Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Neurale stamceltransplantatie bij Experimentele Contusive Model van Spinal Cord Injury

Published: December 17, 2014 doi: 10.3791/52141
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 2, 1, 1
1Laboratory of Pharmacology, Department of Health Sciences, University of Milan, 2Department of Neuroscience, College of Medicine, The Ohio State University
* These authors contributed equally

Summary

Dwarslaesie is een traumatische aandoening die ernstige morbiditeit en hoge sterfte veroorzaakt. In dit werk beschrijven we in detail een kneuzing model van dwarslaesie bij muizen, gevolgd door een transplantatie van neurale stamcellen.

Abstract

Ruggenmergletsel is een verwoestende aandoening klinisch gekenmerkt door een complex van neurologische stoornissen. Diermodellen van ruggenmergletsel kan zowel de biologische reacties op letsel te onderzoeken en mogelijke therapieën te testen. Kneuzing of compressie verwonding geleverd aan het chirurgisch blootgestelde ruggenmerg zijn de meest gebruikte modellen van de pathologie. In dit rapport worden de experimentele kneuzing wordt uitgevoerd met behulp van de oneindige horizon (IH) Impactor apparaat, dat de oprichting van een reproduceerbare letsel diermodel doorlaat definitie van specifieke letsel parameters. Stamceltransplantatie wordt algemeen beschouwd als een potentieel bruikbare strategie voor de genezing van deze invaliderende aandoening. Talrijke studies hebben de effecten van transplanteren verschillende stamcellen geëvalueerd. Hier laten we een aangepaste methode voor ruggenmergletsels gevolgd door staartader injectie van cellen in CD1 muizen. Kortom, bieden wij de procedures voor: i) de cel etikettering wiste een vitale tracer, ii) pre-operatieve zorg van muizen, iii) uitvoering van een contusive dwarslaesie, en iv) intraveneuze toediening van post mortem neurale precursoren. Dit contusie model kan worden gebruikt om de werkzaamheid en veiligheid van stamceltransplantatie in een regeneratieve geneeskunde aanpak te beoordelen.

Introduction

Een dwarslaesie (SCI) is de meest voorkomende letsel veroorzaakt door hoge-energie-trauma zoals motorvoertuigen ongevallen, vallen, sport en geweld 1. In ernstige SCI, de schade kracht vernietigt of schade zenuwweefsel, waardoor plotseling verlies van neurologische functie. Traumatische SCI komt vaak voor bij jonge volwassenen tussen de 10 en 40 jaar oud. Het grote invloed op de patiënt mentale en fysieke conditie en veroorzaakt enorme economische impact op de samenleving 2. De benadering van de behandeling in de acute fase is vaak beperkt tot een hoge dosis corticosteroïden, chirurgische stabilisatie en decompressie om eventueel verzwakken verdere schade 3-4, maar de rollen van deze methoden op het bewegingsapparaat herstel na SCI zijn nog steeds controversieel. Naast acute weefselverlies, de traumatische verwonding en de activatie van secundaire mechanismen van degeneratie veroorzaakt demyelinisatie en dood van meerdere celtypen 5-6. De mate van herstel van de functie kan vantien worden gecorreleerd aan de mate van gespaard witte stof op het letsel plaats 7.

Diermodellen van SCI kan worden gebruikt zowel om de biologische responsen van het weefsel schade onderzoeken en mogelijke therapieën te testen. Bovendien is een nuttig dier model van een menselijk pathologie heeft niet alleen om een ​​aantal aspecten van die voorwaarde te reproduceren, maar moeten ook voordelen ten opzichte van directe klinische observatie en experiment bieden. De meest gebruikte modellen van dwarslaesie betrekken kneuzing of compressie letsel geleverd aan het chirurgisch blootgesteld ruggenmerg 8. De ontwikkeling van een gecontroleerde gewicht neerzetten contusieletsel vertegenwoordigt een belangrijke mijlpaal in de geschiedenis van SCI onderzoek. The Ohio State University ruggenmerg onderzoekscentrum heeft de technologische uitdaging van een inrichting die kan worden gebruikt om een bepaalde samendrukking van het ruggenmerg met parameters van invloed komputergestuurde 9 induceren nagestreefd. Dit werd oorspronkelijk ontworpen voor gebruik with ratten; werd later aangepast toepassen richting muizen 10. De voordelen van een dergelijke benadering zijn dat de biomechanica schade meer kan worden bestudeerd en de parameters van de schade kan een vollediger wijze gedefinieerd om een ​​reproduceerbaar experimenteel model te verkrijgen, waardoor deze nauwkeuriger beoordeling van de effecten van geteste behandelingen op het functioneel herstel proces.

