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Medicine

Neural Transplantation de cellules souches dans la partie expérimentale Modèle contusion de la moelle épinière des blessures

Published: December 17, 2014 doi: 10.3791/52141
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 2, 1, 1
1Laboratory of Pharmacology, Department of Health Sciences, University of Milan, 2Department of Neuroscience, College of Medicine, The Ohio State University
* These authors contributed equally

Summary

Lésion de la moelle épinière est une condition traumatique qui entraîne une morbidité grave et une mortalité élevée. Dans ce travail, nous décrivons en détail un modèle de contusion de blessure de la moelle épinière chez la souris suivie d'une transplantation de cellules souches neurales.

Abstract

Lésion de la moelle épinière est un état clinique dévastateur, caractérisé par un complexe de dysfonctionnements neurologiques. Les modèles animaux de lésions de la moelle épinière peuvent être utilisés à la fois pour enquêter sur les réponses biologiques à des blessures et de tester des thérapies potentielles. Contusion ou compression délivrée blessure à la moelle épinière exposée chirurgicalement sont les modèles les plus répandus de la pathologie. Dans ce rapport, la contusion expérimentale est effectuée en utilisant l'horizon infini (IH) dispositif de Impactor, qui permet la création d'un modèle animal de lésion reproductible par la définition des paramètres de blessures spécifiques. la transplantation de cellules souches est généralement considérée comme une stratégie potentiellement utile pour guérir cette maladie débilitante. De nombreuses études ont évalué les effets de la transplantation de diverses cellules souches. Ici, nous démontrons une méthode adaptée pour les blessures de la moelle épinière suivie par injection dans la veine de la queue de cellules dans des souris CD1. En bref, nous fournissons les procédures pour: i) le marquage cellulaire wie un traceur vitale, ii) soins pré-opératoires de souris, iii) l'exécution d'une blessure de la moelle épinière contondante, et iv) l'administration intraveineuse de post mortem précurseurs neuraux. Ce modèle de contusion peut être utilisé pour évaluer l'efficacité et l'innocuité de la transplantation de cellules souches dans une approche de la médecine régénératrice.

Introduction

Une blessure de la moelle épinière (SCI) est la blessure la plus courante causée par un traumatisme à haute énergie comme les véhicules automobiles accidents, les chutes, les sports et la violence 1. En graves SCI, la force des blessures détruit ou endommage les tissus nerveux, causant une perte soudaine de la fonction neurologique. Traumatique SCI se produit fréquemment chez les jeunes adultes entre 10 et 40 ans. Il affecte grandement état ​​mental et physique du patient et provoque un énorme impact économique pour la société 2. L'approche de traitement à la phase aiguë est souvent limitée à une forte dose de corticostéroïdes, la stabilisation et la décompression chirurgicale pour atténuer éventuellement d'autres dommages 3-4, mais les rôles de ces méthodes sur la récupération locomotrice après SCI sont encore controversée. En plus de la perte de tissu aigu, la lésion traumatique et l'activation des mécanismes secondaires causes de la dégénérescence et de la mort démyélinisation de plusieurs types de cellules 6.5. Le degré de récupération de la fonction peut dedix être corrélée à la mesure de la substance blanche ménagé au site de la lésion 7.

Les modèles animaux de SCI peuvent être utilisés à la fois pour étudier les réponses biologiques des tissus à des blessures et de tester des thérapies potentielles. En outre, un modèle animal utile d'une pathologie humaine a non seulement de reproduire certains aspects de cette condition, mais aussi doit offrir des avantages plus de l'observation clinique directe et expérience. Les modèles les plus largement utilisés de blessures de la moelle épinière impliquent une contusion ou une compression des blessures livré à la moelle épinière exposé chirurgicalement 8. Le développement d'une blessure contusion poids baisse contrôlée représente un jalon important dans l'histoire de la recherche SCI. Le centre de recherche sur la moelle épinière Ohio State University a poursuivi le défi technologique d'un dispositif qui peut être utilisé pour induire une compression particulière de la moelle épinière avec des paramètres d'impact contrôlées par un ordinateur neuf. Cela a été initialement conçu pour une utilisation wie rats; plus tard, il a été modifié pour se appliquer à 10 souris. Les avantages de ce type d'approche sont que les biomécanique de blessures peuvent être étudiés plus en profondeur et les paramètres de blessures peuvent être définis d'une manière plus complète afin d'obtenir un modèle expérimental reproductible, permettant ainsi une évaluation plus précise des effets de traitements testés sur le processus de récupération fonctionnelle.

