Summary
建立癌症细胞系和裸鼠已经癌症研究的中流砥柱，在过去的几十年。然而，最近的证据表明，治疗响应在很大程度上是通过肿瘤细胞微环境的影响。因此，我们开发了原发肿瘤标本进行药物开发目的的体外分析。
Introduction
发展有效的癌症疗法已被证明是极具挑战性的。肿瘤细胞系和肿瘤外植体-以及异种移植物已被用于癌症研究的半个多世纪1,2,3。迄今为止，药物敏感性和抗性均建立肿瘤细胞系和来自患者的异种移植物中的分子分析（PDX）是不可缺少的。然而，在建立的肿瘤细胞系的化合物的检测是不经常的预测在体内的药效，并对应在体内研究中的动物，特别是在PDX模型，是非常昂贵和费时的。这些模型系统，即无法告知的原生微环境中肿瘤进展和应对治疗策略的影响的局限性，导致了研究领域，开发更多的方法来赞美这些分析。近期，高度地注意对病人TUM的体外分析或外植体4,5由于较大的理解是癌的治疗反应是不排斥对癌细胞的内在分子组成，而是由肿瘤细胞微环境6,7一项功能，不能用传统的培养方法和可概括的影响很大/或PDX。 体外分析在上述情况下（ 即 ，相邻的周围的肿瘤细胞微环境的影响）意味着可行原发性肿瘤/转移部分的评估，而不是细胞株8,9的体外分析。
我们在这里报告的离体技术（ 即 ，精确切片新鲜组织切片）既患者的原发肿瘤和转移相关（ 即 ，淋巴结），忠实地通知关于反应（IC 50），脱靶效应，并允许分子分析性和反馈机制。此外，相关therape分析UTIC敏感性/抗性与生物标记物和基因表达图谱可以在努力确定患者更可能对实验药物的兴趣响应来执行（ 即 ，高的药物响应相匹配的患者与特定生物信息）。在体外的技术和评估的多参数的方式中的应用是对病人的选择和临床疗效的整体改善运动。
体外治疗反应的分析可以成为癌症治疗的临床前和临床开发的标准工具，并设想为对治疗性发展战略的一个个性化医疗方法的一个步骤。
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Protocol
注：病人组织采购是通过制度化审查委员会（IRB）批准-approved生物样本和临床协议（协议号09-121和11-041，分别）在纪念Sloan Kettering癌症中心。
1，组织采购
- 患者原发肿瘤/转移采购
注：迄今为止，该协议已经在手术切除胰腺癌，胃癌和乳腺癌的肿瘤类型，以及，淋巴瘤转移进行。- 直接手术团队提供样品通过快递或气动管道系统的病理学部门在无菌防溢容器密封和无菌防漏塑料样品袋。直接手术团队运送标本的新鲜状态，无甲醛固色剂或。
- 直接病理学家或病理学家助理使用无菌技术收获的新鲜标本，其中公司ludes使用无菌手套和仪器在层流罩。
- 记录采购的标本，这是严格根据30分钟从完成手术过程中不停的收割时间。考虑到冷缺血考虑效果，不采取标本切除标本> 30分钟18冷缺血时间。
- 引导病理科人员以除去以约0.5 cm 3的原发肿瘤样品至1.0 cm 3的在层流罩以保持无菌的环境。如果可能，请从指数病灶周围的肿瘤组织，以避免潜在的坦诚中心坏死（细胞死亡）。
注：坏死组织可以是通过以下任一条件严重识别：颜色或组织的苍白的损失;强度损失在坏死组织是软的，易碎的;坏死和可行的组织之间有明显的分界。 - 直接pathologiST或病理学家助理提供外周组织是过量的（手术丢弃）肿瘤的诊断评估的即时取样后。将样品中含有约含1％抗生素（青霉素和链霉素）的最小必需培养基（MEM）5毫升15毫升的无菌离心管中。
- 如果可用（ 例如，乳房切除标本腋尾部的淋巴结），购买相同尺寸（0.5 毫升 〜1.0 毫升 ）的极正面的关联淋巴结标本并比较原发肿瘤对药物的反应。象的原发肿瘤样品，将含有1％抗生素（青霉素和链霉素）的相关淋巴结样品在一个15毫升的无菌离心管中含有约最低必需培养基（MEM）中的5毫升