Vele studies hebben de effecten transplantatie van diverse stamcellen in SCI modellen 11 geëvalueerd. We hebben onlangs geïsoleerd volwassen neurale stamcellen uit de Sub-ventriculaire zone (SVZ) enkele uren na de dood van de muis donor 12-13. Deze procedure voorziet in een populatie van neurale stamcellen, de zogenaamde post-mortem neurale precursors (PM-NPC), die lijken voordelig in een regeneratieve geneeskunde aanpak voor het genezen van SCI te zijn. In dit artikel zullen we laten zien: i) het protocol voor mobiele etikettering met de vitale tracer PKH26, ii) de surgsche procedure uit te voeren op traumatische SCI, en iii) de intraveneuze (iv) toediening van gemerkte cellen. Bovendien is in dit werk tonen we aan dat getransplanteerde cellen migreren ruggenmerg laesie plaatsen en differentiëren meestal in microtubule geassocieerd proteïne (MAP) 2 positieve cellen. Bovendien is de differentiatie gepaard met de bevordering van een stabiele herstel van achterste ledematen functie.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

OPMERKING: Alle procedures werden goedgekeurd door de Commissie van Toezicht van de Universiteit van Milaan en ontmoette de Italiaanse Richtlijnen voor Proefdieren in overeenstemming met de Europese Gemeenschappen richtlijn van november 1986 (86/609 / EEG).

1. Bereiding van Cellen voor Transplantatie

OPMERKING: Gebruik neurale stamcellen tussen de 5e en de 9e passage in de cultuur van deze experimenten; Test de kweken proliferatie en differentiatie vermogen alvorens gelabeld voor transplantatie. Bepaal de mate van differentiatie door immuuncytochemie 12.

  1. Resuspendeer cellen tot een concentratie van 1 x 10 6 cellen / 150 ul (transplantaat 1 x 10 6 cellen per muis). Maak minstens 1,2 x 10 6 cellen per muis omdat een overmaat van cellen vereist voor spuit topflap.
  2. Was de cellen 3 maal met neurale stamcel medium 13 in een 10 ml conische flacon. In elkwasstap precipitaat cellen door centrifugatie (500 xg gedurende 5 min, kamertemperatuur).
  3. Tel de cellen voor de laatste draai.
  4. Centrifugeer de cellen (500 xg gedurende 5 minuten) en zuig de supernatant voorzichtig alle cellen niet te verwijderen maar waarbij niet meer dan 25 pl supernatant.
  5. Bereid 2x celsuspensie door toevoeging van 1 ml Diluent C aan de cel pellet en resuspendeer met zachte pipetteren.
  6. Onmiddellijk voor kleuring, stelt een 2x Dye Solution (4 x 10-6 M) in Diluent C door 4 pl van de PKH26 ethanol kleurstofoplossing 1 ml Diluent C in een buis en meng goed te dispergeren.
  7. Snel voeg 1 ml 2x celsuspensie 1 ml 2x Dye Solution en het monster onmiddellijk meng door pipetteren (uiteindelijke celdichtheid wordt 1,2 x 10 7 cellen / ml en 2 x 10-6 M PKH26).
  8. Incubeer de cel / kleurstof suspensie voor 1-5 min.
  9. Stop de kleuring door toevoeging van een gelijk volume (2ml) van 1% BSA-oplossing in HBSS en incubeer gedurende 1 min.
  10. Centrifuge cellen (500 g gedurende 10 min) en verwijder voorzichtig het supernatant.
  11. Resuspendeer celpellet in 10 ml HBSS en gecentrifugeerd (500 xg gedurende 5 minuten).
  12. Was de celpellet nog 2 maal met 10 ml compleet medium aan verwijdering van ongebonden kleurstof te verzekeren.
  13. Resuspendeer de celpellet in 10 ml compleet medium voor evaluatie cel herstel cellevensvatbaarheid en fluorescentie intensiteit. Wanneer cellen nodig voor transplantatie, wassen en resuspendeer ze in een steriele fysiologische oplossing bij een concentratie van 3,3 x 10 5 cellen / 50 ul.

2. Voorbereiding voor Heelkunde

  1. Schoon en steriliseer chirurgie apparatuur.
  2. Bereid de operatie gebied schoon met een aseptische middel. Het opzetten van de IH Impactor apparaat.
  3. Bereid de anesthesie-apparatuur: de Active Gas Scavenger met VetScav Wegen van het apparaat, continue stroom inductie kamer, Oxygen Geneterbestuurder, Low Flow O 2 Meter voor Muizen. Reinig de inductie kamer en het masker tijdens chirurgie.
  4. Verdoven van dieren met 2,5% (v / v) isofluraan in zuurstof (1 L / min), en wacht 5 minuten na de stroom inductie voor de drug door te voeren. Controleer of de snorharen zijn spiertrekkingen of als er langzaam achterste ledematen terugtrekking in reactie op knijpen de voetzool. Tijdens de operatie, vermindering van de isofluraan concentratie 2,0% (v / v) isofluraan in zuurstof (1 l / min).

