Summary
Lesión de la médula espinal es una condición traumática que causa morbilidad severa y alta mortalidad. En este trabajo se describe en detalle un modelo contusión de lesión de la médula espinal en ratones seguido de un trasplante de células madre neurales.
Abstract
Lesión de la médula espinal es una condición clínica devastadora, caracterizada por un complejo de disfunciones neurológicas. Los modelos animales de lesión de la médula espinal pueden ser utilizados tanto para investigar las respuestas biológicas a la lesión y para probar terapias potenciales. Contusión o compresión lesión entregado a la médula espinal expuesta quirúrgicamente son los modelos más utilizados de la patología. En este informe, la contusión experimental se lleva a cabo utilizando el dispositivo Impactor Infinito Horizon (IH), que permite la creación de un modelo animal de lesión reproducible través de la definición de los parámetros de lesión específica. El trasplante de células madre es considerada comúnmente una estrategia potencialmente útil para la curación de esta enfermedad debilitante. Numerosos estudios han evaluado los efectos de trasplante de una variedad de células madre. Aquí se demuestra un método adaptado para la lesión de la médula espinal seguida de la inyección de cola vena de células en ratones CD1. En resumen, ofrecemos procedimientos para: i) wi etiquetado celularº un trazador de vital importancia, ii) la atención pre-operatoria de los ratones, iii) la ejecución de una lesión de la médula espinal contundente, y iv) la administración intravenosa de post mortem precursores neuronales. Este modelo contusión puede ser utilizado para evaluar la eficacia y seguridad de trasplante de células madre en un enfoque de la medicina regenerativa.
Introduction
Una lesión de la médula espinal (SCI) es la lesión más común causada por traumatismos de alta energía como vehículos de motor accidentes, caídas, el deporte y la violencia 1. En grave SCI, la fuerza de la lesión destruye o daña el tejido neural, causando la pérdida repentina de la función neurológica. Traumático SCI se produce con frecuencia en adultos jóvenes de entre 10 y 40 años de edad. Afecta en gran medida la condición mental y física del paciente y causa enorme impacto económico para la sociedad 2. El enfoque de tratamiento en la fase aguda es a menudo limitada a una dosis alta de corticosteroides, la estabilización quirúrgica y descompresión a la posibilidad de atenuar daño adicional 3-4, pero las funciones de estos métodos en la recuperación del aparato locomotor después de SCI son aún controversial. Además de la pérdida de tejido agudo, la lesión traumática y la activación de mecanismos secundarios de degeneración causa la desmielinización y muerte de múltiples tipos de células 5-6. El grado de recuperación de la función puede dediez en proporción con la magnitud de la materia blanca escatimado en el sitio de la lesión 7.
Los modelos animales de SCI se pueden utilizar tanto para investigar las respuestas biológicas de los tejidos a la lesión y para probar posibles terapias. Por otra parte, un modelo animal útil de una patología humana no sólo tiene que reproducir algunos aspectos de esa condición, pero también debe ofrecer ventajas con respecto a la observación clínica directa y experimento. Los modelos más utilizados de lesión de la médula espinal implican contusión o compresión lesión entregado a la médula espinal expuesta quirúrgicamente 8. El desarrollo de una lesión por contusión peso soltar controlado representa un hito importante en la historia de la investigación de SCI. El centro de investigación de la médula espinal Universidad del Estado de Ohio ha perseguido el desafío tecnológico de un dispositivo que se puede utilizar para inducir una compresión particular de la médula espinal con los parámetros de impacto controlados por un ordenador 9. Este fue originalmente diseñado para el uso wiratas th; más tarde se modificó para aplicar a los ratones 10. Las ventajas de este tipo de enfoque son que la biomecánica del accidente se pueden estudiar más en profundidad y los parámetros de lesión se pueden definir de una manera más completa con el fin de obtener un modelo experimental reproducible, por lo tanto, permitiendo una evaluación más precisa de los efectos de Los tratamientos probados en el proceso de recuperación funcional.
