Abstract
Skadde CNS aksoner klarer å regenerere og ofte trekkes bort fra skadestedet. Aksoner forskånet fra den første skade kan senere gjennomgå sekundær aksonal degenerasjon. Mangel på vekst kjegle formasjon, gjenfødelse, og tap av ytterligere myelinerte aksonale anslag i ryggmargen i stor grad begrenser nevrologisk restitusjon etter skade. For å vurdere hvordan sentrale myelinerte axoner i ryggmargen svare på skade, har vi utviklet en ex vivo lever ryggmarg modell utnytte transgene mus som uttrykker gul fluoriserende protein i axoner og et samlings og svært reproduserbare laser-indusert ryggmargsskade å dokumentere skjebne axoner og myelin (lipofile fluorescerende fargestoff Nile Red) over tid ved hjelp av to-foton eksitasjon time-lapse mikroskopi. Dynamiske prosesser som akutt nerveskaden aksonal tilbaketrekking, og myelin degenerasjon er best studert i sanntid. Imidlertid, den ikke-fokal natur kontusjon baserte skader og bevegelse gjenstander støttunder in vivo ryggmarg bildebehandling make skille primære og sekundære nerveskaden svar gjennom høy oppløsning mikros utfordrende. Ex vivo ryggmarg modellen beskrevet her etterligner flere aspekter av klinisk relevante kontusjon / komprimering-indusert aksonale patologier inkludert aksonal hevelse, spheroid formasjon, aksonal tran, og peri-aksonal hevelse som gir en nyttig modell for å studere disse dynamiske prosesser i sanntid. Store fordelene med denne modellen er utmerket spatiotemporal oppløsning som tillater differensiering mellom primær fornærmelse som direkte skader axoner og sekundære skademekanismer; kontrollert infusjon av reagenser direkte til perfusatet bading ledningen; presise endringer av miljø miljøet (for eksempel kalsium, natrium ioner, kjente bidragsytere til aksonal skade, men i nærheten umulig å manipulere in vivo); og murine modeller har også en fordel, da de gir en mulighet til å visualisere ogmanipulere genetisk identifisert celle populasjoner og subcellulære strukturer. Her beskriver vi hvordan du isolerer og bilde levende ryggmargen fra mus til å fange dynamikken i akutt nerveskaden.
Introduction
Degenerasjon av aksoner er en fremtredende årsak til sykelighet spenner over flere nevrologiske tilstander inkludert neurotrauma, hjerneslag, autoimmune, og nevrodegenerative sykdommer. I motsetning til det perifere nervesystem (PNS), sentralnervesystem (CNS) aksoner har en begrenset kapasitet til å regenerere en gang skadet på grunn av både indre og ytre barrierer (dvs. inhibitoriske molekyler til aksonal vekst produseres under arrdannelse og frigjøres under myelin degenerasjon) 1 -7. Selv om flere av disse barrierene har blitt grundig utforsket, til terapeutiske intervensjoner rettet forhindre CNS aksonal degenerasjon, fremme robust aksonal gjenfødelse og gjenopprette funksjonelle connectively, forbli begrenset.
Aksoner gang separert fra sin soma gjennomgå en stereotype prosessen med degenerasjon kjent som Wallerian degenerasjon som er preget av aksonal hevelse, spheroid dannelse og eventuell fragmentering (anmeldt i 8). IDerimot den proksimale stubbe som forblir i kontinuitet med soma av en transektert perifer axon, danner en hevelse ved sin ende, dør tilbake til den nærmeste noden Ranvier, og kan så initiere veksten kjegle formasjonen, en viktig forutsetning er nødvendig for etterfølgende aksonal regenerering 9-11. I kontrast til de proksimale aksonale avslutninger av mange sentrale aksoner danner karakteristiske «endbulbs" eller tilbaketrekk pærer, ikke klarer å danne vekst kjegler, og i stedet trekke bort fra skadestedet hvor de forblir i månedsvis etter skade 12-15. I tillegg til den primære nerveskaden kan ytterligere aksonal skade / tap også skje til axoner som ble stort sett forskånet fra den første skade. Dette forsinket aksonal tap av opprinnelig spart aksoner er referert til som sekundære aksonal degenerasjon. Denne iboende respons på CNS axoner til skade gjengir funksjonell aksonal regenerasjon en enda vanskeligere mål å oppnå i hjernen og ryggmargen.
