Abstract
DNA ekstraksiyon protokolleri etkisi araştırıldı edilen numune tipine ve uygulanan aşağı doğru analiz tipleri, hem yüksek ölçüde bağlı olabilir. Yeni bakteriyel topluluk analizi teknikleri (örneğin, microbiomics, metagenomik) kullanımı bu disiplinler içinde tarım ve çevre bilimleri ve birçok çevresel örneklerde daha yaygın hale geliyor düşünüldüğünde physiochemically ve mikrobiyolojik (benzersiz örn, fekal ve çöp / çarşaf örnekleri olabilir kümes hayvanları üretim spektrumu), uygun ve etkili DNA ekstraksiyon yöntemleri dikkatle seçilmiş gerekir. Bu nedenle, yeni bir yarı-otomatik hibrit DNA ekstraksiyon yöntemi çevre kanatlı üretim örnekleri ile kullanılmak için özel olarak geliştirilmiştir. Mekanik ve enzimatik: Bu yöntem, DNA ekstraksiyonu iki temel tür bir kombinasyonudur. Bir iki adım yoğun mekanik homojenizasyon adımı (kullanarak boncuk-yenerek özellikle ÇEVREYLE için formüledışkı örnekleri örnek matris bakterilerin uzaklaştırılması ve DNA geliştirmek ve Gram-pozitif bakteri topluluk üyelerinin kurtarma geliştirmek için tal örnekleri) "altın standart" enzimatik DNA ekstraksiyon yöntemi başında eklenmiştir. Hibrid yöntemi enzimatik ekstraksiyon kısmı başlatıldı sonra, kalan saflaştırma işlemi numune verimi arttırmak ve örnek işleme hatayı azaltmak için bir robot iş istasyonu kullanılarak otomatik edildi. Kanatlı dışkı ve çöp örnekleri işlerken katı mekanik ve enzimatik DNA ekstraksiyon yöntemleri ile karşılaştırıldığında, bu yeni hibrid yöntemi nicel dikkate iyi genel kombine performansı, toplam bakteri topluluklarının tahminleri (microbiomics kullanarak) (16S rRNA qPCR kullanarak) ve nitel sağlanan .
Protocol
Çevre Kanatlı Üretim Örnekleri 1. Mekanik Homojenizasyon
- Ekstre önce, 95 ° C'ye kadar bir su banyosu ve bu, su banyosu zaman bu ısıya varılması için izin verir.
- 2 ml Parçalama Matrisi e tüpüne toprak veya dışkı maddesinin 0.33 g tartılır.
- Bu tüpün kapasitesini aşan için aşağıdaki çözümleri neden olacağından, tüp numune 0.33 g aşmayın.
- RT çözülme dondurulmuş örnekler ağırlığında önce.
- Toprak / dışkı 1 g toplam analiz etmek için, dışarı 3 tartmak her çevresel numune için 0.33 gr örnekleri çoğaltmak.
- Ekstre etmeden önce konik matris, boruların içinde -20 ° C'de saklayın örnekleri, gerekirse.
- 825 ul Sodyum Fosfat Tampon ve örnek bir tüpe PLS çözeltisi 275 ul ekleyin. ~ 15 saniye boyunca bir vorteks ile karıştırın ve daha sonra 5 dakika için 14,000 x g'de örnekleri santrifüj.
- Superna Durusutant Tampon ASL 700 ul ekleyin ve. 5 saniye boyunca bir vorteks ile karıştırın.
- Tepeboşluğu bu noktada konik tüp mevcut (~% 10, toplam hacim) olduğundan emin olun. Herhangi bir tepe boşluğu varsa, borular çapraz kontaminasyon ve / veya örnek kaybına neden olabilir sonraki homojen hale getirme adımı sırasında sızıntı eğilimi olacaktır.
- Bir FastPrep 24 Aracı içine örnekleri yerleştirin ve 40 saniye boyunca 6.0 m / sn hızında örnekleri homojenize.
- 5 dakika boyunca 14.000 xg'de homojenize örnek santrifüjleyin. Steril 2 ml mikrosantrifüj tüp süpernatant aktarın.
- Örnekten DNA kurtarma maksimize etmek için, tekrar aynı steril, 2 ml mikrosantrifüj tüp içine süpernatantlar birleştirerek, 1,4-1,6 adımları.