Muchos estudios han evaluado los efectos de trasplante de una variedad de células madre en modelos SCI 11. Hemos aislado recientemente adultos neural de células madre a partir de la Sub-Zona ventricular (SVZ) varias horas después de la muerte del donante ratón 12-13. Este procedimiento proporciona una población de células madre neuronales, llamado post mortem precursores neurales (PM-NPC), que parecen ser ventajoso en un enfoque de la medicina regenerativa para curar SCI. En este artículo vamos a demostrar: i) el protocolo para el etiquetado de células con el PKH26 trazador vitales, ii) la cirugiCal procedimiento para llevar a cabo en SCI traumática, y iii) la administración intravenosa (iv) la administración de células marcadas. Por otra parte, en este trabajo se demuestra que las células trasplantadas migran a sitios de lesión de la médula espinal y se diferencian principalmente en la proteína asociada a los microtúbulos (MAP) 2 células positivas. Además, la diferenciación está acompañado por la promoción de una recuperación estable de la función de la extremidad posterior.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOTA: Todos los procedimientos fueron aprobados por el Comité de Revisión de la Universidad de Milán y cumplen las directrices italiana para Animales de Laboratorio en el cumplimiento de la Directiva Europea Comunidades fechado en noviembre de 1986 (86/609 / CEE).
1. Preparación de las células para el trasplante
NOTA: Usar las células madre neuronales entre el quinto y el noveno pasaje en cultivo durante estos experimentos; probar las culturas para la proliferación y capacidad de diferenciación antes de ser etiquetados para el trasplante. Determinar el grado de diferenciación por inmunohisto 12.
- Resuspender las células a una concentración de 1 x 10 6 células / 150 l (trasplante de 1 x 10 6 células por ratón). Preparar al menos 1,2 x 10 6 células por ratón porque se requiere un exceso de células para los propósitos de la jeringa de carga.
- Lavar las células 3 veces con medio de células madre neurales 13 en una 10 ml frasco cónico. En cadaetapa de lavado, las células precipitado mediante centrifugación (500 xg durante 5 min, RT).
- Contar las células antes del centrifugado final.
- Centrifugar las células (500 xg durante 5 minutos), y luego aspirar el sobrenadante, teniendo cuidado de no eliminar cualquier célula pero no dejando más de 25 l de sobrenadante.
- Preparar una suspensión celular 2x mediante la adición de 1 ml de Diluyente C al sedimento celular y resuspender con pipeteo suave.
- Inmediatamente antes de la tinción, preparar un colorante de la solución de 2x (4 x 10-6 M) en diluyente C mediante la adición de 4 l de la solución de colorante PKH26 etanol a 1 ml de Diluyente C en un tubo y mezclar bien para dispersar.
- Añadir rápidamente el 1 ml de suspensión celular 2x a 1 ml de 2x Solución colorante y mezclar inmediatamente la muestra con la pipeta (densidad celular final será 1,2 x 10 7 células / ml y 2 x 10-6 M PKH26).
- Incubar la suspensión de células / tinte de 1-5 min.
- Detener la tinción mediante la adición de un volumen igual (2ml) de solución de BSA 1% en HBSS y se incuba durante 1 min.
- Centrifugar las células (500 xg durante 10 minutos) y retire cuidadosamente el sobrenadante.
- Resuspender pellet de células en 10 ml de HBSS y se centrifuga (500 xg durante 5 min).
- Lavar el sedimento celular 2 veces más con 10 ml de medio completo para asegurar la eliminación de tinte no unido.
- Resuspender el sedimento celular en 10 ml de medio completo para la evaluación de la recuperación celular, viabilidad celular y la intensidad de fluorescencia. Si se necesitan las células para el trasplante, lavar y resuspender en una solución fisiológica estéril a una concentración de 3,3 x 10 5 células / 50 mL.
2. Preparación para la Cirugía
- Equipos de cirugía Limpiar y esterilizar.
- Prepare el área de la cirugía frotando con un agente aséptica. Configure el dispositivo IH impactador.
- Preparar el equipo de anestesia: el Scavenger Gas activa con VetScav pesaje de filtros de dispositivo, el flujo continuo Cámara de inducción, Gene oxígenorador, Bajo Flujo de O2 Meter para ratones. Limpie la cámara de inducción y de la máscara utilizada durante la cirugía.
- Anestesiar a los animales con 2,5% (v / v) isoflurano en oxígeno (1 L / min), y esperar 5 min después de la inducción de flujo para que el fármaco tenga efecto. Compruebe si los bigotes son contracciones o si hay retirada de las extremidades posteriores lento en respuesta a pellizcar la almohadilla plantar. Durante la cirugía, reducir la concentración de isoflurano al 2,0% (v / v) isoflurano en oxígeno (1 L / min).
3. Preparación de ratones de Cirugía y Trasplante
- Mantenga el macho adulto CD1 ratones (25-30 g) durante al menos 3 días antes de los experimentos en condiciones normales (22 ± 2 ° C, 65% de humedad, y la luz artificial de 08:00 am a 08:00 pm).