- 如果手术标本的许可证（ 例如，乳房切除标本），除去（从原发肿瘤的远处）的正常组织的样品（ 即大小，正常密/纤维乳腺实质内），置于含有约含1％抗生素仅传送目的的最低必需培养基（MEM）的5毫升15毫升的无菌离心管中。继转移到实验室设施，在“正常”样本转移到离心管，'捕捉'冻结和存储-80℃冷冻以备将来的分子分析。
- 置于湿冰上所有标本，并立即运送到实验室空间用于离体新鲜组织切片。不要一节正常的标本，但在-80，而存储℃冰箱为未来的分子分析。在-80℃的冷冻以备将来分子分析转移，原发肿瘤的一个离心管，'捕捉'冻结和存储部分和相关的转移。
- 从临床研究组织采购（ 如可选的空芯针穿刺活检（CNB））
注：我们获得的肿瘤组织从患者就读于谁给他们的同意接受之前的疗法开始无障碍肿瘤转移的CNB临床方案。 CNBS，迄今为止，已在患者的乳房，边缘区淋巴瘤，套细胞淋巴瘤，转移性神经节瘤，子宫颈（鳞状细胞癌）和卵巢癌进行。- 有从介入放射学或相关部门临床人员进行预处理粗针切片，然后将样品在一个15毫升的无菌离心管中含有约含有1％的抗生素（青霉素和链霉素）最低基本培养基（MEM）的5毫升。
- 置于湿冰上活检标本，并立即运送到实验室空间用于离体新鲜组织切片。
2，准备材料的切片和Vibratome设置
- 在切片准备材料
- 做一个4％的琼脂糖溶液加入4g阿加上升到100毫升的PBS。高压釜（周期设置：液体，121℃，30分钟，15磅每平方英寸）的首次使用之前的溶液。对于以后的使用，将4％的琼脂糖在微波炉液化在每次使用前（大火煮30秒的间隔），并适当地冷却到约25℃（ 即温暖的触摸）铭记琼脂凝固在室温。
- 使用4％琼脂糖作为非永久性组织包埋媒体。当在4％的琼脂糖充分冷却并仍处于液体状态时，用无菌镊子将组织标本中的嵌入模具和倒在4％的琼脂糖。
- 直接在嵌入模具的切削表面壁定位在组织标本接近（〜2毫米的距离），但并非如此。在4％琼脂糖将开始迅速固化，因此适当地快速定位在组织标本。在切片，保持4％琼脂糖在55℃水浴，保持在溶液中。
- 到24孔板的截面分析，加1毫升邻˚F完全培养基（ 即 MEM + 10％胎牛血清+ 1％抗生素）到每个孔中。保持在24孔板上于室温（〜25℃），在整个切片的持续时间。
- Vibratome设置的制备
- 使用振动切片机中，设置在所述叶片接近试样的速度[0（0.00毫米/秒）至10（2.5毫米/秒）]和叶片[0（0赫兹）的频率为10（100赫兹） 。根据组织（ 即密度/硬度）的质地调整设置。
- 为浸润性导管癌原发性乳房肿瘤，调整设置到6和图3，分别速度和频率。对于密度较小/事务所肿瘤组织，降低速度，并相应地提高频率。
- 设置仪器范围内的切片厚度（1 - 999微米）。对于这些分析，将部分厚度为200微米。
- 用一薄层液体粘合剂的在试样圆盘塔装入琼脂糖包埋的标本t被淹没在媒体水库被包裹在湿冰。
3，组织切片，处理及分析
- 紧接在使用时在一个多井板用1毫升完全培养基的无菌镊子和地方分段移除精确切片部分。当获得足够的部分为响应和相关的分析，将多孔板用于在组织培养箱设定在标准组织培养条件的治疗反应。
- 取多个控制部件的书夹的处理部分，以努力确定剂量依赖性响应，而不是培养的工件。进行组织切片快速（〜30 - 40分钟）内的冷缺血时间的任何不利影响以及（〜2 - 4小时）18。进行处理的部分，只有下面有1小时的适应期。
- 继1小时适应期，加上增加剂量（治疗相关;
- 治疗后，通过将组织切片中含有为10％福尔马林，地点在室温Ø管取出无菌条件和福尔马林固定下的所有路段/ N或含4％多聚甲醛管（从瓶中稀释16％的多聚甲醛用PBS的4％的最终浓度），并置于室温2小时。