3. Voorbereiding van muizen voor Chirurgie en Transplantatie

  1. Houd de mannelijke volwassene CD1-muizen (25-30 g) gedurende ten minste 3 dagen voor de experimenten in standaard condities (22 ± 2 ° C, 65% vochtigheidsgraad en kunstlicht van 8:00-08:00).
    OPMERKING: De gehele procedure van chirurgische voorbereiding tot het hechten zal ongeveer 40 minuten duren.
    1. Om het dier te identificeren, markeren de staart met behulp van waterbestendig gekleurde inkt.
  2. Gebruik een elektric clipper aan de dorsale haren van de muis te snijden van de hals, over op T2-niveau, om de lumbale gebied.
  3. Steriliseer het bereide met een jodiumoplossing en ethanol (70% in steriel water).
  4. Behandel het dier met een sub-cutane (sc) injectie van 200 ui gentamycine (1 mg / ml in steriele zoutoplossing).
  5. Breng oogheelkundige smeermiddel zowel dierlijke ogen om uitdroging te voorkomen en buprenorfine injecteren (subcutaan, 0,03 mg / kg) om pijn te verlichten.

4. Laminectomie

  1. Plaats de muis op een dia warmer het probleem van onderkoeling tijdens de operatie te voorkomen. Plaats het dier met de dorsale zijde naar boven.
  2. Voeg een verticale insnijding met een scalpel op het gebied van belang van T7 tot T12.
  3. Houd de huid en oppervlakkige vet pad met behulp van standaard pincet (meestal te vinden in de ruimte tussen de 5 e en 6 e thoracale dorsale processen).
  4. Tel het proces in het kader van het schip als T6dan verhuizen naar T7.
  5. Leg een beetje lager onder de ventrale zijde van de muis om de kromming van de wervelkolom te verhogen. Immobiliseren het ruggenmerg door het blokkeren van het met de Graefe pincet.
  6. Snijd de paravertebrale spieren bilateraal uit T7 en T10 wervel niveau met behulp van de scalpel tot het dorsale oppervlak van de lamina contact op met de scalpel tip.
  7. Gebruik de scalpel om afvinken de kruising van T7 tot T10. Stop in de ruimte tussen T8 en T9 stekelige uitsteeksels. Snijd de weefsels tussen de T8-T9 en T9-T10 met de micro schaar.
    1. Gebruik de Rongeur aan het T9-proces te verwijderen. Expose de kruising door voorzichtig weg te schrapen de spierlaag met de micro schaar. Ga door tot het bot wordt blootgesteld.
  8. Gebruik de tang om de spieren van de lamina te verwijderen en open een kleine ruimte tussen de wervels. Steek voorzichtig de micro schaar onder het bot, snijd de lamina aan beide zijden en verwijder dit deel met een pincet.
  9. Verwijder de lamina met de forceps aan het snoer bloot. Zorg ervoor dat u geen gratis of gekartelde botfragmenten achter te laten; verwijder ze met de Rongeur.
  10. Gebruik de kleine tip tang om het periost alsmede alle botfragmenten of spieren die mogelijk in de buurt van de incisie te verwijderen.
  11. Verwijder de bovenste helft van de T9 dorsale proces en ga naar de IH aantikinrichting protocol.

5. IH aantikinrichting Protocol (contusie)

  1. Plaats de muis in het midden van het stabilisatieplatform van de IH Impactor apparaat.
  2. Blokkeren het dier met de twee tanden tang verbonden met de stabilisatie platform door twee gezamenlijke richtarmen (linkerarm voor de borstwervel, rechterarm voor halswervel).
  3. Gebruik de rostrale arm naar de zijrand van het rostrale wervellichaam (T8) grijpen.
  4. Manipuleren de caudale arm op dezelfde wijze als de T10 wervellichaam grijpen.
  5. Plaats de stabilisatie platform in het apparaat en laat de tip (diameter 0,75mm) zo dicht bij het koord mogelijk zonder raken.
  6. Til de tip drie hele slagen voor het starten van de impact.
  7. Voer de kneuzing met het instellen van een kracht van 60 kdyn leveren tegen 100 mm / sec impactor.

