيقة بعد الإصابة، في وقت لاحق 6 ساعة الثانية والساعة ال 18 الماضية بعد الآفة. تم تحديد اختيار مهلة 18 ساعة بعد اصابات النخاع الشوكي لإدارة PM-الشخصيات التي نفاذية المثلى من حاجز الدم في الدماغ في هذا الوقت 14. لتقييم تأثير الخلايا الجذعية حقن أنه سيكون من المفيد أن يكون الإيجابية laminectomies السيطرة الحيوانات (ن = 14) وPBS حقن الحيوانات كعنصر تحكم السلبية (ن = 14).
PM-الشخصيات تحسين استرداد هند الاطراف وظيفة، الهجرة إلى الموقع الآفة والتفريق في 2 MAP خلايا إيجابية
تسبب كدمة T9 خسارة عابرة من وظيفة هند أطرافهم تليها ز التدريجيانتعاش radual (الشكل 1). في غضون 2-3 أسابيع، تحسنت PBS المعاملة الفئران المصابين وصلت ظيفة هند أطرافهم 3 نقاط من BMS (الموافق وضع أخمصي من مخلب مع أو بدون دعم الوزن أو في بعض الأحيان، متكررة، أو يتفق الظهرية خطوة، ولكن لا يخطو أخمصي 18) . بدلا من ذلك، في نفس الفترة الرصد، وأظهرت الفئران المصابين عولجوا PM-الشخصيات انتعاش العالي، حيث بلغ 4.5 نقطة من BMS (الموافق متكرر أو ثابت أخمصي خطوة دون تنسيق أو أخمصي بشكل متكرر أو ثابت الخطو مع بعض التنسيق). كان التحسن السلوكي واضحا بشكل خاص في الفترة ما بين يوم 7 ويوم 14 بعد اصابات النخاع الشوكي. لم تسجل أية علامات تشبه آلام جلدية forelimb حساسية فرط 19 في أي وقت في أي المجموعة التجريبية خلال فترة الرصد من 30 يوما.
الأكثر المغروسة PM-الشخصيات، وصفت مع PKH26 (الشكل 2)، التي تراكمت على حوافالآفة تشكيل مجموعات (الشكل 3) منذ الأيام الأولى من إدارتها. ثم هاجرت الخلايا المزروعة على طول حواف الآفة وبطريقة اكثر انتشارا حيث أنها متباينة، على افتراض تدريجيا التشكل الخلوي غير متماثل من الخلايا العصبية. في 30 يوما بعد الآفة وزراعة الأعضاء، وزيادة خلايا الجسم من PM-الشخصيات في الحجم ومعظم الخلايا الجذعية العمليات مثل كان واضحا وimmunostained بالكامل من قبل الأجسام المضادة المحددة لخطة عمل البحر المتوسط 2 (الشكل 4). تحقيق التعقيد الصرفي والإيجابية لMAP2 من قبل زرعها PM-الشخصيات غير المحتمل أن لا يعود إلى الانصهار مع الباقين على قيد الحياة المضيف الخلايا العصبية في النخاع الشوكي، وهو ما يتضح في التشكل متباينة بشكل واضح وغياب نواتين في أي خلية وصفت واحدة.
الشكل 1. PM-الشخصيات تحسين recov الوظيفيوكان ريها في الحيوانات المصابة وتنقل حقل مفتوح الاختبار المستخدمة لتحديد محرك استرداد وظيفة 18. تم اختبار الحيوانات قبل يوم من كدمة وسجل 9 نقاط في نطاق BMS. على أول إصابة آخر يوم في الحيوانات lesioned، انخفضت درجة BMS إلى الصفر. أظهر انتعاش هند وظيفة أطرافهم من الفئران lesioned تحسنا ملحوظا دائم وطويل عندما تم علاج الحيوانات مع PM-الشخصيات. تم إجراء التحليل في مزدوجة الأعمى، وتتألف كل مجموعة من 14 الحيوانات. القيم تمثل متوسط ± SEM. نحن مصممون على فروق ذات دلالة إحصائية عن طريق اختبار ANOVA تليها مرحلة ما بعد اختبار توكي. *** P <0.001. ** P <0.01 مقابل PBS.