- 固定较大的组织切片（ 例如 ，〜的6毫米x 4毫米），200微米厚的10％福尔马林缓冲液中O 2 / N在RT。固定较小的部分（ 例如为1mm×1mm）上200微米厚于4％多聚甲醛进行2小时，在室温。
注：对于固定剂f的体积的有效渗透ixative应20X组织的体积。鉴于此协议的结果非常小的组织的大小（ 例如，6毫米组织3 = 6μL体积），为保证适当的固定使用1毫升固定液为所有规模的组织。 - 以下有固定的组织标本石蜡包埋的病理科人员。部分标本蜡块上收取的幻灯片是苏木精和曙红染色，免疫组化评估（ 如细胞凋亡）。
- 治疗后，通过将组织切片中含有为10％福尔马林，地点在室温Ø管取出无菌条件和福尔马林固定下的所有路段/ N或含4％多聚甲醛管（从瓶中稀释16％的多聚甲醛用PBS的4％的最终浓度），并置于室温2小时。
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Representative Results
在这项研究中， 体外技术，用在热休克蛋白90抑制剂（Hsp90i）治疗敏感性/抗性的相关性分析。在此Hsp90i，乳腺癌原发肿瘤中，ER +浸润性导管癌（IDC），以及相关的淋巴结转移的临床前评估，分析体外对治疗的反应 （ 图1）。多个200微米的连续切片分别用车辆之用，增加剂量的Hsp90i（0.25，0.50，1.0和2.5μM）。 图1中的数据表示福尔马林固定，石蜡包埋（FFPE）及苏木精-伊红（H＆E）染色切片下48小时的治疗时期。该管制（车辆专用）处理部分显示可行IDC的巢穴，而2.5微米处理组织切片导致了40％的诱导细胞凋亡所看到的核形态学改变（ 即细胞核固缩/ APOPtotic碎片）（ 图1A）。细胞凋亡是在末端转移酶的缺口末端标记法（TUNEL）分析原发肿瘤进一步证实（数据未显示）。 IC 50是从响应数据通过作图百分比的细胞凋亡与药物的浓度计算得出。显著，分子伴侣，热休克蛋白90在蛋白质稳定在正常和肿瘤细胞10的关键信号传导途径的和稳态中发挥关键作用。到目标的Hsp90在癌症的能力依赖于以下发现恶性细胞在很大程度上取决于热休克蛋白90的陪伴功能，尤其是在努力克服的过程中转移进程遇到恶劣环境强调状态。从本质上说，癌症细胞变得高度依赖导致“致癌”的Hsp90 11靶向选择性池Hsp90的功能。在插入， 如图1A，伴有腺泡和腺管相邻的良性小叶保持不变ín中的同一个2.5微米Hsp90i处理的部分。就我们所知，这是第一次这样的Hsp90癌症特异性目视捕获在原发性肿瘤和转移瘤相关的Hsp90i响应评估。这一发现不变良性/正常细胞中的IDC（ 图1A）以及血管的相邻良性乳腺小叶看出，原发肿瘤的周围良性乳腺实质内和相关淋巴结转移（数据未示出）已被概括在几个不同的肿瘤类型（ 例如，乳腺癌，胃癌和淋巴瘤的转移）。
这个原发肿瘤的伴随淋巴结转移显示，只有在被松散相关的IDC巢（ 图1B）完全缓解。 IDC巢所形成紧密的球状体，但是，仍然存活证实了TUNEL染色（ 图1C）。活IDC球状体的免疫荧光显示的附加 分析的细胞-细胞粘附分子E-钙粘蛋白的持久性或重新表达（ 图1C）。这一发现是一致持久的，过表达E-钙粘蛋白增加了潜在的转移或转移的效率体现在高度恶性的，致命的炎性乳腺癌12，13，虽然有趣，这一结果超出了本文的范围。然而，它是显著要注意，这些淋巴结（LN） 的IDC球状体保持在培养一段2周，从而印证了使用体外技术，研究两者的敏感性/抗性在临床药物开发的强度。