De nombreuses études ont évalué les effets de la transplantation d'une variété de cellules souches dans des modèles 11 SCI. Nous avons récemment isolé adultes de neurones cellules souches de la zone sous-ventriculaire (SVZ) plusieurs heures après la mort du donneur de la souris 12-13. Cette procédure prévoit une population de cellules souches neurales, appelé après mortem précurseurs neuraux (PM-PNJ), qui semblent être avantageux dans une approche de la médecine régénérative pour guérir SCI. Dans cet article nous allons le démontrer: i) le protocole de marquage des cellules avec le traceur PKH26 vitale, ii) l'Surgical procédure à effectuer sur lésions médullaires traumatiques, et iii) la voie intraveineuse (iv) l'administration de cellules marquées. En outre, dans ce travail, nous démontrons que les cellules transplantées migrent vers les sites de lésion de la moelle épinière et se différencient principalement en protéines associée aux microtubules (MAP) 2 cellules positives. De plus, la différenciation se accompagne de la promotion d'une récupération stable de la fonction des membres postérieurs.

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Protocol

NOTE: Toutes les procédures ont été approuvées par le Comité d'examen de l'Université de Milan et ont rencontré les directeurs italiens pour les animaux de laboratoire en conformité avec la directive européenne du Communautés Novembre 1986 (86/609 / CEE).

1. Préparation des cellules destinés à la transplantation

REMARQUE: utiliser des cellules souches neurales entre le 5e et le 9e passage en culture de ces expériences; tester les cultures pour la prolifération et la capacité de différenciation avant d'être marqué pour la transplantation. Déterminer le degré de différenciation par immunocytochimie 12.

  1. Resuspendre les cellules à une concentration de 1 x 10 6 cellules / 150 ul (1 transplantation x 10 6 cellules par souris). Préparer au moins 1,2 x 10 6 cellules par souris, car un excès de cellules est nécessaire à des fins seringue de chargement.
  2. Laver les cellules trois fois en utilisant un milieu de cellules souches neurales 13 dans une fiole conique de 10 ml. Dans chaqueétape de lavage, les cellules précipitées par centrifugation (500 g pendant 5 min, RT).
  3. Compter les cellules avant l'essorage final.
  4. Centrifuger les cellules (500 g pendant 5 min), puis aspirer le surnageant, en faisant attention de ne pas enlever les cellules, mais ne laissant pas plus de 25 pi de surnageant.
  5. Préparer une suspension de cellules 2x par addition de 1 ml de diluant C au culot de cellules et remettre en suspension avec pipetage doux.
  6. Immédiatement avant la coloration, préparer une solution de colorant 2x (4 x 10-6 M) dans le diluant C par addition de 4 ul de la solution de colorant PKH26 d'éthanol à 1 ml de diluant C dans un tube et mélangez bien se disperser.
  7. Ajoutez rapidement les 1 ml de 2x suspension de cellules à 1 ml de 2x Dye Solution et immédiatement mélanger l'échantillon par pipetage (densité cellulaire finale sera 1,2 x 10 7 cellules / ml et 2 x 10-6 M PKH26).
  8. Incuber la suspension de cellules / colorant 1-5 min.
  9. Arrêter la coloration par addition d'un volume égal (2ml) de solution de BSA à 1% dans du HBSS et incuber pendant 1 min.
  10. Centrifuger les cellules (500 g pendant 10 min) et retirer délicatement le surnageant.
  11. Resuspendre le culot cellulaire dans 10 ml de HBSS et centrifugation (500 g pendant 5 min).
  12. Laver le culot de cellules deux fois de plus avec 10 ml de milieu complet pour assurer l'élimination de colorant non fixé.
  13. Remettre en suspension le culot cellulaire dans 10 ml de milieu complet à l'évaluation de la récupération des cellules, la viabilité des cellules et l'intensité de fluorescence. Si les cellules sont nécessaires pour la transplantation, laver et remettre en suspension dans une solution physiologique stérile à une concentration de 3,3 x 10 5 cellules / 50 ul.