Selv hallmarks av aksonal skade (for eksempel, spheroid formasjon, inntrekk av pærer) har blitt godt preget av post-mortem vev og eksperimentelle modeller av aksonal degenerasjon, har klarlegging av de molekylære mekanismene bak disse dynamiske prosesser vært begrenset. De fleste av disse studiene støttet seg på statiske endepunkt observasjoner som iboende ikke klarte å fange opp individuelle aksonale svar over tid. Selv om eksogent tilført aksonale sporstoffer har vært nyttig å belyse aksonale svar fra statiske seksjoner og under live bildebehandling, har tilgjengeligheten av genetisk kodet aksonale markører kraftig forbedret vår evne til å visualisere axoner i sanntid ved hjelp av fluorescens mikroskopi. Faktisk, en banebrytende rapport fra Kerschensteiner og kolleger først gitt direkte bevis på aksonal degenerasjon og regenerasjon in vivo ved hjelp Thy1 -GFP-S mus som koder grønt fluorescerende protein i undergrupper av nevroner som sender sine anslag i ryggsøyler i ryggledningen 16. Live-avbildning tilnærminger bruker to foton laserskanning mikroskopi (TPLSM) og genetisk fluorescerende protein merking av celler av interesse fortsetter å gi direkte bevis og mekanistisk innsikt i mange ulike dynamiske prosesser som aksonal degenerasjon, Ca 2+ signalering, aksonal regenerasjon, astrocyte fysiologi, microglial fysiologi, og respons på skade 17-25.
I motsetning til axoner, er svært lite kjent av myelin svar til skade i sanntid. Myelin er en viktig komponent i hvit substans produsert og vedlikeholdt av oligodendrocytter i CNS og Schwann celler i PNS. Myelin isolerer 99% av overflaten av axoner og dermed gir en høy motstand, lav kapasitans beskyttende dekke som støtter rask og effektiv saltatory impuls forplantning, nylig gjennomgått av butter et al. 26. For å fange den dynamiske responsen av myelin til skade vi bruker solvatochromic, lipofilefluorescerende fargestoff Nile Red 27. De solvatochromic egenskaper av denne viktige flekken tillate spektrale endringer av dens emisjonsspektrum som er avhengig av fysikalsk-kjemiske miljøet 28,29. Disse egenskapene er nyttig å få innsikt i mekanismene for axomyelinic skade og kan visualiseres ved hjelp av riktig utvalgte dichroics og emisjonsfiltre eller løses ved hjelp av spektral mikros 27. For eksempel er Nile Red største emisjonsspektrum blå forskjøvet i mindre polare, fettrike miljøer så som de som finnes i adipocytter og normal CNS myelin (topp emisjons ~ 580-590 nm) 27. I kontrast til dette viktige fargestoff utslipp spektrum topper på ~ 625 nm i endbulbs dannet som axoner gjennomgå aksonal dieback 27. Selv om de nøyaktige mekanismene bak disse spektrale skift spesielt i endbulbs versus normal myelin fortsatt uklare, kan slike spektrale endringer avsløre underliggende endringer i protein opphopning eller uorden fører tileksponering av hydrofobe bindingsseter 27.