Örnek homojenatlarında İnhibitörlerinin 2. enzimatik inhibisyonu
NOT: Bu protokol QIAamp DNA Tabure Mini Kit kullanır.
- Kuluçkaya yatmak5 dakika süre ile 95 ° C su banyosu içinde yüzer yüzer içinde herhangi bir kalan hücreler DNA geri kazanımı maksimize etmek.
- Çoğunlukla, Gram-negatif organizmalar içeren örneklerin, 70 ° C'de inkübe edilir. Gram-pozitif organizmalar (kanatlı dışkı örneklerinde olduğu) mevcut olan, ancak, 95 ° C de inkübe edilir.
- Basınç bu mühürlü mikrosantrifüj tüplerinde kurmak gibi tüpler açık "pop" olmaz emin ve potansiyel örnek hacmi kaybetmek mikrosantrifüj tüpleri plastik kilitleme klipleri kullanın.
- Basınç, yeniden kap mikrosantrifüj tüpleri bırakın ve 15 saniye için bir girdap kullanarak karıştırmak için her mikrosantrifüj tüp açın.
- , 1 dakika için 14,000 x g'de santrifüjleyin süpernatan 1.2 mi çıkarmak ve yeni bir 2 ml'lik steril mikrosantrifüj tüpü içine yerleştirin.
- Her bir numune için 1 Inhibitex sekmesine ekleyin ve örnek bir homojen beyaz / kirli beyaz bir sıvı haline gelene kadar bir girdap kullanarak karıştırın.
- T kaçınınnumuneyi içeren mikrosantrifüj tüp içine yerleştirirken Inhibitex sekmesini ouching. Bunu gerçekleştirmek için, açık mikrosantrifüj tüp üzerinde doğrudan sekmesini içeren blister paketi yerleştirin ve yavaşça kabarcık paketinin dışında ve mikrosantrifüj tüpe sekmesini itin.
- 5 dakika boyunca 14.000 x g'de oda sıcaklığında (-25 ° C), 1 dakika için örnek ve santrifüj inkübe edin.
- 5 dakika için 14,000 x g'de bir steril 1.5 mL mikrosantrifüj tüpü ve santrifüj tüm sıvı aktarın.
- Sıvı aktarımı sırasında adım 2.5 sonunda mikrosantrifüj tüpü altındaki topak olabilecek herhangi bir diğer parçacık kaçının.
Qiacube süreci Robotik Workstation Kullanımı 3. Otomatik DNA Saflaştırma
Not: plastik sarf sayısı, santrifüj içinde deneme türbin çarkına adaptörleri düzenlenmesi, ve tamponlar / solüsyonlar gerekli hacimleri, num bağlıdırçalışma ediliyor örneklerin ber.
- Rotor adaptörleri içinde uygun yuvalara elüsyon tüpleri ve filtre tüpleri ekleyin. Her numune için, rotorun adaptörün orta yuvaya 400 ul ekle. Numune sayısı arıtıldıktan göre doğru düzende iş istasyonu santrifüj rotor adaptörleri yerleştirin.
- Bir başarısızlık arıtma protokolünün santrifüj adımlarından biri sırasında kesme neden olabilir bunu beri mikrosantrifüj tüp kapakları tüm düzgün rotor adaptörü içinde güvenli olduğundan emin olun.
- Iş istasyonuna 1.000 ul ve 200 ul filtre ipuçları gerekli sayıda ekleyin ve tamponların gerekli hacmi ile birlikte tampon şişeleri doldurmak.
NOT: Bu arıtma protokolü (AL, AW1, AW2 ve AE) için gerekli tamponlar tüm QIAamp DNA Tabure Mini Kit içinde yer alır. Kullanıcı AW met için gerekli olan% 100 etanol tedarik gerekiyorffers ve arıtma işleminde kullanılan bir solüsyon olabilir. - Bir steril 1.5 mL mikrosantrifüj tüpü içine verilen proteinaz K çözeltisi gerekli hacmi ekleyin ve iş istasyonu üzerinde yuva A içine yerleştirin. Ayrıca, iş istasyonunun çalkalama bölümüne 2 ml güvenli kilit mikrosantrifüj örnek tüpleri RB (saflaştırılmış olan örneklerin sayısına eşit) gerekli numarayı ekleyin.