2. Préparation pour l'intervention

  1. Équipements de chirurgie nettoyer et stériliser.
  2. Préparer la zone de la chirurgie en essuyant avec un agent aseptique. Mettre en place le dispositif IH Impactor.
  3. Préparer le matériel d'anesthésie: le trésor de gaz actif avec VetScav Pesage du filtre de périphérique, flux continu Chambre induction, Gene d'oxygènerateur, faible débit O 2 mètres pour les souris. Nettoyer la chambre d'induction et le masque utilisé pendant la chirurgie.
  4. Anesthésier animaux avec 2,5% (v / v) l'isoflurane en oxygène (1 L / min), et attendre 5 min après l'induction de l'écoulement de la drogue prenne effet. Vérifiez si les moustaches sont des contractions musculaires ou se il est lent retrait des membres postérieurs en réponse à pincer le coussinet plantaire. Au cours de la chirurgie, de réduire la concentration d'isoflurane à 2,0% (v / v) d'isoflurane dans de l'oxygène (1 litre / min).

3. Préparation de souris pour la chirurgie et la transplantation

  1. Gardez le mâle adulte CD1 souris (25-30 g) pendant au moins trois jours avant les expériences dans des conditions standard (22 ± 2 ° C, 65% d'humidité et de lumière artificielle entre 08h00-20h00).
    NOTE: L'ensemble de la procédure de la préparation chirurgicale pour suture prendra environ 40 minutes.
    1. Pour identifier l'animal, marquer la queue au moyen d'eau encre de couleur résistante.
  2. Utilisez un électric tondeuse pour couper les cheveux dorsale de la souris à partir du col, environ au niveau de T2, de la région lombaire.
  3. Stériliser la zone préparée avec une solution d'iodure et de l'éthanol (70% dans l'eau stérile).
  4. Traiter l'animal avec un sous cutanée (sc) injection de 200 ul de la gentamycine (1 mg / ml dans une solution saline stérile).
  5. Appliquer du lubrifiant ophtalmique aux deux yeux d'animaux pour éviter la dessiccation et injecter de la buprénorphine (sous-cutanée, 0,03 mg / kg) pour soulager la douleur.

4. laminectomie

  1. Passer la souris sur une plus chaud de glissement pour éviter le problème de l'hypothermie pendant la chirurgie. Placez l'animal avec la dorsale vers le haut.
  2. Faire une incision verticale avec un scalpel sur la région d'intérêt, à partir de T7 à T12.
  3. Maintenez la peau et un tampon de graisse superficielle en utilisant une pince standards (généralement situé dans l'espace entre la 5 ème et 6 ème processus dorsales thoraciques).
  4. Comptez le processus sous le navire comme T6puis passer à T7.
  5. Placer un peu d'incidence sous la face ventrale de la souris pour augmenter la courbure de la colonne vertébrale. Immobiliser la moelle épinière en le bloquant avec la pince Graefe.
  6. Couper les muscles paravertébraux bilatéralement à partir de T7 et T10 niveau vertébral en utilisant le scalpel jusqu'à ce que la surface dorsale des contacts de la lamina de pointe de scalpel.
  7. Utilisez le scalpel pour cocher la jonction de T7 jusqu'à T10. Arrêtez-vous dans l'espace entre T8 et T9 saillies épineuses. Couper les tissus entre T8-T9 et T9-T10 avec les ciseaux micro.
    1. Utilisez le Rongeur de retirer le processus de T9. Exposer la jonction par attentivement raclant la couche musculaire avec les ciseaux micro. Continuez jusqu'à ce que l'os est exposé.
  8. Utilisez la pince pour retirer les muscles de la lamina et ouvrir un petit espace entre les vertèbres. Insérez délicatement les ciseaux micro sous l'os, couper la lame sur les deux côtés et enlever cette partie avec une pince.
  9. Retirez la lame avec le forceps pour exposer le cordon. Veillez à ne pas laisser des fragments d'os gratuits ou déchiquetés derrière; retirez-les avec le Rongeur.
  10. Utilisez les petites pinces d'extrémité pour retirer le périoste ainsi que les fragments d'os ou des muscles qui peuvent être près de l'incision.
  11. Retirer la moitié supérieure du processus de dorsale T9 et procéder au protocole de l'appareil IH Impactor.

5. Protocole de périphériques IH Impactor (contusion)

  1. Placer la souris dans le milieu de la plate-forme de stabilisation de l'appareil impacteur IH.
  2. Bloquer l'animal avec les deux dents des pinces liées à la plate-forme de stabilisation par deux bras de positionnement commun (bras gauche de la vertèbre thoracique, le bras droit pour vertèbre cervicale).
  3. Utilisez le bras rostrale à saisir le bord latéral du corps vertébral rostrale (T8).
  4. Manipuler le bras caudale de la même manière à saisir le corps vertébral de T10.
  5. Placez la plate-forme de stabilisation dans l'appareil et réduire la pointe (diamètre 0,75mm) aussi près que possible le câble sans le toucher.
  6. Soulevez la pointe trois tours complets avant de lancer l'impact.
  7. Effectuer la contusion avec l'impacteur réglé pour fournir une force de 60 à 100 mm Kdyn / sec.

6. Les sutures et les soins post-

  1. Suturer l'incision avec un fil de suture absorbable 4/0. Couvrir la moelle épinière exposée à l'endroit de la lame enlevée; suturer le tissu aux extrémités de la coupe au moyen d'une petite aiguille. Mettre les deux points ci-dessus et immédiatement sous le site de l'exposition de la moelle épinière.
  2. Fermez la peau à l'aide de deux ou trois clips Reflex sans pincement au large des muscles sous-jacents.
  3. Hydrater le post-opératoire de la souris avec 2 ml de solution saline injection sous-cutanée dans le bas du dos.
  4. Placez la souris dans une cage retour préchauffé pour éviter l'hypothermie pendant la reprise chirurgicale. La place des cages sur des coussins chauffants.
  5. Surveiller les souris au cours de la post-traumatique de la phase aiguë en cochant lataille de la vessie, le fil de suture et le poids de l'animal deux fois par jour. Pressez délicatement la vessie (deux fois par jour pendant 7 jours) pour éviter les infections (l'urine pourrait être nuageux, sanglante ou contenant des précipités) de l'appareil urinaire.
  6. Traiter les souris une fois par jour avec une injection de solution saline (2 ml pendant deux jours d'injection sc post-chirurgie) et antibiotique (gentamicine 0,2 ml; injection sc) pendant cinq jours après la lésion.
  7. Traiter les souris pour l'analgésie post-opératoire avec la buprénorphine (0,1 mg / kg; deux fois par jour) pendant 3 jours après la lésion.

7. veine caudale injection de cellules

REMARQUE: Dans l'étape suivante de la procédure de l'injection des cellules dans la veine caudale est démontrée. Les cellules peuvent également être administrés avec une greffe intraspinale en utilisant un cadre stéréotaxique 15 à 16, ou dans la cisterna magna 17. Il est important de noter que d'autres types de cellules ont pu être transplantées avec ce procédé, telles que les cellules stromales mésenchymales(par exemple, des cellules souches mésenchymateuses de moelle osseuse, des cellules souches d'origine adipeuse, des cellules de liquide amniotique). En outre, d'autres options de traitement telles que les nanoparticules peuvent être injectés dans la veine caudale après la blessure de la moelle épinière.

  1. Utilisez 70% d'éthanol et PBS pour nettoyer l'aiguille avant utilisation. Manipulez l'aiguille et la seringue uniquement avec des gants stériles.
  2. Resuspendre les cellules dans le tube et la charge 75 pi de cellules de test dans une seringue 0,3 ml (29 aiguille G et 0,33 cc seringue).
  3. Assurez-vous qu'aucun des bulles sont présentes au sein de la suspension cellulaire. Conserver la seringue en position horizontale pour éviter la sédimentation des cellules.
  4. Placez la souris sous la lampe chauffante pour dilater les veines de la queue.
  5. Prenez la souris et tirez-le doucement dans le dispositif de retenue de la souris pour visualiser la veine de la queue latérale par une ligne bleue étroite.
  6. Nettoyez la queue avec un tampon imbibé d'alcool. Une fois la veine est visualisée, saisir la veine de la queue entre le majeur et le pouce de la main gauche.
  7. Apportez de l'aiguille à la surface à un angle de 15 ° de l'horizon et se assurer que le biseau est écoulé.
  8. Injecter 50 ul de cellules à un débit de 0,33 pl / s. Après l'injection, retarder le retrait de l'aiguille de 10 sec. Rétracter l'aiguille lentement et prêter attention à la possible efflux de suspension cellulaire.
  9. Nettoyez la seringue comme dans l'étape 7.1 entre les charges.

8. tests comportementaux et Hind Limb Fonction

  1. Placez la souris dans le champ ouvert.
  2. Évaluer la fonction locomotrice et la récupération de membre postérieur après une contusion à l'essai en plein champ selon l'échelle de la souris Basso (BMS) 18.
    NOTE: La fonction neurologique doit être évaluée périodiquement, à partir de 3 jours après la blessure pour 4 semaines 18.

9. Perfusion

  1. A la fin de la période expérimentale, anesthésier les animaux par une injection intraperitoneale de pentobarbital sodique (65 mg / kg). Utilisez pincées d'orteil à évaluate niveau de l'anesthésie et de procéder seulement après la souris ne répond pas aux stimuli nocifs.
  2. Retenir l'animal dans une position couchée sur un plan chirurgical.
  3. Couper à travers le tégument et la paroi abdominale juste en dessous de la cage thoracique. On sépare la membrane du foie.
  4. Utilisez les ciseaux pour couper la membrane pour exposer la cavité pleurale.
  5. Couper les côtés de la cage thoracique jusqu'à ce que les clavicules.
  6. Utilisez les pinces hémostatiques pour serrer le cartilage xiphoïde et placez la pince hémostatique sur la tête.
  7. Maintenez le tiers inférieur du cœur sur un plan transversal avec la pince. Insérez l'aiguille dans le ventricule gauche.
  8. Utilisez une pince hémostatique pour serrer le cœur. Cela garantit l'aiguille et empêche les fuites.
  9. Utilisez les ciseaux pour couper l'oreillette droite.
  10. Laisser le PBS à pompe (18 ml / min) par l'animal. Maintenir cette pression pendant toute la période de perfusion de tampon (3-4 min, ce qui correspond à environ 70 ml de PBS). Continuez jusqu'à ce que le cœur est propre.
  11. Mettre le robinet d'arrêt pour permettre le fixateur (paraformaldehyde à 4% dans l'eau distillée, 4% PFA) à travers la pompe. Laisser le PFA 4% à pomper par l'animal pendant environ 8-10 min (300 ml). Augmenter progressivement la pression pour atteindre un maximum de 30 ml / min. Un foie durci est la meilleure indication d'une perfusion de succès.

10. Collecte et traitement des tissus, l'histologie et Iimmunohistochemistry

  1. Disséquer la moelle épinière de T5 à L1. Puis post-fixer le tissu dans 6 ml dans 4% PFA (O / N à 4 ° C).
  2. Mettre le même tissu dans une solution à 30% de saccharose pendant 72 heures à 4 ° C afin de le protéger et cryo pour empêcher la formation de cristaux pendant la congélation.
  3. QUICK FREEZE le cordon avec de la glace sèche et le stocker à -80 ° C.
  4. L'article au moyen d'un cryostat à une épaisseur de 15 um et collecter les sections sur des lames de verre et continuer à immunocytochimie.
  5. Rincer sections avec 200 pi de PBS pour chaque slide (3 fois, 5 minutes à chaque fois, RT).
  6. Perméabiliser chaque lame avec 200 ul de 10% de NGS et 0,2% de Triton X-100 dans du PBS pendant 1 heure à température ambiante.
  7. Rincer sections avec 200 pi de PBS pour chaque lame (3 fois, 5 minutes à chaque fois, RT).
  8. Bloquer les sites non spécifiques avec 200 ul de solution de blocage de coulisseau (5%; NGS 0,1% de Triton X-100 dans du PBS) pendant 30 min (RT).
  9. Incuber chaque lame avec 200 ul d'anticorps primaires O / N à 4 ° C (anticorps diluer dans 5% de NGS; 0,1% de Triton X-100 dans du PBS).
  10. Laver les sections avec 200 pi de PBS pour chaque coulisseau (3 fois, 5 minutes à chaque fois; RT).
  11. Incuber avec des anticorps secondaires appropriés pendant 2 heures à température ambiante.
  12. Laver les sections avec 200 pi de PBS pour chaque coulisseau (3 fois, 5 minutes à chaque fois; RT).
  13. noyaux de tache avec 200 ul de 4 ', 6-diamidin-2-phenilindole (DAPI) (1 ug / ml de concentration finale, 10 minutes à température ambiante).
  14. Monter en utilisant le réactif FluorSave et analyser par microscopie confocale.
    NOTE: Dansdéterminations de contrôle, des anticorps primaires doivent être supprimées et remplacées avec des concentrations équivalentes de IgG non liée de la même sous-classe. Protein deux anticorps primaire associée aux microtubules a été utilisé.

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Representative Results

Le nombre total de cellules transplantées est 1 x 10 6 cellules et a été divisé en trois injections consécutives dans la veine de la queue. Nous avons administré 3,3 x 10 5 cellules dans 50 ul de solution tampon de phosphate (PBS). La première injection a été réalisée dans les 30 minutes après la blessure, la deuxième 6 heures plus tard et les dernières 18 heures après la lésion. Le choix d'un délai de 18 h après l'administration de SCI PM-NPC a été déterminée par la perméabilité optimale de la barrière hémato-encéphalique 14 à ce moment. Pour évaluer l'effet de l'injection de cellules souches, il serait utile d'avoir positives laminectomies animaux de contrôle (n = 14) et du PBS injecté animaux de contrôle négatif (n = 14).

PM-PNJ améliorer la récupération du membre postérieur Fonction, migrent vers le site de la lésion et de se différencier en-2 CARTE cellules positives

La contusion T9 a causé la perte transitoire de la fonction des membres postérieurs suivi d'un g progressiveradual récupération (Figure 1). Dans 2-3 semaines, les souris PBS blessés traités améliorées et la fonction du membre postérieur atteint 3 points de BMS (correspondant à plantaire mise de la patte avec ou sans soutien de poids ou occasionnelle, fréquente ou cohérente dorsale pas à pas, mais pas plantaire marcher 18) . Au lieu de cela, dans la même période d'observation, les souris traitées avec blessés PM-PNJ ont montré une récupération plus élevée, atteignant 4,5 points de BMS (correspondant à fréquent ou cohérente plantaire intensification sans coordination ou plantaire fréquente ou conforme pas à pas avec une certaine coordination). L'amélioration du comportement était particulièrement évident dans la période entre le jour 7 et 14 jours après la SCI. Aucun signe d'allodynie comme membre antérieur hypersensibilité 19 ont été enregistrées à tout moment dans ne importe quel groupe expérimental pendant toute la période d'observation de 30 jours.

La plupart greffé PM-PNJ, marqué avec PKH26 (Figure 2), accumulées sur les bords de lalésion formant des grappes (Figure 3) dès les premiers jours de leur administration. Ensuite, les cellules transplantées ont migré le long des bords de la lésion et de manière plus diffuse où ils différenciés, en supposant progressivement la conformation asymétrique cellulaire des neurones. À 30 jours après la lésion et la transplantation, le corps cellulaire du PM-PNJ augmenté en taille et dans la plupart des cellules dendritiques comme processus était évidente et entièrement immunocolorée par les anticorps spécifiques à la MAP-2 (figure 4). La réalisation de la complexité morphologique et la positivité à MAP2 par transplanté PM-PNJ ne est probablement pas dû à la fusion avec survivant neurones de la moelle épinière d'accueil, ce qui est évident dans leur morphologie clairement différenciés et l'absence de deux noyaux dans une cellule unique marqué.

Figure 1
Figure 1. PM-PNJ améliorer RECOV fonctionnelleEry chez les animaux blessés. La locomotion en plein champ était le test utilisé pour la détermination de la récupération de la fonction motrice 18. Les animaux ont été testés la veille de la contusion et a marqué 9 points dans l'échelle BMS. Au premier poste de lésion jours chez les animaux lésés, le score BMS a diminué à zéro. La récupération de la fonction de membre postérieur de souris lésé a montré une amélioration remarquable et durable à long lorsque les animaux ont été traités avec PM-PNJ. L'analyse a été réalisée en double-aveugle, et chaque groupe était composé de 14 animaux. Les valeurs représentent la moyenne ± SEM. Nous avons déterminé les différences statistiques par des moyens de test ANOVA suivi par un post-test de Tukey. *** P <0,001; ** P <0,01 vs PBS.