Mens in vivo avbildning er det ultimate målet for å observere ryggmargs aksonal skade dynamikk i sitt opprinnelige miljø, er det teknisk utfordrende og krever betydelig kirurgisk kompetanse, og ofte gjenta operasjoner for å eksponere rygg kolonne som kan introdusere eksperimentelle artefakter (f.eks betennelse og arr Formasjonen). I tillegg er kostbart utstyr ofte nødvendig for å tillate fjæring og posisjonering av et intakt dyr under mikroskop objektivlinse. Dyrene må overvåkes nøye i tillegg til å sikre at de forblir varm, for å sikre væsker er fylt opp, og for å sikre at det ikke er noen tegn til hypoksi på grunn av langvarig bedøvet bilde økter. Sistnevnte er ekstremt viktig som axoner og myelin krever absolutt konstant perfusjon og tilstrekkelig oksygennivå for å være levedyktig. Imidlertid er dette ofte ikke rapportert eller overvåkes i de fleste in vivo studier for ådato. I tillegg bevegelse gjenstander på grunn av hjertefrekvens og pust (isofluran bedøvet voksen mus: ~ 300-450 slag pr min (BPM) er optimalt å opprettholde 97-98% oksygenmetning (normal hastighet ~ 632 BPM) og ~ 55-65 åndedrag per min (normal hastighet er ~ 163 pust per min), henholdsvis)) 30 påtruffet under in vivo ryggmarg bildebehandling make skille primære og sekundære nerveskaden svar gjennom høy oppløsning fluorescens mikros utfordrende så selv de raskeste laserskanning uunngåelig er underlagt disse bevegelse artefakter. Fremskritt i superraske resonans skannere kombinert med en implanterbar stivt ryggvirvel innrammet vinduet kan tillate avbildning av den murine ryggmargen i våkne dyr, men raskere skanne ganger uunngåelig reduserer signal-til-støy-forholdet degraderende bildekvalitet. Ytterligere forbedringer i ryggmargen avbildningsteknikker som i dag brukes for avbildning av hjernen kan overvinne mange av disse hindringene og begrense potensielle confounds introdusert av inadequate vevsperfusjon, f.eks 31-33.
Mye av det som er kjent om hvit substans fysiologi og mekanismer for hvit substans skade er fastsatt ved bruk in vitro eller ex vivo preparater av hvit substans fra synsnerven, perifer nerve, og strimler av ryggmarg hvit substans 34-41. Disse forberedelsene fortsette å fremme vår kunnskap om hvite materie skademekanismer som de tillater kontrollert endringer i miljøfaktorer, kontrollert anvendelse av narkotika og reagenser, funksjonelle vurderinger som bruker elektrofysiologi, og direkte fluorescens mikros observasjoner av axoner og myelin i levende vev. Likevel, til noen tidligere tilnærminger observere axoner fra ryggmarg ryggkolonne strimler eller ventral hvit substans strimler uunngåelig skade overflate axoner under fjerningen scene som kan påvirke responsen av nært motsetning aksoner. Å kapitalisere på de eksperimentelle manipulasjoner over og unngå skade på very fibrene under etterforskning, bruker vi en ex vivo cervical ryggmargs modell som det hindrer direkte kontakt med dorsal del av ledningen. Dermed arkitektur av pia mater og tilstøtende overfladisk ryggkolonne axoner forbli levedyktig og uaffisert under isolasjon.
Her beskriver vi en relativt enkel tilnærming som tillater direkte visualisering av sentrale myelinerte axoner som de dynamisk svare på et fokus skade i sanntid opp til 8 - 10+ timer etter skade. Laser-indusert ryggmargsskade (Lisci) modellen tillater differensiering mellom primære og sekundære aksonal skademekanismer som primær lesjon (ablasjon stedet) forblir romlig begrenset over tid. Den åpne bad bildekammeret er tilgjengelig for terapeutisk intervensjon, reagent levering, og miljø manipulasjoner. Antatte axomyelinic beskyttende agenter kan raskt vurderes i sanntid ved direkte observasjoner versus lange og kostbare eksperimenter som involverer vev prosessing, seksjonering, farging, bildeopptak, og analyse og derfor gir en nyttig surrogat modell for å vurdere akutte reaksjoner og beskyttende manipulasjoner før du tester de eksperimentelle agenter i levende dyr.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
MERK: Alle dyr prosedyrer ble utført under retningslinjer fastsatt av Institutional Animal Care og bruk komité ved University of Louisville, å følge føderale forskrifter.