6. Hechtingen en Post-zorg

  1. Hecht de incisie met een 4/0 absorbeerbare hechtdraad. Bedek het blootliggende ruggenmerg op de plaats van verwijderd lamina; hechtdraad het weefsel aan de uiteinden van de snede door middel van een kleine naald. Plaats de twee steken onmiddellijk boven en onder de plaats van ruggenmerg blootstelling.
  2. Sluit de huid met behulp van twee of drie Reflex clips zonder knijpen van de onderliggende spieren.
  3. Hydrateren muis na chirurgie met 2 ml zoutoplossing subcutaan geïnjecteerd in de onderrug.
  4. Plaats de muis opnieuw in een voorverwarmde kooi onderkoeling tijdens chirurgische herstel te voorkomen. Plaats kooien op verwarming pads.
  5. Bewaken van de muizen in de acute fase na het letsel door het controleren van degrootte blaas, de hechting en het gewicht dier tweemaal per dag. Knijp voorzichtig in de blaas (twee keer per dag gedurende 7 dagen) om te voorkomen dat de urinewegen van infecties (urine troebel, bloederige of met enige neerslag zou kunnen zijn).
  6. Behandel muizen eenmaal per dag met een zoutoplossing injectie (2 ml gedurende twee dagen na de operatie sc injectie) en antibioticum (gentamycine 0,2 ml; sc injectie) gedurende vijf dagen na beschadiging.
  7. Behandel muizen post-operatieve analgesie met buprenorfine (0,1 mg / kg, tweemaal per dag) gedurende 3 dagen na beschadiging.

7. staartaderinjectie van Cellen

Opmerking: In de volgende stap van de procedure voor het injecteren van de cellen in de staartader wordt aangetoond. Cellen kunnen ook worden toegediend met een intraspinale transplantatie met een stereotaxisch frame 15-16, of in de cisterna magna 17. Het is belangrijk om te overwegen dat andere celtypen kunnen worden getransplanteerd met deze methode, zoals mesenchymale stromale cellen(Bijvoorbeeld beenmerg mesenchymale stamcellen, adipose afgeleide stamcellen, vruchtwater cellen). Bovendien kunnen andere behandelingen zoals nanodeeltjes worden geïnjecteerd via de staartader na ruggenmergletsel.

  1. Gebruik 70% ethanol en PBS om de naald voor gebruik reinigen. Behandel de naald en de spuit alleen met steriele handschoenen.
  2. Resuspendeer de cellen in de reageerbuis en de belasting 75 pi cellen in 0,3 ml injectiespuit (29 G naald en 0,33 cc spuit).
  3. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen aanwezig zijn binnen de celsuspensie zijn. Houd de spuit in een horizontale positie naar cel sedimentatie te voorkomen.
  4. Plaats de muis onder de warmtelamp aan de staart aderen te verwijden.
  5. Pak de muis en trek het voorzichtig in de muis weerhouder aan de laterale staartader als een smalle blauwe lijn te visualiseren.
  6. Reinig de staart met een alcoholdoekje. Zodra de ader wordt gevisualiseerd, pak de staart ader tussen de middelvinger en de duim van de linkerhand.
  7. Breng de naald aan het oppervlak in een hoek van 15 ° boven de horizon en zorg ervoor dat de schuine kant is up.
  8. Injecteer 50 pi cellen bij een snelheid van 0,33 pl / sec. Na de injectie, vertragen het terugtrekken van de naald 10 sec. Trek de naald langzaam en aandacht besteden aan de mogelijke uitstroom van celsuspensie.
  9. Reinig de spuit als in stap 7.1 tussen de verschillende vrachten.

8. gedragstesten en Hind Limb Functie

  1. Plaats de muis in het open veld.
  2. Evalueer bewegingsapparaat functie en achterste ledematen herstel na kneuzing met het open veld wordt uitgevoerd overeenkomstig de Basso muis schaal (BMS) 18.
    OPMERKING: Neurologische functie moet periodiek worden geëvalueerd, vanaf dag 3 na een blessure voor 4 weken 18.

9. Perfusie

  1. Aan het eind van de experimentele periode, verdoven dieren door een intraperitoneale injectie van natriumpentobarbital (65 mg / kg). Gebruik teen wringt om evaluate de anesthesie-niveau en ga pas na de muis niet reageert op de schadelijke stimuli.
  2. Zet het dier vast in liggende positie op een operatie vliegtuig.
  3. Dwars door de omhulling en buikwand net onder de ribbenkast. Scheid de membraan van de lever.
  4. Gebruik de schaar om het membraan gesneden om de borstholte bloot te leggen.
  5. Snij de zijkanten van de ribbenkast tot de sleutelbeenderen.
  6. Gebruik de arterieklem de zwaardvormig kraakbeen klem en plaats de hemostaat over het hoofd.
  7. Houd het onderste derde deel van het hart op een dwarsvlak met de tang. Steek de naald in de linker ventrikel.
  8. Gebruik een vaatklem naar het hart te klemmen. Dit stelt de naald en voorkomt lekkage.
  9. Gebruik de schaar om het rechteratrium snijden.
  10. Laat de PBS te pompen (18 ml / min) door het dier. Handhaaf deze druk over het gehele buffer infuus periode (3-4 min; wat overeenkomt met ongeveer 70 ml PBS). Ga door tot het hart is schoon.
  11. Schakel de kraan aan het fixeermiddel (4% paraformaldehyde in gedestilleerd water, 4% PFA) door de pomp toe. Laat de 4% PFA te pompen door het dier gedurende ongeveer 8-10 min (300 ml). Verhoog geleidelijk de druk tot maximaal 30 ml / min bereikt. Een geharde lever is de beste indicatie van een succesvolle perfusie.