NOTA: Todo el procedimiento de preparación quirúrgica para suturar tomará alrededor de 40 minutos.- Para identificar el animal, marque la cola por medio de tinta de color resistente al agua.
- Utilice un electric maquinilla para cortar el pelo dorsal del ratón en el cuello, sobre a nivel T2, a la zona lumbar.
- Esterilizar el área preparada con una solución de yoduro y etanol (70% en agua estéril).
- Tratar al animal con una inyección subcutánea (sc) de 200 l de gentamicina (1 mg / ml en solución salina estéril).
- Aplicar lubricante oftálmica para ambos ojos de los animales para evitar la desecación e inyectar buprenorfina (por vía subcutánea, 0,03 mg / kg) para aliviar el dolor.
4. La laminectomía
- Coloque el ratón sobre un calentador de deslizamiento para evitar el problema de la hipotermia durante la cirugía. Coloque el animal con la cara dorsal hacia arriba.
- Hacer una incisión vertical con un bisturí sobre la región de interés, a partir de T7 a T12.
- Mantenga la piel y la almohadilla de grasa superficial mediante el uso de fórceps estándar (normalmente se encuentra en el espacio entre el 5 y 6 de los procesos dorsales torácicas).
- Cuente el proceso bajo el buque como T6luego pasar a T7.
- Coloque un poco de rodamiento bajo la parte ventral del ratón para aumentar la curvatura de la columna vertebral. Inmovilizar la médula espinal mediante el bloqueo con el fórceps Graefe.
- Cortar la musculatura paravertebral bilateral de T7 y el nivel vertebral T10 utilizando el bisturí hasta que la superficie dorsal de los contactos de lámina de la punta de bisturí.
- Utilice el bisturí para marcar la casilla de la unión de T7 hasta T10. Pare en el espacio entre T8 y T9 protuberancias espinosas. Cortar los tejidos entre T8-T9 y T9-T10 con las tijeras micro.
- Utilice la Rongeur para eliminar el proceso de T9. Exponga el cruce con cuidado raspar la capa muscular con las tijeras micro. Continúe hasta que se expone el hueso.
- Utilice las pinzas para eliminar los músculos de la lámina y abrir un pequeño espacio entre las vértebras. Introduzca suavemente las tijeras micro debajo del hueso, cortar la lámina en ambos lados y retirar esta parte con pinzas.
- Retire la lámina con la forceps para exponer el cable. Asegúrese de no dejar fragmentos óseos libres o irregulares detrás; eliminarlos con la Rongeur.
- Use las pequeñas pinzas de punta para eliminar el periostio, así como cualquier fragmentos de hueso o músculos que puede estar cerca de la incisión.
- Retire la mitad superior del proceso dorsal T9 y proceda con el protocolo de dispositivo IH impactador.
5. Protocolo de dispositivos IH Impactor (contusión)
- Coloque el ratón en el centro de la plataforma de la estabilización del dispositivo IH Impactor.
- Bloquear el animal con las dos pinzas de dientes conectados con la plataforma de estabilización por dos brazos de posicionamiento conjunta (brazo izquierdo de la vértebra torácica, el brazo derecho de la vértebra cervical).
- Utilice el brazo rostral de captar el borde lateral del cuerpo vertebral rostral (T8).
- Manipular el brazo caudal de la misma manera de entender el cuerpo vertebral T10.
- Coloque la plataforma de estabilización en el dispositivo y reducir la punta (diámetro 0,75mm) lo más cerca posible del cable como sea posible, pero sin tocarlo.
- Levante la punta tres vueltas completas antes de iniciar el impacto.
- Realice la contusión con el impactador fijado para suministrar una fuerza de 60 kdyn a 100 mm / seg.
6. Las suturas y Post-cuidado
- Suturar la incisión con una absorbible hilo de sutura 4/0. Cubrir la médula espinal expuesta en el sitio de la lámina retirada; suturar el tejido en los extremos de la corte por medio de una aguja pequeña. Poner los dos puntos de sutura inmediatamente por encima y por debajo del sitio de la exposición de la médula espinal.
- Cierre la piel con dos o tres clips Reflex sin pellizcando los músculos subyacentes.
- Hidratar el ratón después de la cirugía con 2 ml de solución salina por vía subcutánea inyectados en la espalda baja.
- Coloque el ratón de nuevo en una jaula pre-calentado para evitar la hipotermia durante la recuperación quirúrgica. Coloque las jaulas en almohadillas térmicas.