1. Utarbeidelse av lav Ca 2+ og 2 mM Ca 2+ Kunstig cerebrospinalvæsken (aCSF) Perfusates
- Forberede 2x lav Ca 2+ (0,1 mm) Stock C buffer, 2x normal Ca 2+ (2 mm) Stock En buffer, og 2x Stock B buffer som beskrevet i tabell 1. De individuelle lagerløsninger tillate endring av ion innhold (f.eks lav eller null Ca2 +) og kan lagres ved 4 ° C i opp til en måned.
- For intrakardiell perfusjon under disseksjon, tilsett 100 ml 2x lav Ca 2+ Stock C og 100 ml 2x Stock B inn i en plastflaske for å gjøre 1x lav Ca 2+ aCSF. Bland og oppbevar natten ved 4 ° C eller gjøre frisk.
- For perfusjon av ex vivo ryggmargen under imaging, tilsett 500 ml 2x normal Ca 2+ Stock A og 500 ml 2x Stock B inn i en 1 liters glassflaske for å generere 1x aCSF. Bland og oppbevar ved romtemperatur over natten eller gjøre frisk.
- Justere pH aCSF buffere til 7,4. Samtidig som aCSF ved romtemperatur, plasserer den lave Ca 2+ aCSF på is og deretter boble begge buffere med karbogen gass (95% O 2; 5% CO2) i 30 min før bruk og kontinuerlig under perfusjon.
2. Utarbeidelse av Ex Vivo Imaging Chamber
- Vikle en varmeteppe (ingen automatisk avslåing) rundt aCSF flaske og justere varmen til lav / middels innstilling.
- Sett en dedikert aCSF perfusjonslinjen i flasken koblet til en pumpe og perfusjon i-varmeapparat som styres av en bipolar temperaturregulator og tilbaketemperatursonde som vist i figur 1A.
- Fest en flat mikroskop scenen innsats (152 x 102 mm) til 2-foton eksitasjon / confocal objektbord utstyrt med en utslipps beholder.
- Plasser en stor åpen bad perfusjon kammer (B x L x H; 12 x 24 x 8 mm) i utslippet container for å imøtekomme og gi kontinuerlig strøm av frisk oksygenrikt aCSF til ex vivo ryggmargen (se Figur 1B for en passende ex vivo avbildning kammer design).
- Koble in-line varmeapparat metall utgang til ex vivo avbildning kammer ved hjelp av passende slange. Plassere en tynn absorberende pute under ex vivo avbildning kammeret for å opprettholde temperaturen i buffer / vev under avbildning.
- Følge ex vivo avbildning kammer til bunnen av utslippet container / sceneinnsats ved hjelp av flyttbare klebrig tack. Den formbarhet av den klebrige klebe tillater kammeret å bli justert etter behov for å sikre at målet lysbane er vinkelrett på vevsoverflaten. Om nødvendig, bruk en bullseye nivå for å justere kammer.
- Sikre enin-line varmeapparat tilbakemelding temperatursonde i nærheten av kammerets væskeinnløp og et rustfritt stål sugerør forbundet med en vakuumledning ved kammerets utløp. Magnetisk tape og hensiktsmessig Mikropipette holdere er nyttig i denne forbindelse. Slå på vakuumkilde.
- Slå på perfusjonspumpeanordningen å begynne å fylle bilde kammer med oksygenrikt aCSF. Still perfusjonspumpeanordningen til 1,5-2 ml per min.
- Kontrollere volumet av aCSF i avbildningskammeret ved å justere vakuumledning. Det er viktig at det er nok aCSF i avbildningskammeret for å dekke ryggmargssegmentet og gi tilstrekkelig arbeidsavstand mellom en vanndypp objektiv og vevsoverflaten. Myelin og aksoner kan ugunstig påvirket hvis vevet segmentet ikke er helt nedsenket i frisk oksygenrikt aCSF fører til eksperimentator-induserte gjenstander.
- Juster in-line varmeapparat temperaturregulator, slik at perfusatet temperatur i avbildningskammeret er nær romtemperatur.