在体外技术也被用在对空芯针穿刺活检（CNBS）在肿瘤16,17靶抑制的证据的临床研究。患者谁同意的，已经进行了预处理芯针穿刺活检（CNB）的过程（ 图2）。可比到的原发肿瘤的临床前评估中， 离体技术被用于确定灵敏度或响应于可转移的CNB。多个200微米的连续CNB的部分均采用只增加剂量Hsp90i（0.25，0.50，1.0和2.5微米）的车辆。在体外评估使用Hsp90i剂量的数目是由CNB的大小所决定的。然而，由使用剂量超过建议的频谱一切努力。像的临床前体外评估，响应可以评价和购买相比实际病人的反应（ 即 ，相关分析;图2），通过后处理CNB药代动力学（PK）确定的， 即，如通过高效液相色谱法测定药物保留串联质谱法（LC-MS / MS）进行分析，以及在病人的PET成像（ 图2），16,17。迄今为止，分析使用的体外技术，这款Clinical研究对多种肿瘤类型（ 如乳腺癌，边缘区淋巴瘤，套细胞淋巴瘤，转移性副神经节瘤，宫颈癌和卵巢癌），16，17。完全相关性分析实施体外技术进一步体现了该技术的效用已执行临床药物开发。
一个ER +乳腺癌图1 体外响应分析。 （A，左图）显示浸润性导管癌（IDC）活巢（苏木精-伊红染色，比例尺为100μm）。经治疗（一，右图）与2.5 Hsp90i的微米有一个感应〜40％凋亡反应（细胞核固缩/凋亡碎片;箭头）（苏木精-伊红染色，比例尺为100μm）。良性小叶
图2原理实现体外技术在临床研究中。 请点击这里查看该图的放大版本。
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Discussion
试图制定有效的治疗策略时，癌症生物学家面临显著挑战。在开发上建立肿瘤细胞系测试药物不能准确地反映体内响应和在上PDX模型体内实验是劳动密集型的并且非常昂贵。鉴于上述情况，原发性患者的体外技术的应用肿瘤14，15现在位于建立肿瘤细胞系和患者来源的异种移植物（PDX）的分子分析的旁边。
本文以体外技术的应用推向新的高度，该技术忠实地通知上的反应（IC50），脱靶效应，并允许电阻和反馈机制的分子分析。当响应数据与肿瘤的分子信息（ 例如，肿瘤的生物标志物蛋白的表达，突变）的相关性研究（响应与肿瘤摩尔ecular信息）可以用来选择的患者更可能对特定药物的反应，在努力改善患者的预后。最显著，在临床药物开发（ 即 ，可选的活组织检查），预处理CNB的体外反应可在病人的反应相关的（和验证）（ 即，后处理CNB）和药物保留（药代动力学（PK）评估） 16,17。利用体外技术，这项临床研究能够确定肿瘤的反应，以及确认目标特异性（ 即 PD;诱导热休克蛋白70），并告知对剂量和调度16,17。
离体的技术是适合于大多数实体肿瘤的类型以及血源性癌症转移（ 例如，淋巴瘤的淋巴结转移），在该协议为呈现轻微的挑战某些肿瘤类型中轻微的调整。例如，胰腺肿瘤倾向于具有高Stroma到肿瘤细胞的比例，从而导致了较差的癌症细胞的代表性的部分。肿瘤细胞丰富的肿瘤区域采购不能在总量分析作出。因此，为克服这个潜在的缺点来自肿瘤样品的多个更小的立方区域可以嵌入（4 /琼脂糖包埋模具），并同时剖增加肿瘤细胞的富体外部分的概率。
我们的数据有力地支持临床前药物开发（图1）利用体外技术。随着反应（IC50），复制的部分可以替代的可行性分析，代谢组学，组合治疗策略，有效的药物暴露对分泌性因素（ 如细胞因子，外来体），电阻和反馈机制和重要的分析，通知对脱靶效果（ 即正常和良性的细胞）。中所使用的Hsp90i这个特定的研究中，针对SPEcificity和鉴定“脱靶效应”是基于这样的前提，有“致癌基因的Hsp90'的癌细胞中经恶变10只发现了独特的池键。这就是呈现在结果部分（插入图1A）凡体外 Hsp90i处理部分的良性小叶保持不变。同样重要的，在相同的原发肿瘤的另一部分反映在图1中，一个10微米（治疗无关的剂量）处理部显示的IDC巢完全反应而原位 （DCIS）的关联性导管癌中保持不变（数据未示出） 。在这方面的研究今后的调查已经超出了本文的范围。然而，这种特殊的发现通知关于“恶性转化”或在IDC标本相关DCIS的疾病进展，状态相对于所述致癌Hsp90的陪伴功能，并支持使用体外技术在药物开发的实用程序。