- Monitorear los ratones durante la fase aguda después de la lesión, marcando lavejiga tamaño, la sutura y el peso de los animales dos veces al día. Apriete suavemente la vejiga (dos veces al día durante 7 días) para evitar infecciones del tracto urinario (orina puede ser turbia, tiene sangre o que contenga cualquier precipitado).
- Tratar los ratones una vez al día con una inyección de solución salina (2 ml por dos días de inyección sc después de la cirugía) y antibióticos (gentamicina 0,2 ml; inyección sc) durante cinco días después de la lesión.
- Tratar los ratones para la analgesia postoperatoria con buprenorfina (0,1 mg / kg; dos veces al día) durante 3 días después de la lesión.
7. vena de la cola inyección de células
NOTA: En el siguiente paso se demuestra el procedimiento para la inyección de las células en la vena de la cola. Las células pueden ser también administrados con un trasplante de intraespinal mediante el uso de un marco estereotáxico 15-16, o en la cisterna magna 17. Es importante tener en cuenta que otros tipos de células podrían ser trasplantados con este método, tales como las células estromales mesenquimales(por ejemplo, células madre mesenquimales de la médula ósea, células madre derivadas de tejido adiposo, células de líquido amniótico). Además, otras opciones de tratamiento, tales como nanopartículas pueden inyectarse a través de la vena de la cola después de la lesión de la médula espinal.
- Utilice etanol al 70% y PBS para limpiar la aguja antes de su uso. Manejar la aguja y la jeringa solamente con guantes estériles.
- Resuspender las células en el tubo de ensayo y la carga de 75 l de células en una jeringuilla de 0,3 ml (29 G aguja y 0,33 cc jeringa).
- Asegúrese de que no hay burbujas en la suspensión celular. Mantener la jeringa en una posición horizontal para evitar la sedimentación de células.
- Coloca el ratón debajo de la lámpara de calor para dilatar las venas de la cola.
- Coge el ratón y tire de él en el limitador del ratón para visualizar la vena lateral de la cola como una línea azul estrecha.
- Limpie la cola con un algodón empapado en alcohol. Una vez que la vena se visualiza, agarra la vena de la cola entre el dedo medio y el pulgar de la mano izquierda.
- Lleve la aguja a la superficie en un ángulo de 15 ° desde el horizonte y asegúrese de que el bisel está para arriba.
- Inyectar 50 l de células a una velocidad de 0,33 l / seg. Después de la inyección, retrasar la retracción de la aguja por 10 seg. Retraer la aguja lentamente y prestar atención a la posible flujo de salida de la suspensión celular.
- Limpie la jeringa como en el paso 7.1 entre las cargas.
8. Pruebas de comportamiento y función de la extremidad posterior
- Coloque el ratón en el campo abierto.
- Evaluar la función locomotora y la recuperación de la extremidad posterior después de la contusión con la prueba de campo abierto según la escala del ratón Basso (BMS) 18.
NOTA: La función neurológica debe ser evaluado periódicamente, desde el día 3 después de la lesión durante 4 semanas 18.
9. perfusión
- Al final del periodo experimental, anestesiar a los animales con una inyección intraperitoneal de pentobarbital sódico (65 mg / kg). Utilice pellizcos del dedo del pie de evaluace el nivel de anestesia y proceder sólo después ratón no responde a los estímulos nocivos.
- Restringir el animal en posición supina sobre un plano de la cirugía.
- Cortar a través del tegumento y la pared abdominal justo debajo de la caja torácica. Separar el diafragma desde el hígado.
- Use las tijeras para cortar el diafragma para exponer la cavidad pleural.
- Cortar los lados de la caja torácica hasta que los huesos del cuello.
- Utilice las pinzas para sujetar el cartílago xifoides y coloque la pinza en la cabeza.
- Sostenga el tercio inferior del corazón en un plano transversal con las pinzas. Inserte la aguja en el ventrículo izquierdo.
- Use una pinza hemostática para sujetar el corazón. Esto asegura la aguja y evita las fugas.
- Use las tijeras para cortar la aurícula derecha.
- Permitir que el PBS a la bomba (18 ml / min) a través del animal. Mantener esta presión durante todo el período de infusión tampón (3-4 min; que corresponde a aproximadamente 70 ml de PBS). Continúe hasta que el corazón está limpio.
- Cambie la llave de paso para permitir que el fijador (paraformaldehído al 4% en agua destilada, 4% PFA) a través de la bomba. Permitir que el PFA 4% a la bomba a través del animal durante aproximadamente 8-10 min (300 ml). Poco a poco aumentar la presión para llegar a un máximo de 30 ml / min. Un hígado endurecido es la mejor indicación de una perfusión exitosa.