- Avlive en voksen 6-10 uker gamle thy1 -YFP transgen mus (bruke passende stamme som har fluorescerende protein ekspresjon i dorsal root ganglion neuroner) ved injeksjon av en overdose av anestesi natriumpentobarbital (200 mg / kg) via intraperitoneal injeksjon.
- Når under riktig nivå av anestesi (f.eks, ingen reaksjon til tå klype og tap av blunkerefleksen), nøye barbere huden overliggende ryggmarg og hjerne med kirurgiske Clippers. Rens huden ved hjelp av Betadine og 70% etanol pads.
- Spray bryst / mage område med 70% etanol, deretter perfuse emnet transcardially bruker kjølt, carbogen-boblet lav Ca 2+ aCSF. (Se figur 1C for foreslått disseksjon benk topp satt opp).
- Som leveren blekner, sikre perfusjon nål inn i hjertet ved hjelp av et lite klipp. Snu faget for å få tilgang barbert ryggsiden avfaget og tørk det barberte området med 70% etanol.
- Lag en rygghuden snitt langs midtlinjen fra nesen til hip hjelp disseksjon saks å utsette hjernen og ryggsøylen (Figur 2A). Sikre forberedelse ved å plassere pinnene på nesen og haunch.
- Ved hjelp av et mikroskop disseksjon fra dette punkt, fast skjære over den dorsale overflaten av kraniet på nivået av olfactory pærer. Sett en av sakse tuppene inn i sidekantene av snittet og skåret langs kantene av kalott bilateralt til cerebellum.
MERK: Ikke helt eksisere skullcap som det er behov for senere å løfte overliggende vev fra ryggmargen gjennom disseksjon (se figur 2B). - Løft skullcap å utsette hjernen. Forsiktig kuttet venstre og høyre kant av interparietal bein (plassert på lillehjernen) og trekk den tilbake caudally å eksponere hjernestammen / ryggmargen (Figur 2C
- Bruk fin tippet saks holdt i en 45 ° vinkel til bordet overflaten og kutte ryggvirvlene bilateralt bare dårligere enn de bakre nerverøtter.
MERK: Unngå kontakt med de lyse hvite ryggsøyler. Disse fibrene er de som vil bli fotografert (figur 2D) og kan lett skadet. - Løft skullcap og dorsalflate virvelsøylen med fine tippet tang, trekke forsiktig liggende vev i ett stykke som kutt er laget for å eksponere ryggmargen. Fortsetter å kutte ryggvirvler til øvre thorax nivå for å isolere en 1-2 cm segment av livmorhals ledningen for påfølgende imaging (2E).
- Bruk saks til å klippe vev / bein parallelt med ryggsøylen og klar vevet under kolonnen. Gjøre disse kuttene som nivå som mulig. Det er svært viktig at vevet ligger flatt i kammeret slik at ledningen er nivået for bildebehandling.
- Bruk en # 11 skalpell til tversgående hjernestammen (forbiavslutning av gracile fasciculus fibre), og ved den øvre brystnivå for å isolere cervical ryggmargssegmentet (se figur 2F). Bruk saks til å klippe vev / bein på de samme to punkter. Den isolerte vev skal inneholde 2/3 av virvelsøylen omfatter halehjernestammen, cervical utvidelse, og øvre thorax ryggmargen (figur 2G).
- Plasser den isolerte ryggsøylen i en petriskål av carbogen-boblet, kjølt lav Ca 2+ aCSF. Hvis det er nødvendig, trimme vevet under ryggsøylen til det ligger flatt i fatet.
- Overføre den isolerte ryggsøylen til ex vivo avbildning kammeret og gradvis øke perfusatet temperatur i løpet av 1 time til 36 - 37 ° C. Opprettholde denne temperaturen under avbildning.
4. Plassering av Ex Vivo Spinal Cord inn Imaging Chamber og Myelin Merking med Nile Red
- Sikre nøye virvelsøylen i jegmaging kammer med en passende passende skive hold ned modifisert med en vertikal rutenett plattform bestående av fine Lycra tråder (fjern middel tråder av rutenettet plattform for å gi plass til ryggmargen, se figur 3A).