10. Weefsel en -verwerking, histologie en Iimmunohistochemistry

  1. Ontleden ruggenmerg van T5 naar L1. Dan na vast weefsel in 6 ml in 4% PFA (O / N bij 4 ° C).
  2. Doe hetzelfde weefsel in een oplossing met 30% sucrose gedurende 72 uur bij 4 ° C om cryo beschermen en de vorming van kristallen tijdens het invriezen te voorkomen.
  3. Snel vriezen het snoer met behulp van droogijs en op te slaan bij -80 ° C.
  4. Sectie door een cryostaat met 15 urn dikte en secties verzamelen op glasplaatjes en blijven voor immunocytochemie.
  5. Spoel secties met 200 ui PBS per Wlide (3 maal; 5 minuten elk, RT).
  6. Permeabilize elk glaasje met 200 ui 10% NGS en 0,2% Triton X-100 in PBS gedurende 1 uur bij KT.
  7. Spoel secties met 200 ui PBS per dia (3 keer, 5 minuten elk, kamertemperatuur).
  8. Blokkeer niet-specifieke plaatsen met 200 ui blokkerende oplossing slede (5% NGS 0,1% Triton X-100 in PBS) gedurende 30 min (RT).
  9. Incubeer elk glaasje met 200 ui primaire antilichamen O / N bij 4 ° C (verdund antilichaam in 5% NGS 0,1% Triton X-100 in PBS).
  10. Was secties met 200 ui PBS per dia (3 keer, ieder 5 min; RT).
  11. Incubeer met geschikte secundaire antilichamen gedurende 2 uur bij KT.
  12. Was secties met 200 ui PBS per dia (3 keer, ieder 5 min; RT).
  13. Stain kernen met 200 ui 4 ', 6-diamidin-2-phenilindole (DAPI) (1 ug / ml eindconcentratie, 10 min bij kamertemperatuur).
  14. Monteer met behulp van de FluorSave reagens en analyseren door confocale microscopie.
    LET OP: Incontrolebepalingen, primaire antilichamen worden weggelaten en vervangen door equivalente concentraties van onafhankelijke IgG van dezelfde subklasse. Microtubulus geassocieerd eiwit 2 primair antilichaam werd gebruikt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Het totaal aantal getransplanteerde cellen 1 x 10 6 cellen en is verdeeld in drie opeenvolgende injecties in de staartader. Wij toegediend 3,3 x 10 5 cellen in 50 ui fosfaatbuffer (PBS). De eerste injectie werd de tweede 6 uur later uitgevoerd binnen 30 minuten na een blessure, en de laatste 18 uur na het letsel. De keuze van een termijn van 18 uur na SCI voor toediening PM-NPC werd bepaald door de optimale permeabiliteit van de bloed-hersenbarrière momenteel 14. Om het effect van stamcellen injectie evalueren raadzaam de positieve controle laminectomie dieren (n = 14) en PBS geïnjecteerde dieren als een negatieve controle (n = 14).

PM-NPC's verbetering van het herstel van Hind Limb Functie, migreren naar laesieplaats en te differentiëren in het MAP-2-positieve cellen

De T9 kneuzing veroorzaakt het tijdelijk verlies van de achterste ledematen functie, gevolgd door een progressieve gradual recovery (figuur 1). Binnen 2-3 weken, PBS-behandelde gewonden muizen verbeterd en achterste ledematen functie bereikt 3 punten van BMS (overeenkomend met plantaris plaatsing van de poot, met of zonder gewicht support of incidenteel, frequent, of consistente dorsale stepping, maar niet plantaris stepping 18) . In plaats daarvan, binnen dezelfde observatieperiode, gewond muizen behandeld met PM-NPC's toonden een hogere recovery, het bereiken van 4,5 punten van BMS (overeenkomend met frequente of consistente plantaris stepping zonder coördinatie, of frequente of consistente plantaris het stappen met enkele coördinatie). De gedragsmatige verbetering was vooral duidelijk in de periode tussen dag 7 en dag 14 na de SCI. Geen tekenen van allodynie-achtige voorpoot hyper gevoeligheid 19 werden geregistreerd op elk moment in een experimentele groep gedurende de observatieperiode van 30 dagen.