- Örnek tüplerin kapakları sıkıca makine başlangıçta gerekli tüm plastik ve sıvılar talep için kullanılabilir olduğundan emin olmak için iş istasyonu tararken bir hata neden olur bunu bir başarısızlık beri, iş istasyonunda uygun yuvalara yerleştirilir emin olun koşmak.
- Patojen Algılama Protokolü ve iş istasyonu doğru yüklendiğini emin sonraki ekranlar aracılığıyla okuma - İnsan Tabure - iş istasyonunda dokunmatik ekranı kullanarak, DNA Tabure seçin. Bir kez tüm onay ekranları bu protokolü çalıştırmak için, Başlat geçirilir.
- 12'den fazla örneklerinden DNA ayıklanması ise 12 numune bir çalışma iş istasyonunda tamamlamak için ~ 72 dk sürer, çünkü, numunelerin sonraki seti için homojenizasyon işlemi (Adım 1) başlar.
- Sonraki mansap analizler için gerekli olana kadar -20 ° C'de, rotor adaptörleri numune kaldırmak, onları kap, ve yer.
- Bu noktada, bir santrifüjleme / buharlaştırma tabanlı sistemi kullanılarak tek bir numune (toplam analiz miktarı = 1 g), 3 suret saflaştınlmasını birleştirir. Tris-EDTA tampon maddesi içinde 100 ul bir son hacme çoğaltır ve yeniden elüte birleştirin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu çalışma için, taze dışkı pisliği ve çöp örnekleri güneydoğu ABD'de ticari broiler evi (~ 25.000 kuş) elde edildi. piliçler (Gallus gallus) Cobb-500 haçlar vardı ve onlar örnekleme zamanında 59 gün eski. Taze dışkı ve çöp örnekleri (waterer / besleyici hatları arasında, waterer / besleyici hatlarının yakınında, soğutma pedi yakın ve egzoz fanları yakın) evin içinde dört farklı alanda kurtarıldı ve bu alanların her birinden örnekler toplanmış beş içeriyordu bu alan içinde örnekler. Evin dört alanlarından örnekler ayıklanır ve nicel / nitel numune türü (fekal ya da çöp) göre ayrı ayrı analiz edilmiştir. Aşağıda sunulan veriler hem çevre örnek türleri için bütün evi için ortalama değerleri temsil etmektedir.
Toplam 16S rDNA bolluğu, bir numune içinde bulunan toplam bakteri topluluğunun bir tahmin, daha önce yayımlamak bir kullanılarak belirlendiEd qPCR protokol 20 ve değerler DNA miktarı, her bir ekstraksiyon yöntemi elde kullanılarak normalize edildi (florometrik analize göre, daha önce tarif edilen 21. üç ekstraksiyon yöntemler arasında, Şekil 1, mekanik bir yöntem sürekli olarak, en yüksek toplam bakteri normalize gen bolluğu Resim göstermektedir hem dışkı ve çöp örnekleri için tahminler (5.85 ± 0.16 ve 5.56 ± 0.08 log 10 16S rDNA kopyalar ng -1 DNA sırasıyla, ekstre); enzimatik yöntemi sürekli düşük dışkı ve çöp tahminleri (4.83 ± 0.54 ve 4.61 ± sağladı, oysa 0.13 log 10 16S rDNA kopya -1 DNA) sırasıyla, ekstre. roman melez ekstraksiyon yöntemi ≤ 0.05 (p) enzimatik yöntemle daha yüksek, ancak mekanik yöntemle istatistiksel olarak benzer anlamlı olduğu bulundu normalize 16S rDNA zengindi vermiştir ng dışkı ve çöp örnekleri (5.50 ± 0.16 hem de5.23 ± 0.14 ng günlük 10 16S rDNA kopya -1 sırasıyla edilen DNA,). Bu nedenle, mekanik ve hibrid çıkarma yöntemleri hem enzimatik yöntemle daha bu örneklerin içinde toplam bakteri topluluklarının büyük bir niteliksel tahmin sağladı.