- Tine en delmengde av Nile Red (5 mM stamløsning i DMSO og 0,22 um filtrert, kan lagres i en måned ved 4 ° C, eller i 6 måneder ved -20 ° C i mørket). Like før tilsetning av Nile Red til avbildningskammeret, redusere strømmen av perfusjon pumpen og justere vakuumledning for å sikre at fluidet i kammeret alltid dekker ryggmargen.
- Legg 5-10 ul Nile Red stamoppløsning til avbildningskammeret nær den kaudale enden av ledningen (figur 3B). Bruk av en 1 ml pipette for å forsiktig blande Nile Red gjennom kammeret. Tillate Nile Red å bo i kammeret for 1-2 min, deretter plassere vakuum linje tilbake og justere perfusjonspumpeanordningen til 1,5-2 ml pr min til kontinuerlig perfuse ryggmargen.
- Heve nøye mikroskop scenenog justere målet med midten av ryggmargen segment og medialt i de dorsale kolonnene før nedsenking i vann målet er ca. 10 mm fra overflaten av aCSF i kammeret. Bruke mikroskop nosepiece fokushjulet til sakte bringe objektiv ned til den så vidt berører overflaten av aCSF. Bruk en epifluorescent lyskilde for å fokusere dorsal kolonner inn i synsfeltet (Figur 3C).
5. Ex Vivo Imaging av Mouse Spinal Cord med TPLSM og Laser-indusert ryggmargsskade (Lisci)
MERK: posterior vene gir en nyttig markør for å sentrere vev som gracile fasciculus fiber (stammer fra celle kroppen av ryggmargen og stige fra T6 og under langs midtlinjen av ryggmargen) kjøres parallelt med denne blodåre. Tykkere YFP + cervical rygg rot anslag gir også en nyttig markør som fiber stige og stige ned sidelengs til YFP + gracile fasciculus fiber som er mindre i diameter.
- Når ryggmargen vev er justert riktig, for å bytte til laserskanning modus utføre baseline avbildning av de stigende gracile fasciculus myelinerte fibre. Å opphisse både YFP og Nile Red, bruke en to-foton laserkilden innstilt til 950 nm bølgelengde (~ 17 mW målt ved utkjørselen av en 25X, 1,1 NA objektiv) og egnede dichroics (DM) og båndpassfiltre for å isolere Fluorescensemisjonen av fluoroforene (vi bruker 525/50 DM560, 600/60 DM640, og 685/70, å skille YFP, og Nile Red inn i gul-oransje, og utvidet røde kanaler, henholdsvis).
- Hvis mer enn 3% av axoner viser aksonale kuler under baseline imaging (30-60 min), forkaste forberedelse på grunn av eksperiment-indusert gjenstander.
- Indusere en Lisci ved å forstørre synsfeltet til 30.3X (for å lage en ~ 20 mikrometer i diameter ablasjon). Tune laser til 800 nm, og øke strømmen av laseren til ~ 110 mW vedprøven. Tillate 5 komplett synsfelt laserskanning for å sikre fibrene er helt transektert.
- Bekreft Lisci ved å endre laser innstillinger tilbake til bildeinnstillingene (950 nm, 17 mW ved prøven, 2.08X) og skanne vev for å visualisere ablasjon. Kontroller diameteren av ablasjon og at de primære ablasjon aksoner er fullstendig transektert (se figur 3D). Bruke time-lapse-innstillingene på mikroskopet kombinert med z-fangst for å spille inn den dynamiske responsen av axoner og myelin til skade opp til 8-10 + hr etter skade.