الشكل 2. PKH26 وسم PM-الشخصيات. وبعد إجراء وضع العلامات مع PKH26، PMNPCS هي VISU alized مع المجهر الصورة الحية EVOS فلوريدا ونقل صورة مجهرية مع نفس الأداة (مقياس بار = 50 ميكرون). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3. توطين PM-الشخصيات في موقع الآفة. هي موجودة في جميع أنحاء حواف موقع الآفة في 30 أيام بعد الحقن الرابع من PKH26 المسمى PM-الشخصيات (الحمراء). صورة ممثلة لل1 الماوس، ولكن تم الحصول على صور مماثلة لا يقل عن 5 الحيوانات (مقياس بار = 50 ميكرون). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
تحميل / 52141 / 52141fig4highres.jpg "/>
الشكل 4. MAP2 التعبير في زرع PM-الشخصيات. معظم PKH26 المسمى PM-الشخصيات (الحمراء) حصلت على شكل تشبه الخلايا العصبية مع العمليات الشبيهة شجيري وكان قد تختلف MAP-2 خلايا إيجابية (الخضراء). هي ملطخة نوى في الزرقاء (دابي). صورة ممثلة لل1 الماوس، ولكن تم الحصول على صور مماثلة لا يقل عن 5 الحيوانات (مقياس بار = 25 ميكرون). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في هذه الورقة وصفنا طريقة للحصول على نموذج استنساخه من إصابات في النخاع الشوكي باستخدام المتصادم الأفق اللانهائي في قوة من 70 kdyne (شديد). باستخدام نموذج قوة أكبر (80 kdyne)، ونحن يمكن أن يسبب إصابة أكثر الشديدة التي للأسف يرتبط معدل وفيات الفئران أعلى. من أجل تجنب هذه المشكلة، ونحن عادة اختيار نموذج قوة معتدلة (70 kdyne) مقترن لآفة للتكرار مع الانتعاش التدريجي من وظيفة وفيات أقل. لإنتاج مثل هذه الإصابة مستقرة من المهم جدا أن تولي اهتماما خاصا لتثبيت الصحيح للحيوان على منصة المسبار. على وجه الخصوص يجب أن تتركز الحبل الشوكي في الطرف المسبار، ويجب أن يكون ذراعي المسبار موازية لبعضها البعض. وعلاوة على ذلك، يجب أخذ الانتباه في عرقلة الحيوان مع ملقط المسبار، عندما فقرات يمكن سحق ويمكن أن تلف سلك كتبها نصائح من ملقط. المواقع من أنيمال بعد الثقب أمر بالغ الأهمية، والتعامل مع الحيوانات أثناء هذا الإجراء هو أيضا مهم جدا. كما يجب إيلاء اهتمام خاص لإجراء الثقب، والتي يجب دائما أن يؤديها في نفس الموقع ونفس التمديد. عندما يتم تنفيذ هذه الإجراءات خلال الثقب، مسألة منهجية أخرى لمراقبة هي الحد من خطر إتلاف سلك عند استخدام المقص الصغير، مقراض، أو ملقط لقطع العظام وتحرير النخاع الشوكي من خلال إزالة الصفيحة، للقضاء على المتبقية نتوءات العظام الجانبية وشظايا، وإلى إزالة السمحاق. فإن استخدام مقص الصغيرة ومقراض مع نصائح مشيرا صعودا يقلل من خطر مواجهة المشاكل المذكورة أعلاه.
قيود هاما من هذه الطريقة هو احتمال كبير أن الحيوانات قد تتطور العدوى البولية الحادة الداخلية والخارجية في الفترة إصابة آخر. هو عدوى الخارجي ويرجع ذلك إلى عدم قدرة الفئران lesioned إلى moهاء مع هند أطرافهم الوزن الدعم. في المقابل، قد يكون سبب العدوى البولية داخلي بسبب عدم قدرة الفئران المصابة إلى التبول بشكل مستقل. من أجل تجنب هذه المشاكل فمن الضروري جدا لحقن الحيوانات مع المضادات الحيوية المشار إليها والتحقق من حجم المثانة مرتين في اليوم خلال إجراءات رعاية الحيوان من الأسبوع الأول. يجب أن يتم التحقق من حالة ترطيب والوزن بعناية خلال الأسابيع الثلاثة الأولى بعد lesioning.