10. Recogida de tejidos y Procesamiento, Histología y Iimmunohistochemistry
- Diseccionar las médulas espinales de T5 a L1. Entonces después de fijar el tejido en 6 ml de PFA al 4% (O / N a 4 ° C).
- Ponga el mismo tejido en una solución con 30% de sacarosa durante 72 horas a 4 ° C con el fin de crio protegerlo y para prevenir la formación de cristales durante la congelación.
- Congelación rápida usando el cable de hielo seco y almacenarlo a -80 ° C.
- Sección por medio de un criostato con 15 micras de espesor y recoger las secciones en portaobjetos de vidrio y continuar para inmunocitoquímica.
- Enjuague secciones con 200 l de PBS para cada slide (3 veces; 5 minutos cada uno, RT).
- Permeabilizar cada portaobjetos con 200 l de 10% NGS y 0,2% de Triton X-100 en PBS durante 1 hora a RT.
- Enjuague secciones con 200 l de PBS para cada diapositiva (3 veces; 5 min cada uno, RT).
- Bloquear los sitios no específicos con 200 l de solución de bloqueo durante corredera (5% NGS; 0,1% Triton X-100 en PBS) durante 30 min (RT).
- Incubar cada portaobjetos con 200 l de anticuerpos primarios O / N a 4 ° C (diluir anticuerpos en 5% NGS; 0,1% Triton X-100 en PBS).
- Lávese las secciones con 200 l de PBS para cada diapositiva (3 veces, 5 minutos cada uno; RT).
- Incubar con anticuerpos secundarios apropiados durante 2 horas a RT.
- Lávese las secciones con 200 l de PBS para cada diapositiva (3 veces, 5 minutos cada uno; RT).
- Núcleos se tiñen con 200 l de 4 ', 6-diamidin-2-phenilindole (DAPI) (1 mg / ml de concentración final, 10 min a RT).
- Montar utilizando el Fluorsave Reactivo y analizar por microscopía confocal.
NOTA: Endeterminaciones de control, anticuerpos primarios deben suprimirse y reemplazarse con concentraciones equivalentes de IgG no relacionado de la misma subclase. Se utilizó proteína 2 de anticuerpos primaria asociada a los microtúbulos.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
El número total de células trasplantadas es 1 x 10 6 células y se dividió en tres inyecciones consecutivas en la vena de la cola. Se administraron 3,3 x 10 5 células en 50 l de solución tampón de fosfato (PBS). La primera inyección se realizó dentro de 30 min después de la lesión, el segundo 6 horas más tarde y el último 18 h después de la lesión. La elección de un plazo de 18 horas después de la lesión de la administración de PM-NPC se determinó por la permeabilidad óptima de la barrera hematoencefálica en este momento 14. Para evaluar el efecto de la inyección de células madre sería útil tener laminectomías de control de animales positivos (n = 14) y PBS inyectado animales como control negativo (n = 14).
PM-NPCs mejorar la recuperación de la función de la extremidad posterior, migran al sitio de la lesión y se diferencian en 2-PAM células positivas
La contusión T9 causó la pérdida transitoria de la función de las extremidades posteriores seguida de una progresiva grecuperación radual (Figura 1). Dentro de 2-3 semanas, los ratones lesionados tratados con PBS mejoraron y la función de las extremidades posteriores llegaron a 3 puntos de BMS (correspondiente a plantar colocación de la pata con o sin apoyo del peso o escalonamiento dorsal ocasional, frecuente o constante, pero no plantar pisar 18) . En cambio, en el mismo período de observación, los ratones lesionados tratados con PM-NPCs mostraron una recuperación mayor, alcanzando 4,5 puntos de BMS (correspondiente al frecuente o constante intensificación plantar sin coordinación, o plantar frecuente o constante caminar con cierta coordinación). La mejoría en el comportamiento fue particularmente evidente en el período comprendido entre el día 7 y el día 14 después de la lesión. No hay señales de la alodinia como miembro anterior hipersensibilidad 19 se registraron en cualquier momento en cualquier grupo experimental durante todo el período de observación de 30 días.