Meest geënt PM-NPC, gelabeld met PKH26 (figuur 2), gecumuleerde randen van delaesie vorming van clusters (figuur 3) van de vroege dagen van hun administratie. Vervolgens gemigreerd de getransplanteerde cellen langs de laesie randen en in een meer diffuus mode waar ze gedifferentieerd, geleidelijk aan de veronderstelling dat de asymmetrische cellulaire conformatie van neuronen. Op 30 dagen na de laesie en transplantatie, het cellichaam van PM-NPC vergroot en in de meeste cellen dendritisch-achtige processen waren duidelijk en volledig immunologisch gekleurd met specifieke antilichamen tegen MAP-2 (figuur 4). Het bereiken van morfologische complexiteit en de positiviteit MAP2 van getransplanteerde PM-NPC waarschijnlijk niet door fusie met overlevende gastheer ruggenmerg neuronen, hetgeen blijkt uit de heldere gedifferentieerde morfologie en de afwezigheid van twee kernen in een enkele gelabelde cel.

Figuur 1
Figuur 1. PM-NPC's te verbeteren functionele RECOVery van gewonde dieren. De open veld motoriek was de gebruikte test voor de bepaling van de motorische functie herstel 18. Dieren werden de dag getest voordat de kneuzing en scoorde 9 punten in de BMS schaal. Op de eerste dag na de verwonding in het lesioned dieren, de BMS score gedaald tot nul. Het herstel van de achterste ledematen functie van gelaedeerde muizen bleek een opmerkelijke en langdurige verbetering wanneer de dieren werden behandeld met PM-NPC's. De analyse werd uitgevoerd in dubbel blind, en elke groep bestond uit 14 dieren. De waarden geven het gemiddelde ± SEM. We bepaalden de statistische verschillen door middel van ANOVA-test, gevolgd door post-test Tukey's. *** P <0.001; ** P <0,01 vs PBS.

Figuur 2
Figuur 2. PKH26 etikettering van PM-NPC's. Na de etikettering procedure met PKH26, PMNPCS zijn visu alized met het live-beeld microscoop Evos fl en microfoto werd genomen met hetzelfde instrument (schaal bar = 50 pm). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 3
Figuur 3. Lokalisatie van PM-NPC in de laesie. PKH26-gemerkte PM-NPC (rood) in het gehele randen van de laesie 30 dagen na de iv injectie aanwezig. De afbeelding is representatief voor 1 muis, maar vergelijkbare beelden werden verkregen voor ten minste 5 dieren (schaal bar = 50 pm). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

belasting / 52141 / 52141fig4highres.jpg "/>
Figuur 4. MAP2 uitdrukking in getransplanteerde PM-NPC's. De meeste PKH26-gelabelde PM-NPC's (rood) verwierf een neuronaal-achtige vorm met dendritische-achtige processen en had MAP-2-positieve cellen (groen) gedifferentieerd. Kernen zijn gekleurd in het blauw (DAPI). De afbeelding is representatief voor 1 muis, maar vergelijkbare beelden werden verkregen voor ten minste 5 dieren (schaal bar = 25 pm). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

In dit artikel beschrijven we een methode om een ​​reproduceerbaar model van traumatisch ruggenmergletsel te verkrijgen met behulp van een oneindige horizon Impactor bij een kracht van 70 Kdyne (ernstige). Met een grotere kracht paradigma (80 Kdyne), kunnen we een ernstiger letsel dat nog wordt geassocieerd met een hogere mortaliteit muizen. Om dit probleem te vermijden, kiezen we gewoonlijk een matige kracht paradigma (70 Kdyne) die is gekoppeld aan een herhaalbare laesie met een geleidelijk herstel van functie en lagere mortaliteit. Om dergelijke stabiel schade is het zeer belangrijk om bijzondere aandacht te schenken aan de juiste fixatie van het dier op het platform botslichaam produceren; in het bijzonder het ruggenmerg moeten worden gecentreerd op de impactor tip, en de twee takken van het botslichaam moet parallel aan elkaar zijn. Bovendien moet aandacht worden genomen blokkeren het dier met de impactor tang, wanneer de wervels kan worden vermalen en het snoer kan worden beschadigd door de uiteinden van de tang. De positionering van de animal na laminectomie is kritisch en de dierlijke behandeling tijdens deze procedure is ook zeer belangrijk. Speciale aandacht moet ook worden besteed aan de laminectomie procedure, die altijd op dezelfde plaats en met dezelfde extensie moet worden uitgevoerd. Wanneer deze procedures worden uitgevoerd tijdens laminectomie, een methodologische kwestie te controleren is de vermindering van het risico van beschadiging van het snoer met behulp van micro-schaar, Rongeur of tang botten snijden en bevrijd het koord door het verwijderen van de lamina tot het elimineren resterende laterale been uitsteeksels en fragmenten, en het periosteum verwijderen. Het gebruik van micro-schaar en Rongeur tips naar boven het risico stuiten de bovengenoemde problemen te verminderen.