Navas-Molina ve ark. Gözden gibi niteliksel her numune tipi ve ekstraksiyon yöntemi, microbiomic iş akışı toplam bakteri toplulukları değerlendirmek için (2013) 22 kullanılmıştır. Kısaca, 16S rRNA geninin V4 bölgesi PCR ile MiSeq sıralama içeren adaptör primer ve Golay barkod ile büyütüldü ve Illumina MiSeq platformu 23,24 üzerinde dizildi. Ham dizileme veri varsayılan parametreleri kullanılarak QIIME 1.7.0-dev 25,26,27 işlenmiştir. Dizi veri işleme dahil: kalite-filtreleme; OTU kümeleme (% 97 eşiğinin açık referans) UCLUST 27 kullanılarak; <% 0.005 22 OTU bolluğu filtreleme seviyesi31; greengenes 13_5 referans veritabanı 28 karşı RDP Ayırıcı kullanarak sınıflandırma atama; greengenes çekirdek 28 set karşı PyNAST 29 sekans hizalama; FastTree 30 kullanılarak filogenetik ağaç yapımı. core_diversity_analyses.py script tüm alfa, beta çeşitliliği ölçümleri çalıştırmak ve numune başına 7865 dizileri bir sıralama derinliğinde tüm araziler, grafikler ve istatistikler oluşturmak için kullanıldı.
seçilen DNA ekstraksiyon yöntemi kurtarıldı dışkı ve çöp microbiomes net bir etkisi sergilemiştir. Filum düzeyinde başlayarak (Tablo 1), genel veri (dışkı ve çöp örneklerinde hem de muhasebe) yöntemleri son derece yıkıcı homojenizasyon adımı (mekanik, hibrid) Gram-pozitif şubelerinin yüksek miktarlara tipik vermiştir topluluklar (98.0 sahip olduğu ortaya ve 97.49% enzimatik yöntemle (81,74%) sırasıyla) göreceli. Tersine, Gram-negatif filumlarYa mekanik (1.89%) veya hibrid (2.38%) yöntemlerine göre enzimatik yöntemle (17.49%) elde genel bakteriyel toplumun çok daha büyük bir bölümünü temsil. Genel microbiomic profillerinde Bu, diferansiyel çıkarma etkisi ve Gram-pozitif ve Gram-negatif organizmaların sıklığı etkili bir cins seviyesinde gösterilmiştir (Şekil 2) enzimatik yöntem mikrobiyomları gösterirken, nispeten benzer microbiomic profilleri üretilebilir .The mekanik ve karma metotları kazanılan takson göreceli bolluk farklı bir dağılım. Örneğin, dışkı örnekleri spp.in Gram-negatif Alistipes (A kırmızı blok, toplam toplumun% 7.71) (enzimatik yöntemi şiddetli bir diğer iki çıkarma yöntemleri için parmak izi azalır kırmızı oklar ile özü çıkarıldı; 0,47 -0,81%), fakat Gram-pozitif Lactobacillus spp. Enz kullanırken (L büyük mor blok) çok daha yaygın azalır olduMekanik veya hibrid yöntem (sırasıyla 57,22 ve% 61.85,%) kıyasla ymatic yöntemi (42,71%). Takson göreceli bolluğu üç ekstraksiyon yöntemleri arasında bazı farklılıklar sergiledi ederken Yine, keşfedilen takson sayısı hem dışkı (92 takson 112) ve çöp (96 112 takson) için her üç yöntem için benzerdir.
enzimatik yöntemi sürekli sürekli bu ekolojik için en düşük tahminlerini gösteren mekanik yöntemle, dışkı ve çöp numuneler hem (chao1, Filogenetik Çeşitlilik ve hakkaniyet ilkesi çerçevesinde ölçümleri, sırasıyla kullanarak) büyük zenginliği, çeşitliliği ve düzgünlük ile bakteriyel topluluklar vermiştir parametreleri (Tablo 2). hibrit yöntemi sürekli diğer iki yönteme ekolojik ölçümlerini aracılık gösterdi. İstatistiksel olarak, bütün örneklerden, ekolojik tahminleri, bağımsız olarak ekstraksiyon yöntemi, benzer olduğu bulunmuştur enzimatik yöntemle, ancakçöp örnekleri analiz ederken mekanik yönteme kıyasla anlamlı zengin (p = 0.045) mikrobiyomu neden etmedi. Başka önemli farklılıklar ekstraksiyon yöntemleri arasında bulunurken, ekolojik parametreler arasındaki en büyük farklar genellikle hibrid yöntemi diğer iki yönteme göre eşit derecede iyi performans ile, enzimatik ve mekanik yöntemler arasında bulunmuştur; Bu ekstraksiyon yöntemleri niceliksel değerlendirilmesi benzer (Şekil 1).