La mayoría implantada PM-NPCs, marcado con PKH26 (Figura 2), acumulada en los bordes de laformando racimos lesión (Figura 3) a partir de los primeros días de su administración. A continuación, las células trasplantadas migraron a lo largo de los bordes de la lesión y de una manera más difusa donde se diferencian, asumiendo gradualmente la conformación celular asimétrica de las neuronas. A los 30 días después de la lesión y el trasplante, el cuerpo celular de PM-NPCS aumentó en tamaño y en la mayoría de las células dendríticas procesos como fuera obvio y totalmente inmunotiñó por los anticuerpos específicos a la MAP-2 (Figura 4). El logro de la complejidad morfológica y la positividad para MAP2 por trasplantado PM-NPCs probable es que no se debe a la fusión con neuronas supervivientes de la médula espinal de acogida, lo cual es evidente en su morfología claramente diferenciado y la ausencia de dos núcleos en cualquier celda marcada sola.
Figura 1. PM-NPCs mejorar peración funcionalery en los animales lesionados. La locomoción campo abierto era la prueba empleada para la determinación de la recuperación de la función motora 18. Los animales se probaron el día antes de la contusión y anotó 9 puntos en la escala de BMS. En el primer día después de la lesión en los animales lesionados, la puntuación BMS redujo a cero. La recuperación de la función de las extremidades posteriores de los ratones lesionadas mostró una mejoría notable y duradera de largo cuando los animales fueron tratados con PM-NPCs. El análisis se realizó en doble ciego, y cada grupo estaba compuesto por 14 animales. Los valores representan la media ± SEM. Determinamos las diferencias estadísticas por medio de la prueba de ANOVA seguido de post-test de Tukey. *** P <0,001; ** P <0,01 vs PBS.
Figura 2. PKH26 etiquetado de PM-NPCS. Después procedimiento de marcaje con PKH26, PMNPCS son visu lizados con el microscopio de imagen en vivo EVOS fl y microfotografía fue tomada con el mismo instrumento (barra de escala = 50 micras). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Localización de PM-CPN en el sitio de la lesión. Marcado con PKH26 PM-CPN (rojo) están presentes a lo largo de los bordes de la zona de la lesión a los 30 días después de su inyección iv. La imagen puede no coincidir por 1 ratón, pero imágenes similares se obtuvieron durante al menos 5 animales (barra de escala = 50 micras). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
carga / 52141 / 52141fig4highres.jpg "/>
Figura 4. MAP2 expresión en trasplantado PM-NPCs. Marcado con PKH26 más PM-NPCs (rojo) adquirió una forma de tipo neuronal como con procesos dendríticas como ya había diferenciado MAP-2 células positivas (verde). Los núcleos se tiñen de azul (DAPI). La imagen puede no coincidir por 1 ratón, pero imágenes similares se obtuvieron durante al menos 5 animales (barra de escala = 25 micras). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En este trabajo se describe un método para obtener un modelo reproducible de lesión medular traumática utilizando un infinito horizonte Impactor con una fuerza de 70 Kdyne (grave). El uso de un paradigma de fuerza mayor (80 Kdyne), podemos causar una lesión más grave que por desgracia está asociada con la mortalidad ratones superiores. A fin de evitar este problema, que comúnmente escogemos un paradigma de fuerza moderada (70 Kdyne) que está asociado a una lesión repetible con una recuperación gradual de la función y una menor mortalidad. Para producir una lesión tan estable es muy importante prestar especial atención a la correcta fijación del animal sobre la plataforma impactador; en particular, la médula espinal debe estar centrada en la punta del péndulo, y los dos brazos del impactador deberá ser paralelos entre sí. Por otra parte, la atención se debe tomar en el bloqueo de los animales con las pinzas del impactador, cuando las vértebras puede triturarse y el cable puede ser dañado por las puntas de los fórceps. El posicionamiento del ánimal después de la laminectomía es crítica, y la manipulación de los animales durante este procedimiento también es muy importante. Especial atención debe darse al procedimiento laminectomía, que siempre debe ser realizada en el mismo lugar y con la misma extensión. Cuando se realizan estos procedimientos durante la laminectomía, otra cuestión metodológica para monitorear es la reducción del riesgo de dañar el cable cuando se utiliza micro-tijeras, Rongeur o pinzas para cortar huesos y liberar el cable a través de la eliminación de la lámina, para eliminar la restante protuberancias óseas laterales y fragmentos, y para eliminar el periostio. El uso de micro-tijeras y Rongeur con puntas apuntando hacia arriba reducirá el riesgo de encontrarse con los problemas antes mencionados.