Een belangrijke beperking van deze methode is de kans groot dat de dieren interne en externe ernstige urineweginfecties in de periode na schade ontstaan. De externe infectie door het onvermogen van de gelaedeerde muizen move met achterste ledematen gewicht ondersteuning. Daarentegen kan de interne urineweginfectie veroorzaakt door het onvermogen van de gewonde muizen zelfstandig urineren. Om deze problemen is het noodzakelijk om de dieren te injecteren met de aangegeven antibioticum voorkomen en de omvang van de blaas tweemaal daags controleren tijdens de dierlijke zorg procedures van de eerste week. De hydratatie status en het gewicht moeten zorgvuldig worden gecontroleerd tijdens de eerste drie weken na de laesie.

Het toepassen van de beschreven procedures die we in staat waren om reproduceerbare tekorten van de achterste ledematen functie die werden geëvalueerd door middel van een specifieke gedragstest ontwikkeld door Basso en collega's (BMS) 18 te verkrijgen. Direct na de verwonding de achterpoot functieverlies voltooid, gevolgd door een geleidelijk herstel die het meest belangrijk tijdens de eerste 2-3 weken. De gedragsmatige herstel bereikte een hoger niveau wanneer lesioned muizen werden behandeld met volwassen PM-NPC's (Figuur 1 (figuur 3). We schatten dat het totale aantal vitale geënte PM-NPC groter is dan de geënte SER en volwassen NSC zoals eerder gerapporteerd door onze onderzoeksgroep 20-21. Bij vier weken na laesie en transplantatie, meest PM-NPC hebben grotere organen en bezitten uitgebreide dendritisch-achtige processen die volledig door immunologisch specifieke antilichamen tegen MAP-2 (figuur 4).

Het grote voordeel van dit model van traumatisch ruggenmergletsel is de standaardisatie van het letsel. Een reproduceerbare tijdsgebonden curve van de achterste ledematen herstel van de functie wordt ook bereikt. Dergelijke reproduceerbaarheid maakt het mogelijk om proof-of-principle studies definiëren voor onderzochte behandelingen, waaronder de transplantatie van cellen voor regeneratieve geneeskunde studies met een gereduceerd aantal gevallen. Daarnaast kunnen verschillende aspecten van de pathofysiologie van dwarslaesie worden nader geanalyseerd.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs verklaren geen concurrerende financieel belang.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PKH26GL-1KT  Sigma 091M0973
Infinite horizon (IH) Impactor device  Precision Systems and Instrumentation, LLC Model 0400 Serial 0171
Gentamycin 10 mg/ml Euroclone ECM0011B 1 mg/ml in sterile saline solution
Isoflurane-Vet 250 ml Merial B142J12A
Blefarolin POM OFT 10 g
Slide Warmer 2Biological Instruments HB101-sm-402
Scalpel, size 10 Lance Paragon 26920
Small Graefe Forceps 2Biological Instruments 11023-14
Rongeur Medicon Instruments 07 60 07
Micro scissors 2Biological Instruments 15000-00
Absorbable sutures (4/0) Safil Quick C0046203
Hemostat 2Biological Instruments 13014-14
Reflex 7 wound clip applicator 2Biological Instruments 12031-07
7 mm Reflex wound clips 2Biological Instruments 12032-07
NGS Euroclone ECS0200D
Triton X 100 Merck Millipore 1086431000
Anti Microtubule Assocoated Protein  (MAP) 2 Millipore AB5622
Alexa Fluor 488 Invitrogen A11008
FluorSave Reagent  Calbiochem 345789
Neural stem cells medium DMEM-F12 medium (Euroclone) containing 2 mm l-glutamine (Euroclone), 0.6% glucose (Sigma-Aldrich), 9.6 gm/ml putrescine (Sigma-Aldrich), 6.3 ng/ml progesterone (Sigma-Aldrich), 5.2 ng/ml sodium selenite (Sigma-Aldrich), 0.025 mg/ml insulin (Sigma-Aldrich), 0.1 mg/ml transferrin (Sigma-Aldrich), and 2 μg/ml heparin (sodium salt, grade II; Sigma-Aldrich), bFGF (human recombinant, 10 ng/ml; Life Technologies) and EGF (human recombinant, 20 ng/ml; Life Technologies) 
DMEM-F12 Euroclone ASM5002
l-glutamine Euroclone ECB3000D
glucose Sigma-Aldrich G8270-100G
putrescine Sigma-Aldrich P5780-25G
progesterone Sigma-Aldrich P6149-1MG
Sodium-selenite Sigma-Aldrich S9133-1MG
transferrin Sigma-Aldrich T 5391
Insulin Sigma-Aldrich I1882
Heparin sodium-salt Sigma-Aldrich H0200000
bFGF Life Technology PHG0024
h-EGF Life Technology PHG6045
Syringe 0.33 cc 29 G Terumo MYJECTOR 
buprenorphine Schering Plough SpA TEMGESIC
eye gel Bausch & Lomb LIPOSIC