离体技术的另外一个应用是在肿瘤异种移植模型中的预疗效分析使用（ 即 ， 体外 PDX的切片）的药物开发，以确定药动学/药效学（PK / PD）数据之前进行参与，昂贵的体内研究-允许一个更知情，高性价比的体内药效研究。
的关键步骤和离体技术的潜在限制因素是采购和切片。肿瘤标本的采购（ 即 ，原发肿瘤/转移）必须尽快与密切关注执行以识别具有最高程度的生存能力的肿瘤的区域。大的肿瘤往往有不属于肉眼可见坏死的中央区域。因此，采购组织˚FROM中的最外侧的轮辋增加获得一种可行的试样的概率。相对于切片，收集精确切片在所需的厚度（ 例如 ，200微米）在很大程度上受肿瘤密度/硬度（不含CNBS由于极小的尺寸）的影响。例如，浸润性导管癌通常是在对比浸润性小叶癌致密得多。密集的肿瘤组织提供适当的阻力 - 在没有永久性嵌入媒体 - 到刀片，而密度较小的肿瘤组织没有。密度较小的肿瘤组织类型的实例包括但不限于：浸润性小叶癌，粘液癌和胃肿瘤类型。为了克服这个潜在的局限性，故障排除与合适的刀片速度和频率是必要的。一贯精密切片的切片厚度，整个切片的过程中，对药物的反应进行精确的评估是至关重要的。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vibratome Leica VT1000s | Leica | 14047235613 | |
| UltraPure agarose | Invitrogen | 16500500 | Prepare 4% and 6% before use |
| Injector blade | Ted Pella | 121-4 | |
| MEM with Penicillin + Streptomycin | Media Core Facilities (MSKCC) | The media is prepared at Memorial Sloan Kettering Cancer Center | |
| Scalpel no. 10 | Thermo Scientific | 31-200-32 | |
| Disposable forceps | Cole-Parmer | 84011182 | |
| Embedding mold | Electron Microscopy Science | 70181 | |
| FBS (heat inactivated) | Gemini | 100106 | |
| 24 well plates | Corning | 3524 | |
| Formalin (10%) | Sigma Diagnostics | SDHT501128 | |
| 16% Formaldehyde solution | Thermo Scientific | 28908 | |
| Embedding microsettes | Simport | M503-2 | |
| Ethanol (70%) | Fisher Scientific | A405P-4 | |
| Waterbath | Fisher Scientific | 15-462-2SQ | |
| Microwave | General Electric | ModelJES2051DNBB | |
| Adhesive (Ethyl Cyanoacrylate) | Sigma-Aldrich | E1505-5G | |
| 10 mm dishes | BD Falcon | 353003 | |
| 15 ml tubes | BD Falcon | 352096 |
References
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