Una limitación importante de este método es la alta probabilidad de que los animales pueden desarrollar infecciones urinarias graves internas y externas en el período posterior a la lesión. La infección externa es debido a la incapacidad de los ratones lesionados a Move con apoyo del peso de la extremidad posterior. En contraste, la infección urinaria interna puede ser causada por la incapacidad de los ratones lesionados de orinar de forma independiente. Con el fin de evitar estos problemas, es absolutamente necesario para inyectar a los animales con el antibiótico indicado y para comprobar el tamaño de la vejiga dos veces al día durante los procedimientos de cuidado de los animales de la primera semana. El estado de hidratación y el peso deben ser revisados cuidadosamente durante las tres primeras semanas después lesioning.
La aplicación de los procedimientos descritos que pudimos obtener déficits reproducibles de la función de las extremidades posteriores que fueron evaluados a través de una prueba de comportamiento específico desarrollado por Basso y sus colegas (BMS) 18. Inmediatamente después de la lesión de la pérdida de la función de la extremidad posterior es completa, que es seguido por una recuperación gradual que es más importante durante las primeras 2-3 semanas. La recuperación conductual alcanzó un nivel más alto cuando los ratones lesionados fueron tratados con adultos PM-NPCs (Figura 1 (Figura 3). Se estimó que el número total de vital importancia injertado PM-NPCs es mayor que los CES injertadas y NSCs adultas como se informó anteriormente por nuestro grupo de investigación 20-21. A las cuatro semanas después de lesioning y el trasplante, la mayoría de PM-NPCs tienen cuerpos más grandes y poseen extendidos procesos dendríticas como que están totalmente immunostained por los anticuerpos específicos a la MAP-2 (Figura 4).
La principal ventaja de este modelo de lesión de la médula espinal traumática es la estandarización de la lesión. También se consigue una curva relacionada con el tiempo reproducible de la recuperación de la extremidad posterior de la función. Tal reproducibilidad hace que sea posible definir los estudios de prueba de principio para tratamientos investigados, incluyendo el trasplante de células para la medicina regenerativa studies con un número reducido de casos. Además, varios aspectos de la fisiopatología de la lesión de la médula espinal pueden ser analizados con mayor detalle.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Los autores declaran no tener ningún interés financiero en competencia.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PKH26GL-1KT | Sigma | 091M0973 | |
| Infinite horizon (IH) Impactor device | Precision Systems and Instrumentation, LLC | Model 0400 Serial 0171 | |
| Gentamycin 10 mg/ml | Euroclone | ECM0011B | 1 mg/ml in sterile saline solution |
| Isoflurane-Vet 250 ml | Merial | B142J12A | |
| Blefarolin POM OFT 10 g | |||
| Slide Warmer | 2Biological Instruments | HB101-sm-402 | |
| Scalpel, size 10 | Lance Paragon | 26920 | |
| Small Graefe Forceps | 2Biological Instruments | 11023-14 | |
| Rongeur | Medicon Instruments | 07 60 07 | |
| Micro scissors | 2Biological Instruments | 15000-00 | |
| Absorbable sutures (4/0) | Safil Quick | C0046203 | |
| Hemostat | 2Biological Instruments | 13014-14 | |
| Reflex 7 wound clip applicator | 2Biological Instruments | 12031-07 | |
| 7 mm Reflex wound clips | 2Biological Instruments | 12032-07 | |
| NGS | Euroclone | ECS0200D | |
| Triton X 100 | Merck Millipore | 1086431000 | |
| Anti Microtubule Assocoated Protein (MAP) 2 | Millipore | AB5622 | |
| Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11008 | |
| FluorSave Reagent | Calbiochem | 345789 | |
| Neural stem cells medium | DMEM-F12 medium (Euroclone) containing 2 mm l-glutamine (Euroclone), 0.6% glucose (Sigma-Aldrich), 9.6 gm/ml putrescine (Sigma-Aldrich), 6.3 ng/ml progesterone (Sigma-Aldrich), 5.2 ng/ml sodium selenite (Sigma-Aldrich), 0.025 mg/ml insulin (Sigma-Aldrich), 0.1 mg/ml transferrin (Sigma-Aldrich), and 2 μg/ml heparin (sodium salt, grade II; Sigma-Aldrich), bFGF (human recombinant, 10 ng/ml; Life Technologies) and EGF (human recombinant, 20 ng/ml; Life Technologies) | ||
| DMEM-F12 | Euroclone | ASM5002 | |
| l-glutamine | Euroclone | ECB3000D | |
| glucose | Sigma-Aldrich | G8270-100G | |
| putrescine | Sigma-Aldrich | P5780-25G | |
| progesterone | Sigma-Aldrich | P6149-1MG | |
| Sodium-selenite | Sigma-Aldrich | S9133-1MG | |
| transferrin | Sigma-Aldrich | T 5391 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I1882 | |
| Heparin sodium-salt | Sigma-Aldrich | H0200000 | |
| bFGF | Life Technology | PHG0024 | |
| h-EGF | Life Technology | PHG6045 | |
| Syringe 0.33 cc 29 G | Terumo | MYJECTOR | |
| buprenorphine | Schering Plough SpA | TEMGESIC | |
| eye gel | Bausch & Lomb | LIPOSIC |
References
- Cord Injury Statistical Center: spinal cord injury facts and figures at glance. , https://www.nscisc.uab.edu/PublicDocuments/fact_figures_docs/Facts%202013.pdf (2013).