تطبيق الإجراءات الموضحة تمكنا من الحصول العجز استنساخه وظيفة هند أطرافهم التي تم تقييمها من خلال اختبار السلوكية المحددة التي وضعتها باسو وزملاؤه (BMS) 18. مباشرة بعد الإصابة فقدان أطرافهم الخلفية وظيفة كاملة، والتي تبعتها الانتعاش التدريجي وهذا هو الاهم خلال الأسابيع الأولى 2-3. بلغ الانتعاش السلوكي مستوى أعلى عندما عولجت فئران lesioned مع الكبار PM-الشخصيات (الشكل 1 (الشكل 3). قدرنا أن العدد الإجمالي للحيوية المطعمة PM-الشخصيات أكبر من المجالس الاقتصادية والاجتماعية المطعمة وNSCs الكبار كما سبق وذكرت من قبل مجموعة بحثنا 20-21. في أربعة أسابيع بعد lesioning وزراعة الأعضاء، ومعظم PM-الشخصيات أجسام أكبر حجما وتمتلك امتدت عمليات شبيهة شجيري التي immunostained بالكامل من قبل الأجسام المضادة المحددة لخطة عمل البحر المتوسط 2 (الشكل 4).
والميزة الرئيسية لهذا النموذج من إصابات في النخاع الشوكي هي توحيد للإصابة. ويتحقق أيضا منحنى ذات الصلة الوقت استنساخه من الانتعاش هند أطرافهم وظيفة. هذا استنساخ يجعل من الممكن تحديد إثبات صحة المبدأ الدراسات لعلاج التحقيق بما في ذلك زرع الخلايا للطب التجديدي التراث الحضارىالصورة مع عدد محدود من الحالات. وبالإضافة إلى ذلك، هناك عدة جوانب الفيزيولوجيا المرضية لإصابة الحبل الشوكي يمكن تحليلها بمزيد من التفصيل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب تعلن أي مصلحة مالية المتنافسة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PKH26GL-1KT | Sigma | 091M0973 | |
| Infinite horizon (IH) Impactor device | Precision Systems and Instrumentation, LLC | Model 0400 Serial 0171 | |
| Gentamycin 10 mg/ml | Euroclone | ECM0011B | 1 mg/ml in sterile saline solution |
| Isoflurane-Vet 250 ml | Merial | B142J12A | |
| Blefarolin POM OFT 10 g | |||
| Slide Warmer | 2Biological Instruments | HB101-sm-402 | |
| Scalpel, size 10 | Lance Paragon | 26920 | |
| Small Graefe Forceps | 2Biological Instruments | 11023-14 | |
| Rongeur | Medicon Instruments | 07 60 07 | |
| Micro scissors | 2Biological Instruments | 15000-00 | |
| Absorbable sutures (4/0) | Safil Quick | C0046203 | |
| Hemostat | 2Biological Instruments | 13014-14 | |
| Reflex 7 wound clip applicator | 2Biological Instruments | 12031-07 | |
| 7 mm Reflex wound clips | 2Biological Instruments | 12032-07 | |
| NGS | Euroclone | ECS0200D | |
| Triton X 100 | Merck Millipore | 1086431000 | |
| Anti Microtubule Assocoated Protein (MAP) 2 | Millipore | AB5622 | |
| Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11008 | |
| FluorSave Reagent | Calbiochem | 345789 | |
| Neural stem cells medium | DMEM-F12 medium (Euroclone) containing 2 mm l-glutamine (Euroclone), 0.6% glucose (Sigma-Aldrich), 9.6 gm/ml putrescine (Sigma-Aldrich), 6.3 ng/ml progesterone (Sigma-Aldrich), 5.2 ng/ml sodium selenite (Sigma-Aldrich), 0.025 mg/ml insulin (Sigma-Aldrich), 0.1 mg/ml transferrin (Sigma-Aldrich), and 2 μg/ml heparin (sodium salt, grade II; Sigma-Aldrich), bFGF (human recombinant, 10 ng/ml; Life Technologies) and EGF (human recombinant, 20 ng/ml; Life Technologies) | ||
| DMEM-F12 | Euroclone | ASM5002 | |
| l-glutamine | Euroclone | ECB3000D | |
| glucose | Sigma-Aldrich | G8270-100G | |
| putrescine | Sigma-Aldrich | P5780-25G | |
| progesterone | Sigma-Aldrich | P6149-1MG | |
| Sodium-selenite | Sigma-Aldrich | S9133-1MG | |
| transferrin | Sigma-Aldrich | T 5391 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I1882 | |
| Heparin sodium-salt | Sigma-Aldrich | H0200000 | |
| bFGF | Life Technology | PHG0024 | |
| h-EGF | Life Technology | PHG6045 | |
| Syringe 0.33 cc 29 G | Terumo | MYJECTOR | |
| buprenorphine | Schering Plough SpA | TEMGESIC | |
| eye gel | Bausch & Lomb | LIPOSIC |
References
- Cord Injury Statistical Center: spinal cord injury facts and figures at glance. , https://www.nscisc.uab.edu/PublicDocuments/fact_figures_docs/Facts%202013.pdf (2013).