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cord Injury Statistical Center: spinal cord injury facts and figures at glance. , https://www.nscisc.uab.edu/PublicDocuments/fact_figures_docs/Facts%202013.pdf (2013).
  2. Yip, P. K., Malaspina, A. Spinal cord trauma and the molecular point of no return. Molecular Neurodegeneration. 7, 6 (2012).
  3. Fehlings, M. G., Cadotte, D. W., Fehlings, L. N. A series of systematic reviews on the treatment of acute spinal cord injury: a foundation for best medical practice. J Neurotrauma. 28 (8), 1329-1333 (2011).
  4. Furlan, J. C., Noonan, V., Cadotte, D. W., Fehlings, M. G. Timing of decompressive surgery of spinal cord after traumatic spinal cord injury: an evidence-based examination of pre-clinical and clinical studies. J Neurotrauma. 28 (8), 1371-1399 (2011).
  5. Sekhon, L. H., Fehlings, M. G. Epidemiology, demographics, and pathophysiology of acute spinal cord injury. Spine. 26 (24), 2-12 (2001).
  6. Gorio, A., et al. Recombinant human erythropoietin counteracts secondary injury and markedly enhances neurological recovery from experimental spinal cord trauma. Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (14), 9450-9455 (2002).
  7. Windle, W. F., Clemente, C. D., Chambers, W. W. Inhibition of formation of a glial barrier as a means of permitting a peripheral nerve to grow into the brain. J Comp Neurol. 96 (2), 359-369 (1952).
  8. Young, W. Spinal cord contusion models. Prog Brain Res. 137, 231-255 (2002).
  9. Stokes, B. T., Noyes, D. H., Behrmann, D. L. An electromechanical spinal injury device with dynamic sensitivity. J Neurotrauma. 9 (3), 187-195 (1992).
  10. Jakeman, L. B., et al. Traumatic spinal cord injury produced controlled contusion in mouse. J Neurotrauma. 17 (4), 299-319 (2000).
  11. Sahni, V., Kessler, J. A. Stem cell therapies for spinal cord injury. Nat Rev Neurol. 6, 363-372 (2010).
  12. Marfia, G., et al. Adult neural precursors isolated from post mortem brain yield mostly neurons: an erythropoietin-dependent process. Neurobiol Dis. 43 (1), 86-98 (2011).
  13. Gritti, A., et al. Multipotent neural stem cells reside into the rostral extension and olfactory bulb of adult rodents. J Neurosci. 22 (2), 437-445 (2002).
  14. Whetstone, W. D., Hsu, J. Y., Eisenberg, M., Werb, Z., Noble-Haeusslein, L. J. J Neurosci Res. 74 (2), 227-239 (2003).
  15. Gonzalez-Lara, L. E., et al. The use of cellular magnetic resonance imaging to track the fate of iron-labeled multipotent stromal cells after direct transplantation in a mouse model of spinal cord injury. Mol Imaging Biol. 13 (4), 702-711 (2010).
  16. Ottobrini, L., et al. Magnetic resonance imaging of stem cell transplantation in injured mouse spinal cord. Cell R4. 2 (3), e963 (2014).
  17. Janowwski, M., et al. Neurotransplantation in mice: The concorde-like position ensures minimal cell leakage and widespread distribution of cells transplanted into the cistern magna. Neuroscience Letter. 430 (2), 169-174 (2008).
  18. Basso, D. M., et al. Basso Mouse Scale for locomotion detects differences in recovery after spinal cord injury in five common mouse strains. J Neurotrauma. 23 (5), 635-659 (2006).
  19. Hofstetter, C. P., et al. Allodynia limits the usefulness of intraspinal neural stem cell grafts; directed differentiation improves outcome. Nat Neurosci. 8 (3), 346-353 (2005).
  20. Bottai, D., Madaschi, L., Di Giulio, A. M., Gorio, A. Viability-dependent promoting action of adult neural precursors in spinal cord injury. Mol. Med. 14 (9-10), 634-644 (2008).
  21. Bottai, D., et al. Embryonic stem cells promote motor recovery and affect inflammatorycell infiltration in spinal cord injured mice. Exp Neurol. 223 (2), 452-463 (2010).

Tags

Geneeskunde Dwarslaesie neurale voorlopers cellen stamcellen transplantatie staartader cel injectie het gedrag van dieren ontsteking
Neurale stamceltransplantatie bij Experimentele Contusive Model van Spinal Cord Injury
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Carelli, S., Giallongo, T., Gerace,… More

Carelli, S., Giallongo, T., Gerace, C., De Angelis, A., Basso, M. D., Di Giulio, A. M., Gorio, A. Neural Stem Cell Transplantation in Experimental Contusive Model of Spinal Cord Injury. J. Vis. Exp. (94), e52141, doi:10.3791/52141 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter