Summary
Ryggmargsskade er en traumatisk tilstand som forårsaker alvorlig sykelighet og høy dødelighet. I dette arbeidet vil vi beskrive i detalj en -kontusjon modell av ryggmargsskade i mus etterfulgt av en transplantasjon av nevrale stamceller.
Abstract
Ryggmargsskade er en ødeleggende klinisk tilstand, preget av et kompleks av nevrologiske dysfunksjoner. Dyremodeller av ryggmargskade kan brukes både for å undersøke de biologiske responser på skade og for å teste potensielle terapier. Kontusjon eller kompresjonsskade levert til kirurgisk eksponert ryggmarg er de mest brukte modeller av patologi. I denne rapporten den eksperimentelle kontusjon er utført ved hjelp av Infinite Horizon (IH) Impactor enhet, som tillater etablering av en reproduserbar skade dyremodell gjennom definisjon av spesifikke skader parametere. Stamcelletransplantasjon er ofte betraktet som en potensielt nyttig strategi for herding denne ødeleggende tilstanden. Tallrike studier har evaluert effekten av transplantasjonen en rekke av stamceller. Her viser vi en tilpasset metode for ryggmargsskader etterfulgt av halevenen injeksjon av celler i CD1 mus. Kort sagt, vi gir prosedyrer for: i) celle merking with en viktig sporstoff, ii) pre-operativ behandling av mus, iii) gjennomføring av en contusive ryggmargsskade, og iv) intravenøs administrering av post mortem nevrale forløpere. Dette kontusjon modellen kan benyttes til å evaluere effekt og sikkerhet av stamcelletransplantasjon i en regenerativ medisin tilnærming.
Introduction
En ryggmargsskade (SCI) er den vanligste skaden forårsaket av høy energi traumer som motorkjøretøy ulykker, fall, sport og vold en. Ved alvorlig SCI, ødelegger skade kraft eller skader nevrale vev, forårsaker plutselig tap av nevrologisk funksjon. Traumatisk ryggmargsskade oppstår ofte hos unge voksne mellom 10 og 40 år. Det påvirker i stor grad pasientens psykiske og fysiske tilstand og fører til enorme økonomiske konsekvenser for samfunnet 2. Behandlingen tilnærming i den akutte fasen er ofte begrenset til en høy dose med kortikosteroider, kirurgisk stabilisering og dekompresjon å muligens dempe ytterligere skade 3-4, men rollene til disse metodene på bevegelses utvinning etter SCI er fortsatt kontroversielt. I tillegg til akutt vev tap, den traumatiske skader og aktivering av sekundære mekanismer for degenerasjon årsak demyelinisering og død av flere celletyper 5-6. Graden av gjenvinning av funksjon kan avti være korrelert til omfanget av spart hvit substans på skadestedet 7.
Dyremodeller av SCI kan brukes både for å undersøke de biologiske responsene til vev mot skade og for å teste potensielle terapier. Dessuten har en nyttig dyremodell av en human patologi ikke bare å gjengi noen aspekter av denne tilstand, men må også gi fordeler fremfor direkte klinisk observasjon og eksperiment. De mest brukte modeller av ryggmargsskade involvere kontusjon eller kompresjonsskade levert til kirurgisk eksponert ryggmarg 8. Utviklingen av en kontrollert vekt-slipp kontusjon skade representerer en viktig milepæl i historien av SCI forskning. The Ohio State University ryggmarg forskningssenter har fulgt den teknologiske utfordringen med en enhet som kan brukes til å fremkalle en bestemt kompresjon av ryggmargen med parametere for påvirkning som kontrolleres av en datamaskin 9. Dette ble opprinnelig utviklet for bruk with rotter; senere ble endret til å gjelde mot mus 10. Fordelene med en slik tilnærming er at de biomekaniske av skade kan studeres mer i dybden og parameterne for skade kan defineres på en mer fullstendig måte for å oppnå en reproduserbar eksperimentell modell, og derfor tillater en mer nøyaktig evaluering av virkningene av testet behandlinger på funksjonell gjenopprettingsprosessen.
Mange studier har evaluert transplantasjons virkningene av en rekke av stamceller i SCI-modeller 11. Vi har nylig isolert voksen nevrale stamceller fra under Ventrikulært Zone (SVZ) flere timer etter døden av musen donor 12-13. Denne fremgangsmåten gir en populasjon av nevrale stamceller, kalles post mortem nevrale forløpere (PM-NPC), som synes å være fordelaktig i en regenerativ medisin tilnærming for herding SCI. I denne artikkelen vil vi demonstrere: i) protokollen for celle merking med den vitale tracer PKH26, ii) Surgical prosedyre å utføre på traumatisk ryggmargsskade, og iii) intravenøs (iv) administrasjon av merkede celler. Videre i dette arbeidet viser vi at transplanterte cellene migrerer til ryggmargs lesjon nettsteder og differensiere stort sett inn microtubule assosiert protein (MAP) 2 positive celler. Videre er differensieringen ledsages av å fremme et stabilt utvinning av bakben funksjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
MERK: Alle prosedyrene ble godkjent av kontrollkomitéen ved Universitetet i Milano og møtte de italienske Retningslinjer for forsøksdyr i samsvar med europeiske fellesskaps direktiv datert November 1986 (86/609 / EØF).
1. Fremstilling av celler for transplantasjon
MERK: Bruk nevrale stamceller mellom 5. og 9. passasje i kultur for disse eksperimentene; teste kulturer for spredning og differensiering evne før å bli stemplet for transplantasjon. Fastslå omfanget av differensiering av immunocytokjemi 12.
- Resuspender cellene til en konsentrasjon på 1 x 10 6 celler / 150 ul (transplantasjon 1 x 10 6 celler per mus). Forbered minst 1,2 x 10 6 celler pr mus, fordi et overskudd av celler som er nødvendig for å sprøyte lasting formål.
- Vask cellene 3 ganger ved anvendelse av neurale stamcellemedium 13 i en 10 ml konisk ampulle. I hvertvasketrinn, utfelte cellene ved sentrifugering (500 x g i 5 min, RT).
- Telle cellene før sentrifugering.
- Sentrifuger celler (500 xg i 5 min), og deretter aspirer supernatanten, være forsiktig med å fjerne eventuelle celler, men forlater ikke mer enn 25 ul av supernatant.
- Tilbered en 2x cellesuspensjon ved tilsetning av 1 ml fortynningsmiddel C til cellepelleten og resuspender med forsiktig pipettering.
- Umiddelbart før farging, forberede en 2x fargeløsning (4 x 10-6 M) i fortynningsmiddel C ved å tilsette 4 ul av PKH26 etanol fargeløsning til 1 ml fortynningsmiddel C i et rør og blandes godt for å dispergere.
- Hurtig tilsett 1 ml 2x cellesuspensjon til 1 ml av 2x fargeløsning og umiddelbart blandes prøven ved å pipettere (endelig celletetthet vil være 1,2 x 10 7 celler / ml og 2 x 10-6 M PKH26).
- Inkuber celle / fargestoff suspensjon i 1-5 minutter.
- Stopp farging ved tilsetning av et likt volum (2-ml) i 1% BSA-oppløsning i HBSS og inkuberes i 1 min.
- Sentrifuger celler (500 xg for 10 min) og forsiktig fjerne supernatanten.
- Resuspender cellepelleten i 10 ml HBSS og sentrifuge (500 x g i 5 min).
- Vask cellepelleten to ganger med 10 ml komplett medium for å sikre fjerning av ubundet fargestoff.
- Resuspender cellepelleten i 10 ml fullstendig medium for vurdering av celle utvinning, celleviabilitet og fluorescens-intensitet. Hvis det trenges celler for transplantasjon, vaske og resuspendere dem i en steril fysiologisk oppløsning ved en konsentrasjon på 3,3 x 10 5 celler / 50 ul.
2. Forberedelse til kirurgi
- Rengjør og steriliser kirurgi utstyr.
- Forberede operasjonen området ved å tørke med en aseptisk agent. Sett opp IH Impactor enheten.
- Forberede anestesi utstyr: Active Gas Scavenger med VetScav Filter Veiing Device, kontinuerlig flyt Induksjon Chamber, Oxygen GeneOperatøren, Low Flow O 2 Meter for Mus. Rengjøre induksjonskammeret og masken som brukes under operasjonen.
- Bedøve dyr med 2,5% (v / v) isofluran i oksygen (1 L / min), og vent 5 min etter flyten induksjon for at stoffet skal tre i kraft. Sjekk om whiskersene rykninger eller hvis det er treg hind lem tilbaketrekking respons på klyping fotbladet. Under operasjonen, reduserer isofluran konsentrasjon til 2,0% (v / v) isofluran i oksygen (en L / min).
3. Utarbeidelse av mus for kirurgi og transplantasjon
- Hold den mannlige voksne CD1 mus (25-30 g) i minst tre dager før forsøkene under standardforhold (22 ± 2 ° C, 65% luftfuktighet, og kunstig lys mellom 08:00 til 08:00).
MERK: Hele prosedyren fra kirurgisk forberedelse til suturering vil ta ca 40 min.- Å identifisere dyret, merk halen ved hjelp av vann motstandsdyktig farget blekk.
- Bruk en elekic clipper å kutte den dorsale hår av mus fra halsen, om i det hele T2-nivå, for å lumbale området.
- Steriliser forberedt område med en jodløsning og etanol (70% i sterilt vann).
- Behandler dyret med en sub-kutan (SC) injeksjon av 200 mikroliter gentamycin (1 mg / ml i steril saltløsning).
- Påfør oftalmisk smøremiddel til både dyr øyne for å hindre uttørking og injisere buprenorfin (subkutant, 0,03 mg / kg) for å lindre smerte.
4. laminectomy
- Plasser musen på et lysbilde varmere for å unngå problemet med hypotermi under operasjonen. Plasser dyret med ryggsiden opp.
- Gjør en loddrett snitt med skalpell over regionen av interesse, fra T7 til T12.
- Hold i huden og overflatefettpute ved anvendelse av standard tang (vanligvis finnes i mellomrommet mellom den 5. og 6. dorsal thorax prosesser).
- Telle prosessen under karet som T6deretter flytte til T7.
- Plasser en liten peiling under ventral side av musen for å øke krumning av ryggraden. Immobilisere ryggmargen ved å blokkere den med Græfe tang.
- Skjær paravertebral muskler bilateralt fra T7 og T10 ryggvirvel nivå ved hjelp av skalpell til dorsalflate lamina kontakter skalpell tips.
- Bruk skalpell for å krysse av i krysset fra T7 til T10. Stopp i rommet mellom T8 og T9 spiny fremspring. Skjær vev mellom T8-T9 og T9-T10 med mikro saks.
- Bruk rongeur å fjerne T9 prosessen. Expose krysset ved forsiktig skrape bort muskelen laget med mikro saks. Fortsette inntil bein er utsatt.
- Bruk pinsett til å fjerne muskler fra lamina og åpne en liten plass mellom ryggvirvlene. Sett forsiktig mikro saks under bein, kutte lamina på begge sider, og fjerne denne delen med pinsett.
- Ta av lamina med forceps å utsette ledningen. Pass på å ikke la noen gratis eller hakkete bein fragmenter bak; fjerne dem med rongeur.
- Bruk liten spiss tang for å fjerne periosteum samt eventuelle beinfragmenter eller muskler som kan være i nærheten av snittet.
- Fjern den øverste halvdelen av T9 rygg prosessen og fortsette til IH Impactor enhet protokollen.
5. IH Impactor Device Protocol (Kontusjon)
- Plassere musen i midten av stabiliseringsplattform av IH Impactor enheten.
- Blokkere dyret med de to tenner tang i forbindelse med stabilisering plattformen ved to felles posisjoneringsarmer (venstre arm for thorax vertebra, høyre arm for halsvirvelen).
- Bruk rostralt arm for å gripe sidekanten av den rostrale virvellegemet (T8).
- Manipulere hale arm på samme måte for å forstå T10 ryggvirvel kroppen.
- Plasser stabilisering plattformen i enheten og senke spissen (diameter 0,75mm) som nær ledningen som mulig uten å berøre den.
- Løft spissen tre hele omdreininger før du starter virkningen.
- Utfør -kontusjon med anslags satt til å levere en kraft på 60 kdyn ved 100 mm / sek.
6. Suturer og Post-omsorg
- Sutur snittet med en 4/0 absorberbare sutur tråden. Dekke utsatte ryggmargen på stedet av fjernet lamina; sutur vev ved endene av snittet ved hjelp av en liten nål. Sett de to sting rett over og under området av ryggmargen eksponering.
- Lukk huden ved hjelp av to eller tre Refleks klipp uten å knipe av de underliggende muskler.
- Hydrat mus etter operasjonen med 2 ml saltvannsoppløsning injisert subkutant i den nedre ryggen.
- Plasser musen tilbake i en forvarmet bur for å unngå hypotermi under kirurgisk utvinning. Plasser bur på varmeputer.
- Overvåke mus i akuttfasen etter skade ved å sjekkeStørrelsen blære, suturen og dyret vekt to ganger om dagen. Klem forsiktig blære (to ganger om dagen i 7 dager) for å unngå urinveis er infeksjoner (urin kan være skyet, blodig eller inneholder eventuelle utfellinger).
- Behandle mus en gang om dagen med en saltoppløsning injeksjon (2 ml i to dager etter operasjonen sc injeksjon) og antibiotika (Gentamycin 0,2 ml; sc injeksjon) i fem dager etter skade.
- Behandle mus for postoperativ analgesi med buprenorfin (0,1 mg / kg, to ganger om dagen) i 3 dager etter skade.
7. Tail Vein Injeksjon av celler
NB: I det følgende trinn av fremgangsmåten for å injisere cellene i halevenen demonstreres. Celler kan også gis med en intraspinalt transplantasjon ved hjelp av en stereotaxic ramme 15-16, eller inn i cisterna magna 17. Det er viktig å huske på at andre celletyper kan bli transplantert med denne metode, for eksempel mesenkymale stromaceller(f.eks, benmarg stamceller, adipose avledet stamceller, fostervann celler). Videre kan andre behandlingstilbud som nanopartikler injiseres via nålevenen etter ryggmargsskade.
- Bruke 70% etanol og PBS for å rense nålen før bruk. Håndtere nålen og sprøyten bare med sterile hansker.
- Resuspender cellene i testrøret og lasten 75 ul av cellene inn i en 0,3 ml sprøyte (29 G nål og 0,33 cc sprøyte).
- Pass på at ingen luftbobler inne i cellen suspensjon. Oppbevar sprøyten i en horisontal stilling for å unngå bunnfelling av cellene.
- Plasser musen under varmelampe for å utvide hale årer.
- Grab musen og dra det forsiktig inn i muserainer å visualisere den laterale halevenen som en smal blå linje.
- Rengjør halen med en spritserviett. Når venen visualiseres, ta tak i halevenen mellom langfingeren og tommelen på venstre hånd.
- Ta nålen til overflaten på en 15 ° vinkel fra horisonten og sørge for at skrå er opp.
- Injiser 50 ul av celler med en hastighet på 0,33 mL / sek. Etter injeksjonen forsinke tilbaketrekning av nålen etter 10 sek. Trekke nålen sakte og ta hensyn til den mulige utstrømming av cellesuspensjon.
- Rengjøre sprøyten som i trinn 7.1 mellom belastninger.
8. Behavioral Tester og Hind Limb Funksjon
- Plasser musen i det åpne feltet.
- Evaluere bevegelsesfunksjon og bakben gjenoppretting etter kontusjon med den åpne felttest i henhold til Basso mus skala (BMS) 18.
MERK: Nevrologisk funksjon må vurderes med jevne mellomrom, fra dag 3 etter skade for 4 uker 18.
9. Perfusjons
- Ved slutten av forsøksperioden, bedøve dyrene ved hjelp av en intraperitoneal injeksjon av natriumpentobarbital (65 mg / kg). Bruk tå klyper til evaluate anestesi nivå, og fortsette etter at musen ikke svarer til de skadelige stimuli.
- Beherske dyret i liggende stilling på en operasjon flyet.
- Skjær gjennom integument og bukveggen like under brystkassen. Separer membranen fra leveren.
- Bruk saks til å klippe membranen for å eksponere pleurahulen.
- Skjær sidene av brystkassen til kragen bein.
- Bruk hemostats å klemme xifoid brusk og plasser pinsetten over hodet.
- Hold den nedre delen av hjertet på en transversalplanet med pinsett. Sett nålen inn i venstre hjertekammer.
- Bruk en hemostat å klemme hjertet. Dette sikrer nålen og forhindrer lekkasje.
- Bruk saks til å klippe høyre atrium.
- La PBS for å pumpe (18 ml / min) gjennom dyret. Opprettholde dette trykk gjennom bufferinfusjonsperiode (3-4 min, som tilsvarer omtrent 70 ml PBS). Fortsett til hjerte er rent.
- Slå stengeventilen for å tillate at fiksativ (4% paraformaldehyd i destillert vann, 4% PFA) gjennom pumpen. Tillat den 4% PFA å pumpe gjennom dyret i ca. 8-10 min (300 ml). Gradvis øke presset for å nå et maksimum på 30 ml / min. En herdet leveren er den beste indikasjon på en vellykket perfusjon.
10. Tissue Innsamling og behandling, histologi og Iimmunohistochemistry
- Dissekere ryggmargen fra T5 til L1. Deretter etter fikse vevet i 6 ml i 4% PFA (O / N ved 4 ° C).
- Sette samme vevet i en oppløsning med 30% sukrose i 72 timer ved 4 ° C for å Cryo beskytte den og for å forhindre dannelsen av krystaller under frysing.
- Hurtig fryse ledningen ved hjelp av tørris og lagre det ved -80 ° C.
- Seksjon ved hjelp av en kryostat med 15 mikrometer tykkelse og samle deler på glassplater og fortsette for immunocytokjemi.
- Skyll seksjoner med 200 ul PBS til hver sLiDE (3 ganger, 5 min hver, RT).
- Permeabilize hvert lysbilde med 200 ul 10% NGS og 0,2% Triton X-100 i PBS i 1 time ved RT.
- Skyll seksjoner med 200 mL PBS for hvert lysbilde (3 ganger; 5 min hver, RT).
- Blokkere ikke-spesifikke steder med 200 ul blokkeringsløsning for sleiden (5% NGS; 0,1% Triton X-100 i PBS) i 30 min (RT).
- Inkuber hvert lysbilde med 200 ul av primære antistoffer O / N ved 4 ° C (fortynnet antistoff i 5% NGS; 0,1% Triton X-100 i PBS).
- Vask seksjoner med 200 mL PBS for hvert lysbilde (3 ganger; 5 min hver, RT).
- Inkuber med egnede sekundære antistoffer i 2 timer ved RT.
- Vask seksjoner med 200 mL PBS for hvert lysbilde (3 ganger; 5 min hver, RT).
- Flekk atomkjerner med 200 ul av 4 ', 6-diamidin-2-phenilindole (DAPI) (1 pg / ml sluttkonsentrasjon, 10 min ved RT).
- Montere ved hjelp av FluorSave Reagens og analysere ved konfokalmikroskopi.
MERK: Ikontrollbestemmelser, primære antistoffer må utelates og erstattes med tilsvarende konsentrasjoner av irrelevant IgG av samme subklasse. Mikrotubul-assosiert protein 2 primært antistoff ble anvendt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det totale antall av transplanterte celler er en 6 x 10 celler og ble delt i tre påfølgende injeksjon i halevenen. Vi administrert 3,3 x 10 5 celler i 50 ul fosfatbufferoppløsning (PBS). Den første injeksjon ble foretatt i løpet av 30 min etter skade, den andre 6 timer senere, og den siste 18 timer etter lesjonen. Valget av en frist på 18 timer etter SCI for å administrere PM-NPCer ble bestemt av optimal permeabilitet av blod-hjernebarrieren på dette tidspunktet 14. For å evaluere effekten av stamceller injeksjon vil det være nyttig å ha positive kontroll laminectomies dyr (n = 14) og PBS-injiserte dyr som en negativ kontroll (n = 14).
PM-NPCer øke utvinningen av Hind Limb Funksjon, migrere til lesjon området og differensiere i MAP-2 positive celler
T9 kontusjon forårsaket forbigående tap av hind lem funksjon, etterfulgt av en progressiv gradual utvinning (figur 1). Innen 2-3 uker, forbedret PBS-behandlet skadde mus og hind lem funksjon nådd 3 poeng av BMS (tilsvarende plantar plassering av pote med eller uten vekt støtte eller sporadisk, hyppig, eller konsekvent ryggstepping, men ikke plantar stepping 18) . I stedet, innenfor den samme observasjonsperioden, skadde mus behandlet med PM-NPCer viste en høyere utvinnings, og nådde 4,5 poeng av BMS (tilsvarende hyppig eller konsekvent plantar stepping uten koordinering, eller hyppig eller konsistent plantar stepping med noen samordning). Atferds forbedringen var spesielt tydelig i perioden mellom dag 7 og dag 14 etter SCI. Ingen tegn til allodynia lignende forbena hyper sensibilitet 19 ble registrert til enhver tid i noe eksperimentelle gruppen gjennom hele observasjonsperioden på 30 dager.
De fleste PM-innpodet NPC, merket med PKH26 (figur 2), samlet ved kantene avlesjon danner klynger (figur 3) fra de tidlige dagene av deres administrasjon. Da de transplanterte cellene migrert langs lesjon kantene og i en mer diffus måte der de differensiert, gradvis antar den asymmetriske cellular konformasjon av nerveceller. På 30 dager etter lesjon og transplantasjon, cellen kroppen av PM-NPCer økt i størrelse og i de fleste celler dendrittiske-lignende prosesser var opplagt og fullt immunostained av de spesifikke antistoffer til MAP-2 (figur 4). Oppnåelse av morfologisk kompleksitet og positivitet til MAP2 av transplantert PM-NPC er sannsynligvis ikke på grunn av fusjon med overlevende vertsryggmargs nevroner, noe som er tydelig i sin tydelig differensiert morfologi og fraværet av to kjerner i en enkelt merket celle.
Figur 1. PM-NPCer forbedre funksjonell recoveri i skadde dyr. Den åpne feltet locomotion var testen benyttes for bestemmelse av motorisk funksjon utvinning 18. Dyr ble testet dagen før kontusjon og scoret 9 poeng i BMS skala. På den første dag etter skade i de lesjonerte dyr, BMS stillingen redusert til null. Utvinning av hind lem funksjon av lesioned mus viste en bemerkelsesverdig og langvarig bedring når dyrene ble behandlet med PM-NPCer. Analysen ble utført i dobbelt blind, og hver gruppe besto av 14 dyr. Verdiene representerer gjennomsnittlig ± SEM. Vi bestemt de statistiske forskjellene ved hjelp av ANOVA test etterfulgt av Tukey post-test. *** P <0,001; ** P <0,01 vs PBS.
Figur 2. PKH26 merking av PM-NPCer. Etter merking prosedyre med PKH26, PMNPCS er visu alized med det levende bildet mikroskop Evos fl og mikrofotografiet ble tatt med samme instrument (skala bar = 50 mikrometer). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Lokalisering av PM-NPC i lesjonen området. PKH26-merket PM-NPC (rødt) er til stede gjennom kantene av lesjon området på 30 dager etter deres iv injeksjon. Bildet er representant for en mus, men lignende bilder ble oppnådd for minst fem dyr (skala bar = 50 mikrometer). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
belastning / 52141 / 52141fig4highres.jpg "/>
Figur 4. MAP2 uttrykk i transplantert PM-NPCer. De fleste PKH26-merket PM-NPCer (rød) kjøpte en neuronal lignende form med dendrittiske-lignende prosesser og hadde differensiert MAP-2 positive celler (grønn). Atomkjerner er farget i blått (DAPI). Bildet er representant for en mus, men lignende bilder ble oppnådd for minst fem dyr (skala bar = 25 mikrometer). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne artikkelen beskrives vi en fremgangsmåte til å oppnå en reproduserbar modell av traumatisk ryggmargsskade ved hjelp av en uendelig Horizon Impactor ved en kraft på 70 Kdyne (alvorlig). Ved hjelp av en større kraft paradigmet (80 Kdyne), kan vi føre en mer alvorlig skade som dessverre er assosiert med høyere mus dødelighet. For å unngå dette problemet, vi vanligvis velge en moderat kraft paradigmet (70 Kdyne) som er knyttet til en repeat lesjon med en gradvis bedring av funksjon og lavere dødelighet. For å produsere en så stabil skade er det svært viktig å være spesielt oppmerksom på riktig fiksering av dyr på anslags plattform; spesielt i ryggmargen skal være sentrert på anslagsspissen, og de to armer av anslags må være parallelle med hverandre. Videre må det tas hensyn i blokkering dyret med anslags tang, når ryggvirvlene kan knuses og ledningen kan bli skadet av tuppen av tang. Posisjonering av animal etter laminektomi er kritisk, og dyret håndtering under denne fremgangsmåten er også svært viktig. Spesiell oppmerksomhet må også tas hensyn til laminektomi prosedyre, som må alltid utføres på samme sted og til samme forlengelse. Når disse prosedyrene utføres under laminektomi, er et annet metodisk problem å overvåke reduksjon av risiko for skade på ledningen når du bruker mikro-saks, rongeur, eller tang for å klippe bein og frigjøre ledningen gjennom fjerning av lamina, for å eliminere værende laterale bein fremspring og fragmenter, og for å fjerne periosteum. Anvendelse av mikro-saks og rongeur med tuppene peker oppover vil redusere risikoen for å møte de ovennevnte problemer.
En viktig begrensning ved denne metode er det høy sannsynlighet for at dyrene kan utvikle interne og eksterne alvorlige infeksjoner i urinetter skade perioden. Den eksterne infeksjon skyldes manglende evne til lesioned mus til move med hind lem vekt støtte. I motsetning til dette kan den indre urinveisinfeksjon forårsaket av manglende evne av de skadede mus for å urinere uavhengig av hverandre. For å unngå disse problemene, er det absolutt nødvendig å injisere dyrene med den angitte antibiotikum og for å kontrollere størrelsen av blæren to ganger om dagen i løpet av dyrepleie prosedyrene i den første uken. Den hydreringsstatus og vekten må kontrolleres nøye i løpet av de første tre ukene etter lesioning.
Anvende de beskrevne prosedyrer vi var i stand til å få reproduserbare underskudd av hind lem funksjon som ble evaluert gjennom en bestemt atferds test utviklet av Basso og kolleger (BMS) 18. Umiddelbart etter skaden på bakbenet tap av funksjon er fullført, noe som er etterfulgt av en gradvis økende som er mest viktig i løpet av de første 2-3 uker. Atferds utvinning nådd et høyere nivå når lesioned mus ble behandlet med voksen PM-NPCer (figur 1 (figur 3). Vi beregnet at det totale antall av avgjørende podet PM-NPC er større enn de podede ESCs og voksne NSCs som tidligere rapportert av forskningsgruppen vår 20-21. På fire uker etter lesioning og transplantasjon, de fleste PM-NPCer har større kropper og besitter utvidet dendrittiske-lignende prosesser som er fullt immunostained av de spesifikke antistoffer til MAP-2 (figur 4).
Den store fordelen med denne modellen av traumatisk ryggmargsskade er standardisering av skaden. En reproduserbar tidsrelatert kurve av bakben utvinning av funksjon oppnås også. Slik reproduserbarhet gjør det mulig å definere proof-of-prinsippet studier for undersøkt behandlinger, inkludert transplantasjon av celler for regenerativ medisin studies med et redusert antall tilfeller. I tillegg kan flere aspekter av patofysiologien ved ryggmargsskade bli analysert i større detalj.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende økonomisk interesse.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PKH26GL-1KT | Sigma | 091M0973 | |
| Infinite horizon (IH) Impactor device | Precision Systems and Instrumentation, LLC | Model 0400 Serial 0171 | |
| Gentamycin 10 mg/ml | Euroclone | ECM0011B | 1 mg/ml in sterile saline solution |
| Isoflurane-Vet 250 ml | Merial | B142J12A | |
| Blefarolin POM OFT 10 g | |||
| Slide Warmer | 2Biological Instruments | HB101-sm-402 | |
| Scalpel, size 10 | Lance Paragon | 26920 | |
| Small Graefe Forceps | 2Biological Instruments | 11023-14 | |
| Rongeur | Medicon Instruments | 07 60 07 | |
| Micro scissors | 2Biological Instruments | 15000-00 | |
| Absorbable sutures (4/0) | Safil Quick | C0046203 | |
| Hemostat | 2Biological Instruments | 13014-14 | |
| Reflex 7 wound clip applicator | 2Biological Instruments | 12031-07 | |
| 7 mm Reflex wound clips | 2Biological Instruments | 12032-07 | |
| NGS | Euroclone | ECS0200D | |
| Triton X 100 | Merck Millipore | 1086431000 | |
| Anti Microtubule Assocoated Protein (MAP) 2 | Millipore | AB5622 | |
| Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11008 | |
| FluorSave Reagent | Calbiochem | 345789 | |
| Neural stem cells medium | DMEM-F12 medium (Euroclone) containing 2 mm l-glutamine (Euroclone), 0.6% glucose (Sigma-Aldrich), 9.6 gm/ml putrescine (Sigma-Aldrich), 6.3 ng/ml progesterone (Sigma-Aldrich), 5.2 ng/ml sodium selenite (Sigma-Aldrich), 0.025 mg/ml insulin (Sigma-Aldrich), 0.1 mg/ml transferrin (Sigma-Aldrich), and 2 μg/ml heparin (sodium salt, grade II; Sigma-Aldrich), bFGF (human recombinant, 10 ng/ml; Life Technologies) and EGF (human recombinant, 20 ng/ml; Life Technologies) | ||
| DMEM-F12 | Euroclone | ASM5002 | |
| l-glutamine | Euroclone | ECB3000D | |
| glucose | Sigma-Aldrich | G8270-100G | |
| putrescine | Sigma-Aldrich | P5780-25G | |
| progesterone | Sigma-Aldrich | P6149-1MG | |
| Sodium-selenite | Sigma-Aldrich | S9133-1MG | |
| transferrin | Sigma-Aldrich | T 5391 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I1882 | |
| Heparin sodium-salt | Sigma-Aldrich | H0200000 | |
| bFGF | Life Technology | PHG0024 | |
| h-EGF | Life Technology | PHG6045 | |
| Syringe 0.33 cc 29 G | Terumo | MYJECTOR | |
| buprenorphine | Schering Plough SpA | TEMGESIC | |
| eye gel | Bausch & Lomb | LIPOSIC |
References
- Cord Injury Statistical Center: spinal cord injury facts and figures at glance. , https://www.nscisc.uab.edu/PublicDocuments/fact_figures_docs/Facts%202013.pdf (2013).
- Yip, P. K., Malaspina, A. Spinal cord trauma and the molecular point of no return. Molecular Neurodegeneration. 7, 6 (2012).
- Fehlings, M. G., Cadotte, D. W., Fehlings, L. N. A series of systematic reviews on the treatment of acute spinal cord injury: a foundation for best medical practice. J Neurotrauma. 28 (8), 1329-1333 (2011).
- Furlan, J. C., Noonan, V., Cadotte, D. W., Fehlings, M. G. Timing of decompressive surgery of spinal cord after traumatic spinal cord injury: an evidence-based examination of pre-clinical and clinical studies. J Neurotrauma. 28 (8), 1371-1399 (2011).
- Sekhon, L. H., Fehlings, M. G. Epidemiology, demographics, and pathophysiology of acute spinal cord injury. Spine. 26 (24), 2-12 (2001).
- Gorio, A., et al. Recombinant human erythropoietin counteracts secondary injury and markedly enhances neurological recovery from experimental spinal cord trauma. Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (14), 9450-9455 (2002).
- Windle, W. F., Clemente, C. D., Chambers, W. W. Inhibition of formation of a glial barrier as a means of permitting a peripheral nerve to grow into the brain. J Comp Neurol. 96 (2), 359-369 (1952).
- Young, W. Spinal cord contusion models. Prog Brain Res. 137, 231-255 (2002).
- Stokes, B. T., Noyes, D. H., Behrmann, D. L. An electromechanical spinal injury device with dynamic sensitivity. J Neurotrauma. 9 (3), 187-195 (1992).
- Jakeman, L. B., et al. Traumatic spinal cord injury produced controlled contusion in mouse. J Neurotrauma. 17 (4), 299-319 (2000).
- Sahni, V., Kessler, J. A. Stem cell therapies for spinal cord injury. Nat Rev Neurol. 6, 363-372 (2010).
- Marfia, G., et al. Adult neural precursors isolated from post mortem brain yield mostly neurons: an erythropoietin-dependent process. Neurobiol Dis. 43 (1), 86-98 (2011).
- Gritti, A., et al. Multipotent neural stem cells reside into the rostral extension and olfactory bulb of adult rodents. J Neurosci. 22 (2), 437-445 (2002).
- Whetstone, W. D., Hsu, J. Y., Eisenberg, M., Werb, Z., Noble-Haeusslein, L. J. J Neurosci Res. 74 (2), 227-239 (2003).
- Gonzalez-Lara, L. E., et al. The use of cellular magnetic resonance imaging to track the fate of iron-labeled multipotent stromal cells after direct transplantation in a mouse model of spinal cord injury. Mol Imaging Biol. 13 (4), 702-711 (2010).
- Ottobrini, L., et al. Magnetic resonance imaging of stem cell transplantation in injured mouse spinal cord. Cell R4. 2 (3), e963 (2014).
- Janowwski, M., et al. Neurotransplantation in mice: The concorde-like position ensures minimal cell leakage and widespread distribution of cells transplanted into the cistern magna. Neuroscience Letter. 430 (2), 169-174 (2008).
- Basso, D. M., et al. Basso Mouse Scale for locomotion detects differences in recovery after spinal cord injury in five common mouse strains. J Neurotrauma. 23 (5), 635-659 (2006).
- Hofstetter, C. P., et al. Allodynia limits the usefulness of intraspinal neural stem cell grafts; directed differentiation improves outcome. Nat Neurosci. 8 (3), 346-353 (2005).
- Bottai, D., Madaschi, L., Di Giulio, A. M., Gorio, A. Viability-dependent promoting action of adult neural precursors in spinal cord injury. Mol. Med. 14 (9-10), 634-644 (2008).
- Bottai, D., et al. Embryonic stem cells promote motor recovery and affect inflammatorycell infiltration in spinal cord injured mice. Exp Neurol. 223 (2), 452-463 (2010).