Şekil 1. Nitel bakteriyel topluluk karşılaştırma DNA ekstraksiyon yöntemlerine dayalı. Sütunlar DNA miktarına karşı normalize qPCR tarafından belirlenen fekal (katı çubuklar) kurtarıldı veya çöp (kesikli çubuklar) örnek (olarak ortalama 10 -transformmed 16S rRNA gen kopyaları log temsil ) flüorometrik tespitine dayalı. ThBu değerleri elde etmek için kullanılan e DNA ekstraksiyon yöntemi x-ekseni üzerinde gösterilir. Hata çubukları, 4 kopya numuneler arasındaki standart sapmasını temsil eder. Her örnek tipi (Dışkı veya Çöp) için, sütunların üzerinde harfler Tukey çoklu karşılaştırma testi (p = 0.05) kullanılarak tek yönlü ANOVA analizine dayalı önemli ölçüde farklı araçlar temsil eder.
DNA ekstraksiyon yöntemleri Şekil 2. Cins düzeyinde microbiomic karşılaştırılması. Her sütun dışkı (ilk üç sütun) ve çöp için her ekstraksiyon yöntemi için geri kazanılan takson (16S rRNA gen Illumina MiSeq verilerine göre) ortalama toplam bakteri topluluğu (temsil Son üç sütun) örnekleri. Her sütun broyler evin içinde farklı alanlarda dört farklı örneklerinin ortalamasını temsil eder. sütun dibinde mektup extr gösterireylem yöntemi (M = Mekanik, E = enzimatik, H = Hibrid). Her sütunda farklı renkler, her cins için bir genel toplum içindeki cins ve renk göreceli bolluk tüm sütunlar için aynıdır temsil eder.
DNA ekstraksiyon yöntemleri Tablo 1. Phylum düzeyinde microbiomic karşılaştırılması. Bağıl bollukları (% toplam dizileri kurtarılan) her 2 Gram-pozitif (Actinomycetesten ve Firmicutes) DNA ekstraksiyon yöntemi ile 3 Gram-negatif için (Bacteriodetes, Proteobacteria, Tenericutes) filumları Her iki numune türlerinden microbiomic analiz iyileşti.
R ichness Tablo 2. İkili karşılaştırmalar, QIIME kullanarak analizleri cins düzeyinde microbiomic bakteriyel toplum dayalı üç DNA ekstraksiyon yöntemleri için çeşitlilik ve eşitlik tahminleri. Her iki örnek türleri için, ikili karşılaştırmalar üç olası ekstraksiyon yöntemi kombinasyonları için yapıldı. değerlendirilen toplam bakteri topluluğu parametreleri (chao1 istatistiğinin dayalı α-çeşitlilik), çeşitliliği (β-çeşitliliği Filogenetik Çeşitlilik istatistik dayalı) ve (hakkaniyet ilkesi çerçevesinde istatistiğinin göre) düzgünlüğü zenginliğini içerir. Değerler broyler evin içinde 4 ayrı alan örneklerinin ortalama (standart sapma) temsil ve bir α = 0.05 düzeyinde ikili karşılaştırmalar arasındaki önemini belirlemek için kullanılmıştır. Bu tablonun büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kullanılan DNA ekstraksiyon yöntemi örneği daha önce 1,3,6 görülen DNA ekstraksiyon yöntemleri bağımlı doğasını analiz destekleyen, hem dışkı ve çöp örneklerin nicel ve nitel toplam bakteri topluluğu tahminleri etkilemiştir. Dışkı ve çöp numuneler hem için, DNA ekstraksiyon yöntemleri performans sırası nicel (Mekanik> Hybrid> Enzimatik) ve nitel (enzimatik> Hybrid> Mekanik) toplam bakteri topluluğu tahminleri için farklı oldu. Melez yöntem yüksek nicel veya nitel tahminler üretmek değil iken, her iki durumda da hibrid yöntemi böylece nitel ve nicel toplam en iyi kombinasyonunu üreten, yüksek performanslı ekstraksiyon yöntemi (Şekil 1, Tablo 2) istatistiksel olarak benzer sonuçlar ortaya Üç ekstraksiyon yöntemleri bakteriyel topluluk tahminleri test. Bu bakteri topluluğu profil dikkat NE gerekirBu çalışmada, (Şekil 2, Tablo 1) ve çevresel numuneler 4,5,8,9,11,12 kullanan diğer önceki çalışmalardan elde edilen sonuçlar görüldüğü gibi es güçlü bir DNA ekstraksiyon yöntemi ile gerçekleştirilebilir ve bu diferansiyel etkiler arasında güçlü bir may Çalışma verilerinin analizi ve yorumlanması etkilemektedir. Bunu bilerek, araştırmacılar güçlü onların örnek türleri ve çalışma-by-çalışmanın temelinde deneysel amaçlar için uygun ekstraksiyon yöntemi göz önüne almalıyız.