Figure 2
Figure 2. PKH26 étiquetage des PM-PNJ. Après procédure de labellisation avec PKH26, PMNPCS sont visu nalisé avec l'image en direct microscope EVOS fl et microphotographie a été prise avec le même instrument (barre d'échelle = 50 um). Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3
Figure 3. Localisation des PM-PNJ dans le site de la lésion. PKH26 marqué PM-PNJ (rouge) sont présents tout au long des bords de la site de la lésion à 30 jours après leur injection iv. L'image est représentative pour une souris, mais des images similaires ont été obtenus pour au moins cinq animaux (barre d'échelle = 50 um). Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Figure 4. expression de MAP2 dans transplanté PM-PNJ. La plupart PKH26 marqué PM-PNJ (rouge) a acquis une forme de neuronale comme avec les processus de dendritiques-like et avait différencié MAP-2 cellules positives (vert). Noyaux sont colorés en bleu (DAPI). L'image est représentative pour une souris, mais des images similaires ont été obtenus pour au moins cinq animaux (barre d'échelle = 25 um). Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Discussion

Dans cet article, nous avons décrit une méthode pour obtenir un modèle reproductible de blessures de la moelle épinière en utilisant un impacteur Horizon Infini à une force de 70 Kdyne (sévère). En utilisant une force plus importante paradigme (80 Kdyne), nous pouvons causer une blessure plus grave que, malheureusement, est associée à une mortalité des souris élevées. Afin d'éviter ce problème, nous choisissons généralement un paradigme de force modérée (70 Kdyne) qui est associée à une lésion reproductible avec une reprise progressive de la fonction et de la mortalité plus faible. Pour produire une telle blessure stable, il est très important de prêter une attention particulière à la fixation correcte de l'animal sur la plate-forme de frappe; en particulier la moelle épinière doit être centrée à la pointe de l'impacteur, et les deux bras de l'impacteur doit être parallèle à l'autre. En outre, une attention particulière doit être prise dans le blocage de l'animal avec la pince de frappe, lorsque les vertèbres peut être écrasé et le cordon peut être endommagée par les pointes de la pince. Le positionnement de l'animal après la laminectomie est critique, et de la manipulation des animaux au cours de cette procédure est également très important. Une attention particulière doit aussi être accordée à la procédure de laminectomie, qui doit toujours être effectuée sur le même site et pour la même extension. Lorsque ces procédures sont effectuées lors de laminectomie, une autre question méthodologique à suivre est la réduction du risque d'endommager le cordon lorsque l'aide de micro-ciseaux, Rongeur, ou une pince pour couper les os et libérer le cordon à travers la suppression de la lame, pour éliminer le restante saillies et des fragments d'os latéraux, et de supprimer le périoste. L'utilisation de micro-ciseaux et Rongeur avec des conseils pointant vers le haut permettra de réduire le risque de rencontrer des problèmes précités.

Une limitation importante de cette méthode est la forte probabilité que les animaux peuvent développer des infections urinaires graves internes et externes dans la période post-blessure. L'infection externe est due à l'incapacité des souris lésés à move avec le soutien de poids du membre postérieur. En revanche, l'infection urinaire interne peut être provoquée par l'incapacité des souris blessées indépendamment d'uriner. Afin d'éviter ces problèmes, il est absolument nécessaire d'injecter les animaux avec l'antibiotique indiquée et pour vérifier la taille de la vessie deux fois par jour pendant les procédures de protection des animaux de la première semaine. L'état d'hydratation et le poids doivent être vérifiés attentivement au cours des trois premières semaines après lesioning.