- Yip, P. K., Malaspina, A. Spinal cord trauma and the molecular point of no return. Molecular Neurodegeneration. 7, 6 (2012).
- Fehlings, M. G., Cadotte, D. W., Fehlings, L. N. A series of systematic reviews on the treatment of acute spinal cord injury: a foundation for best medical practice. J Neurotrauma. 28 (8), 1329-1333 (2011).
- Furlan, J. C., Noonan, V., Cadotte, D. W., Fehlings, M. G. Timing of decompressive surgery of spinal cord after traumatic spinal cord injury: an evidence-based examination of pre-clinical and clinical studies. J Neurotrauma. 28 (8), 1371-1399 (2011).
- Sekhon, L. H., Fehlings, M. G. Epidemiology, demographics, and pathophysiology of acute spinal cord injury. Spine. 26 (24), 2-12 (2001).
- Gorio, A., et al. Recombinant human erythropoietin counteracts secondary injury and markedly enhances neurological recovery from experimental spinal cord trauma. Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (14), 9450-9455 (2002).
- Windle, W. F., Clemente, C. D., Chambers, W. W. Inhibition of formation of a glial barrier as a means of permitting a peripheral nerve to grow into the brain. J Comp Neurol. 96 (2), 359-369 (1952).
- Young, W. Spinal cord contusion models. Prog Brain Res. 137, 231-255 (2002).
- Stokes, B. T., Noyes, D. H., Behrmann, D. L. An electromechanical spinal injury device with dynamic sensitivity. J Neurotrauma. 9 (3), 187-195 (1992).
- Jakeman, L. B., et al. Traumatic spinal cord injury produced controlled contusion in mouse. J Neurotrauma. 17 (4), 299-319 (2000).
- Sahni, V., Kessler, J. A. Stem cell therapies for spinal cord injury. Nat Rev Neurol. 6, 363-372 (2010).
- Marfia, G., et al. Adult neural precursors isolated from post mortem brain yield mostly neurons: an erythropoietin-dependent process. Neurobiol Dis. 43 (1), 86-98 (2011).
- Gritti, A., et al. Multipotent neural stem cells reside into the rostral extension and olfactory bulb of adult rodents. J Neurosci. 22 (2), 437-445 (2002).
- Whetstone, W. D., Hsu, J. Y., Eisenberg, M., Werb, Z., Noble-Haeusslein, L. J. J Neurosci Res. 74 (2), 227-239 (2003).
- Gonzalez-Lara, L. E., et al. The use of cellular magnetic resonance imaging to track the fate of iron-labeled multipotent stromal cells after direct transplantation in a mouse model of spinal cord injury. Mol Imaging Biol. 13 (4), 702-711 (2010).
- Ottobrini, L., et al. Magnetic resonance imaging of stem cell transplantation in injured mouse spinal cord. Cell R4. 2 (3), e963 (2014).
- Janowwski, M., et al. Neurotransplantation in mice: The concorde-like position ensures minimal cell leakage and widespread distribution of cells transplanted into the cistern magna. Neuroscience Letter. 430 (2), 169-174 (2008).
- Basso, D. M., et al. Basso Mouse Scale for locomotion detects differences in recovery after spinal cord injury in five common mouse strains. J Neurotrauma. 23 (5), 635-659 (2006).
- Hofstetter, C. P., et al. Allodynia limits the usefulness of intraspinal neural stem cell grafts; directed differentiation improves outcome. Nat Neurosci. 8 (3), 346-353 (2005).
- Bottai, D., Madaschi, L., Di Giulio, A. M., Gorio, A. Viability-dependent promoting action of adult neural precursors in spinal cord injury. Mol. Med. 14 (9-10), 634-644 (2008).
- Bottai, D., et al. Embryonic stem cells promote motor recovery and affect inflammatorycell infiltration in spinal cord injured mice. Exp Neurol. 223 (2), 452-463 (2010).