Yeni hibrid yönteminin etkinliği için bir anahtar bir adım Güçlü homojenizasyon ölçüde karmaşık dışkı / toprak matrislerinin değil sadece bakteriyel hücrelerin salınmasını yardımcı adım, aynı zamanda Gram-pozitif topluluk üyelerinin sert hücre duvarlarını yıkmak için . daha nicel olarak değerlendirilmesi (Şekil 1) ve bu homojenleştirme adımı kullanılır iki ekstraksiyon yöntemleri microbiomes olan Gram-pozitif Actinobacteria'lar ve Firmicutes yüksek oranda (
Bu yöntem, tarif edildiği gibi, kullanıcı farkında olması gerekir ki, bazı özel gereksinimlerini içerir. İlk olarak yüksek güçlü bir homojenleştirici kullanımı yanı sıra, ticari olarak satılan bir ekstraksiyon kiti bazı bileşenleri. Önceki çalışmalarda diğer mekanik boncuk yenerek adımları veya yüksek-enerjili homojenleştiriciler DNA ekstraksiyon verimini artırmak ve 4,5,9 verim göstermiştir; (farklı özel ekipman kullanımı gerekebilir rağmen) bu nedenle, mekanik homojenizasyon adımı farklı bir tip melez ekstraksiyon yöntemi entegre edilebilir. Ayrıca burada açıklanan hibrit yöntemi nedeniyle kanatlı örneklerinin 15 önceki toplum temelli çalışmalarda bu parçalama matrisin başarısı özellikle çevre örneklerinde için özel homojenleştirici için tasarlanmış ve boncuk yenerek tüpleri kullanan, 31-33. Bu gösterilmiş olmasından ötürü, son olarak, "altın standart" enzimatik DNA izolasyonu, (QIAamp DNA Dışkı Mini Kit) dışkı numuneleri kullanıldığında en etkili enzimatik ekstraksiyon yöntemi için, hibrit protokolünde numune DNA'nın enzimatik saflaştırılması için gerekli olan 3,18,19. Robotik iş istasyonu kullanımı (kiti ile talimatları elle yapılabilir) gerekli değildir iken, robotik iş istasyonu kullanımı büyük ölçüde, verimi artırır işleme hatası en aza indirir ve daha fazla alt analizi 7 için daha yüksek kalitede DNA sonuçları. Bu tip Otomasyon, mevcut mekanik kitleri kullanılarak hibrid yöntemi başka avantajı temsil eden, şu anda mevcut değildir.