L'application des procédures décrites, nous avons pu obtenir des déficits reproductibles de la fonction des membres postérieurs qui ont été évalués par un test comportemental spécifique développé par Basso et ses collègues (BMS) 18. Immédiatement après la blessure de la perte de fonction des membres postérieurs est complète, qui est suivie par une reprise graduelle qui est la plus importante durant les 2-3 premières semaines. La récupération comportementale atteint un niveau plus élevé lorsque les souris lésés ont été traités avec des adultes PM-PNJ (Figure 1 (figure 3). Nous avons estimé que le nombre total de vitale greffé PM-PNJ est supérieure aux CES greffés et NSCs adultes comme indiqué précédemment par notre groupe de recherche 20-21. À quatre semaines après lesioning et la transplantation, la plupart des PM-PNJ ont un corps plus grands et possèdent étendues processus dendritiques comme qui sont entièrement immunocolorées par les anticorps spécifiques à la MAP-2 (figure 4).

Le principal avantage de ce modèle de lésion de la moelle épinière est la normalisation de la blessure. Une courbe liée au temps reproductible de la récupération des membres postérieurs de la fonction est également atteint. Cette reproductibilité permet de définir études de preuve de principe pour des traitements étudiés, y compris la transplantation de cellules pour la médecine régénérative studies avec un nombre réduit de cas. De plus, plusieurs aspects de la physiopathologie de la blessure de la moelle épinière peuvent être analysées plus en détail.

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Disclosures

Les auteurs déclarent aucun intérêt financier concurrence.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PKH26GL-1KT  Sigma 091M0973
Infinite horizon (IH) Impactor device  Precision Systems and Instrumentation, LLC Model 0400 Serial 0171
Gentamycin 10 mg/ml Euroclone ECM0011B 1 mg/ml in sterile saline solution
Isoflurane-Vet 250 ml Merial B142J12A
Blefarolin POM OFT 10 g
Slide Warmer 2Biological Instruments HB101-sm-402
Scalpel, size 10 Lance Paragon 26920
Small Graefe Forceps 2Biological Instruments 11023-14
Rongeur Medicon Instruments 07 60 07
Micro scissors 2Biological Instruments 15000-00
Absorbable sutures (4/0) Safil Quick C0046203
Hemostat 2Biological Instruments 13014-14
Reflex 7 wound clip applicator 2Biological Instruments 12031-07
7 mm Reflex wound clips 2Biological Instruments 12032-07
NGS Euroclone ECS0200D
Triton X 100 Merck Millipore 1086431000
Anti Microtubule Assocoated Protein  (MAP) 2 Millipore AB5622
Alexa Fluor 488 Invitrogen A11008
FluorSave Reagent  Calbiochem 345789
Neural stem cells medium DMEM-F12 medium (Euroclone) containing 2 mm l-glutamine (Euroclone), 0.6% glucose (Sigma-Aldrich), 9.6 gm/ml putrescine (Sigma-Aldrich), 6.3 ng/ml progesterone (Sigma-Aldrich), 5.2 ng/ml sodium selenite (Sigma-Aldrich), 0.025 mg/ml insulin (Sigma-Aldrich), 0.1 mg/ml transferrin (Sigma-Aldrich), and 2 μg/ml heparin (sodium salt, grade II; Sigma-Aldrich), bFGF (human recombinant, 10 ng/ml; Life Technologies) and EGF (human recombinant, 20 ng/ml; Life Technologies) 
DMEM-F12 Euroclone ASM5002
l-glutamine Euroclone ECB3000D
glucose Sigma-Aldrich G8270-100G
putrescine Sigma-Aldrich P5780-25G
progesterone Sigma-Aldrich P6149-1MG
Sodium-selenite Sigma-Aldrich S9133-1MG
transferrin Sigma-Aldrich T 5391
Insulin Sigma-Aldrich I1882
Heparin sodium-salt Sigma-Aldrich H0200000
bFGF Life Technology PHG0024
h-EGF Life Technology PHG6045
Syringe 0.33 cc 29 G Terumo MYJECTOR 
buprenorphine Schering Plough SpA TEMGESIC
eye gel Bausch & Lomb LIPOSIC

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References

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Carelli, S., Giallongo, T., Gerace, C., De Angelis, A., Basso, M. D., Di Giulio, A. M., Gorio, A. Neural Stem Cell Transplantation in Experimental Contusive Model of Spinal Cord Injury. J. Vis. Exp. (94), e52141, doi:10.3791/52141 (2014).

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