- Yip, P. K., Malaspina, A. Spinal cord trauma and the molecular point of no return. Molecular Neurodegeneration. 7, 6 (2012).
- Fehlings, M. G., Cadotte, D. W., Fehlings, L. N. A series of systematic reviews on the treatment of acute spinal cord injury: a foundation for best medical practice. J Neurotrauma. 28 (8), 1329-1333 (2011).
- Furlan, J. C., Noonan, V., Cadotte, D. W., Fehlings, M. G. Timing of decompressive surgery of spinal cord after traumatic spinal cord injury: an evidence-based examination of pre-clinical and clinical studies. J Neurotrauma. 28 (8), 1371-1399 (2011).
- Sekhon, L. H., Fehlings, M. G. Epidemiology, demographics, and pathophysiology of acute spinal cord injury. Spine. 26 (24), 2-12 (2001).
- Gorio, A., et al. Recombinant human erythropoietin counteracts secondary injury and markedly enhances neurological recovery from experimental spinal cord trauma. Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (14), 9450-9455 (2002).
- Windle, W. F., Clemente, C. D., Chambers, W. W. Inhibition of formation of a glial barrier as a means of permitting a peripheral nerve to grow into the brain. J Comp Neurol. 96 (2), 359-369 (1952).
- Young, W. Spinal cord contusion models. Prog Brain Res. 137, 231-255 (2002).
- Stokes, B. T., Noyes, D. H., Behrmann, D. L. An electromechanical spinal injury device with dynamic sensitivity. J Neurotrauma. 9 (3), 187-195 (1992).
- Jakeman, L. B., et al. Traumatic spinal cord injury produced controlled contusion in mouse. J Neurotrauma. 17 (4), 299-319 (2000).
- Sahni, V., Kessler, J. A. Stem cell therapies for spinal cord injury. Nat Rev Neurol. 6, 363-372 (2010).
- Marfia, G., et al. Adult neural precursors isolated from post mortem brain yield mostly neurons: an erythropoietin-dependent process. Neurobiol Dis. 43 (1), 86-98 (2011).
- Gritti, A., et al. Multipotent neural stem cells reside into the rostral extension and olfactory bulb of adult rodents. J Neurosci. 22 (2), 437-445 (2002).
- Whetstone, W. D., Hsu, J. Y., Eisenberg, M., Werb, Z., Noble-Haeusslein, L. J. J Neurosci Res. 74 (2), 227-239 (2003).
- Gonzalez-Lara, L. E., et al. The use of cellular magnetic resonance imaging to track the fate of iron-labeled multipotent stromal cells after direct transplantation in a mouse model of spinal cord injury. Mol Imaging Biol. 13 (4), 702-711 (2010).
- Ottobrini, L., et al. Magnetic resonance imaging of stem cell transplantation in injured mouse spinal cord. Cell R4. 2 (3), e963 (2014).
- Janowwski, M., et al. Neurotransplantation in mice: The concorde-like position ensures minimal cell leakage and widespread distribution of cells transplanted into the cistern magna. Neuroscience Letter. 430 (2), 169-174 (2008).
- Basso, D. M., et al. Basso Mouse Scale for locomotion detects differences in recovery after spinal cord injury in five common mouse strains. J Neurotrauma. 23 (5), 635-659 (2006).
- Hofstetter, C. P., et al. Allodynia limits the usefulness of intraspinal neural stem cell grafts; directed differentiation improves outcome. Nat Neurosci. 8 (3), 346-353 (2005).
- Bottai, D., Madaschi, L., Di Giulio, A. M., Gorio, A. Viability-dependent promoting action of adult neural precursors in spinal cord injury. Mol. Med. 14 (9-10), 634-644 (2008).
- Bottai, D., et al. Embryonic stem cells promote motor recovery and affect inflammatorycell infiltration in spinal cord injured mice. Exp Neurol. 223 (2), 452-463 (2010).