Şu anda, bu protokol açıklanan robotik iş istasyonu 72 dakika içinde 12 numune maksimum işleme sınırlıdır, ancak ön çalışma bu yöntem daha yüksek verim workstati eşit iyi çalıştığını göstermiştirbu, 40 dakika içinde 96 örnekleri işleyebilir üzerinde (veri gösterilmemiştir). Daha fazla örnek tipik bir gün içinde, yarı otomatik bir şekilde işlenmiş olabilir çünkü bu kadar yüksek bir randıman seçeneği başka testleri, büyük ölçüde melez bir yöntem etkinliğini arttıracaktır. Ayrıca, bu yeni DNA ekstraksiyon yöntemi kullanılarak ön veriler diğer kümes hayvanları ile ilgili örnekler için etkili olduğunu göstermiştir (örneğin, deri / tüy durulama, karkas durulama, çekum içerik homojenatları) yanı sıra çevre örneklerinde (örneğin, tarımsal toprakların diğer türleri , domuz dışkı, dışkı at, keçi dışkısı, sığır dışkısı). Bu nedenle, gelecekteki çalışmalar birçok tarımsal ve çevresel örneklerden DNA çıkarılması için bu melez yöntemin etkinliğini belirlemek gerekir. Sonraki çalışmalarda bu yöntemin daha başka doğrulama potansiyel tarımsal ve çevresel ortamlarda çeşitli toplam bakteri topluluklarının değerlendirilmesi için bu yöntem geniş bir kabul olanak sağlayacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lysing Matrix E tube | MPBio | 6914-050 | Different sizes available and the last 3 numbers of the cat. No. indicate size (-050 = 50 tubes, -200 = 200 tubes, -1000 = 1,000 tubes) |
| Sodium Phosphate Solution | MPBio | 6570-205 | Can be purchased individually, or also contained within the FastDNA Spin Kit for feces (Cat. No. 116570200) |
| PLS Buffer | MPBio | 6570-201 | |
| Buffer ASL (560 ml) | Qiagen | 19082 | |
| FastPrep 24 homogenizer | MPBio | 116004500 | 48 x 2 ml HiPrep adapter (Cat. No. 116002527) available to double throughput of mechanical homogenization step |
| QIAamp DNA Stool Mini Kit | Qiagen | 51504 | |
| QIAcube24 (110V) | Qiagen | 9001292 | Preliminary results show that QIAcube HT (Cat. No. 9001793) can be used to improve throughput, but different consumables are required of this machine and more comparative work needs to be done. |
| Filter-Tips, 1,000 ml (1024) | Qiagen | 990352 | |
| Filter-Tips, 200 ml (1024) | Qiagen | 990332 | |
| QIAcube Rotor Adapters (10 x 24) | Qiagen | 990394 | For 1.5 ml microcentrifuge tubes included with in the rotor adapter kit there is an alternative. It is Sarstedt Micro tube 1.5 ml Safety Cap, Cat. No. 72.690 |
| Sample Tubes RB (2 ml) | Qiagen | 990381 | Alternative: Eppendorf Safe-Lok micro test tube, Cat. No. 022363352 |
References
- Maukonen, J., Simoes, C., Saarela, M. The currently used commercial DNA-extraction methods give different results of clostridial and actinobacterial populations derived from human fecal samples. FEMS microbiology ecology. 79, 697-708 (2012).
- Tang, J. N., et al. An effective method for isolation of DNA from pig faeces and comparison of five different methods. Journal of microbiological. 75, 432-436 (2008).
- McOrist, A. L., Jackson, M., Bird, A. R. A comparison of five methods for extraction of bacterial DNA from human faecal samples. Journal of microbiological. 50, 131-139 (2002).
- Ariefdjohan, M. W., Savaiano, D. A., Nakatsu, C. H. Comparison of DNA extraction kits for PCR-DGGE analysis of human intestinal microbial communities from fecal specimens. Nutrition journal. 9, 23 (2010).
- Carrigg, C., Rice, O., Kavanagh, S., Collins, G., O'Flaherty, V. DNA extraction method affects microbial community profiles from soils and sediment. Applied microbiology and biotechnology. 77, 955-964 (2007).
- Smith, B., Li, N., Andersen, A. S., Slotved, H. C., Krogfelt, K. A. Optimising Bacterial DNA Extraction from Faecal Samples: Comparison of Three Methods. The Open microbiology journal. 5, 14-17 (2011).
- Claassen, S., et al. A comparison of the efficiency of five different commercial DNA extraction kits for extraction of DNA from faecal samples. Journal of microbiological. 94, 103-110 (2013).
- Scupham, A. J., Jones, J. A., Wesley, I. V. Comparison of DNA extraction methods for analysis of turkey cecal microbiota. Journal of applied microbiology. 102, 401-409 (2007).
- Salonen, A., et al. Comparative analysis of fecal DNA extraction methods with phylogenetic microarray: effective recovery of bacterial and archaeal DNA using mechanical cell lysis. Journal of microbiological methods. 81, 127-134 (2010).
- Peng, X., et al. Comparison of direct boiling method with commercial kits for extracting fecal microbiome DNA by Illumina sequencing of 16S rRNA tags. Journal of microbiological. 95, 455-462 (2013).
- Yuan, S., Cohen, D. B., Ravel, J., Abdo, Z., Forney, L. J. Evaluation of methods for the extraction and purification of DNA from the human microbiome. PloS one. 7, 33865 (2012).
- Qu, A., et al. Comparative Metagenomics Reveals Host Specific Metavirulomes and Horizontal Gene Transfer Elements in the Chicken Cecum Microbiome. PloS one. 3, 2945 (2008).
- Sekelja, M., et al. Abrupt temporal fluctuations in the chicken fecal microbiota are explained by its gastrointestinal origin. Applied and environmental microbiology. 78, 2941-2948 (2012).
- Oakley, B. B., et al. The Poultry-Associated Microbiome: Network Analysis and Farm-to-Fork Characterizations. PloS one. 8, 57190 (2013).
- Cook, K. L., Rothrock, M. J., Eiteman, M. A., Lovanh, N., Sistani, K. Evaluation of nitrogen retention and microbial populations in poultry litter treated with chemical, biological or adsorbent amendments. Journal of environmental management. 92, 1760-1766 (2011).
- Rothrock, M. J., Cook, K. L., Warren, J. G., Eiteman, M. A., Sistani, K. Microbial mineralization of organic nitrogen forms in poultry litters. Journal of environmental quality. 39, 1848-1857 (2010).
- Rothrock, M. J., Cook, K. L., Warren, J. G., Sistani, K. The effect of alum addition on microbial communities in poultry litter. Poultry science. 87, 1493-1503 (2008).
- Li, M., et al. Evaluation of QIAamp DNA Stool Mini Kit for ecological studies of gut microbiota. Journal of microbiological. 54, 13-20 (2003).
- Dridi, B., Henry, M., El Khechine, A., Raoult, D., Drancourt, M. High precalence of Methanobrevibacter smithii and Methanosphaera stadtmanae detected in the human gut using an improved DNA detection protocol. PloS one. 4, 7063 (2009).
- Harms, G., et al. Real-time PCR quantification of nitrifying bacteria in a municipal wastewater treatment plant. Environmental science and technology. 37, 343-351 (2003).
- Rothrock, M. J. Comparison of microvolume DNA quantification methods for use with volume-sensitive environmental DNA extracts. Journal of natural and environmental sciences. 2, 34-38 (2011).
- Navas-Molina, J. A., et al. Methods in Enzymology. DeLong Edward, F. 531, Academic Press. 371-444 (2013).
- Caporaso, J. G., et al. Ultra-high-throughput microbial community analysis on the Illumina HiSeq and MiSeq platforms. The ISME journal. 6, 1621-1624 (2012).
- Caporaso, J. G., et al. Global patterns of 16S rRNA diversity at a depth of millions of sequences per sample. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 Suppl 1, 4516-4522 (2011).
- Caporaso, J. G., et al. QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data. Nature methods. 7, 335-336 (2010).
- Edgar, R. C., Haas, B. J., Clemente, J. C., Quince, C., Knight, R. UCHIME improves sensitivity and speed of chimera detection. Bioinformatics. 27, 2194-2200 (2011).
- Edgar, R. C. Search and clustering orders of magnitude faster than BLAST. Bioinformatics. 26, 2460-2461 (2010).
- DeSantis, T. Z., et al. Greengenes, a chimera-checked 16S rRNA gene database and workbench compatible with ARB. Applied and environmental microbiology. 72, 5069-5072 (2006).
- Caporaso, J. G., et al. PyNAST: a flexible tool for aligning sequences to a template alignment. Bioinformatics. 26, 266-267 (2010).
- Price, M. N., Dehal, P. S., Arkin, A. P. FastTree 2–approximately maximum-likelihood trees for large alignments. PloS one. 5, 9490 (2010).
- Cook, K. L., Rothrock, M. J., Lovanh, N., Sorrell, J. K., Loughrin, J. H. Spatial and temporal changes in the microbial community in an anaerobic swine waste treatment lagoon. Anaerobe. 16, 74-82 (2010).
- Cook, K. L., Rothrock, M. J., Warren, J. G., Sistani, K. R., Moore, P. A. Effect of alum treatment on the concentration of total and ureolytic microorganisms in poultry litter. Journal of environmental quality. 37, 2360-2367 (2008).
- Lovanh, N., Cook, K. L., Rothrock, M. J., Miles, D. M., Sistani, K. Spatial shifts in microbial population structure within poultry litter associated with physicochemical properties. Poultry science. 86, 1840-1849 (2007).