MERK: Hvis ablasjon er ufullstendig (dvs. ufullstendig tran av fiber), forkaste forberedelse, som fastsettelse av primære og sekundære skademekanismer vil bli til skamme. I tillegg kan isolerte ryggmargssegmenter avbildes opp til 24 timer post-Lisci med bare mild til moderat Lisci uavhengig vevsskade.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Detaljer av en egnet laboratorium satt opp for å isolere, opprettholde levedyktighet og bilde ex vivo ryggmargen er vist i figur 1. Mikroskopet må være utstyrt med en fleksibel femtosecond pulset laser, egnede dicroics og emisjonsfiltre, og en vann- dyppe objektiv med høy numerisk apertur (≥1.0). For å sikre levedyktighet av ryggmargen i løpet av disseksjon, bør fremgangsmåten utføres i nærvær av kjølt oksygenert lav Ca2 + aCSF som tillater nok Ca2 + for de isolerte aksonal membraner for å forsegle 42. Unnlatelse av å gjøre dette kan forårsake axomyelinic skade inkludert separasjon av myelin fra axolemma og aksonal spheroid dannelse godt synlig under baseline bildebehandling. Representative bilder av disseksjon prosessen og isolering av den ex vivo ryggmargen er vist i figur 2. Følgende isolering av levedyktigheten av ryggmargen er maintained ved kontinuerlig perfusjon av oksygenrikt aCSF som holdes på 36-37 ° C. Myelin flekken Nile Red 27,43 kan da bli lagt til perfusjon kammeret, og baseline innspillinger av gracile fasciculus myelinerte axoner kan starte (figur 3).
Representative bilder av gracile fasciculus myelinated axoner er vist i figur 4. Under baseline forhold timelapse TPLSM opptak avslører parallelle justert YFP + axoner ensheathed i myelin (Nile Red) med stort sett konstant diameter langs lengden av aksonet. Noen aksonale kuler eller andre morfologiske tegn på aksonal degenerasjon er til stede. På grunn av de solvatochromic egenskapene til Nile Red og lipid og protein innhold av myelin, er myelin farget gul-oransje, mens rekker av antatte oligodendrocyte celle organer mørkere oransje (Figur 4A). Fine detaljer som noder av Ranvier kan også løses (f.eks piler i På 10 min etter Lisci, umiddelbart transektert aksoner (primær skade) ligger rostralt og kaudalt for ablasjon stedet begynne å trekke bort fra skadestedet og danne sigmoidal-lignende spoler innenfor hovne ballong myelin. Myelin ensheathing aksoner fjernkontroll til ablasjon vises uendret på dette tidspunktet. Etter 40 min post-Lisci mest primære transektert axoner og aksoner gjennomgår sekundær degenerasjon (dvs. opprinnelig spart fra fornærmelse, men senere degenerert) danner karakteristiske endbulbs som de trekke fra lesjon området (Figur 4B). Omtrent en tredjedel av disse transektert aksoner gjennomgå pan-fragmentering, hvor det proksimale segment først sveller, danner aksonal sfæroider, og til slutt transects axon i flere uregelmessige lengder av axon 43. Separasjon av myelin fra axoner (peri-aksonale hevelse) og vesicular degenerasjon av myelin er også tydelig. Over tid, primær og sekundær transected aksoner fortsetter trekke vekk fra lesjon området, axoner umiddelbart flankerer ablasjon nettstedet gjennomgå sekundær degenerasjon, og peri-aksonal hevelse blir mer fremtredende samt myelin hevelse og vesicular degenerasjon (Figur 4D-G, se også 43). En klar forskjell i omfanget av aksonal tilbaketrekking blir tydelig mellom proksimale aksonale stubber (caudal til lesjon) og deres distale segmenter (rostral til lesjon) som er bestemt til å gjennomgå Wallerian degenerasjon (Figur 4D-G). Axoner utgangspunktet spart ved Lisci gjennomgå forsinket sekundær degenerasjon (figur 4H). En representativ kontrolleksperiment uten Lisci, tyder på at lange avbildnings økter (opp til 13 timer etter ledningen isolasjon i dette eksempel) er mulig uten å forårsake ugunstige effekter til hvit substans integritet (Figur 4I, J). Representant høy resorensning bilder av axomyelinic endringer etter Lisci er vist i figur 5. Etter tre timer etter Lisci, har flere proksimale (caudal) aksoner trukket vekk fra lesjon området der de holder seg innenfor hovne myelin rør som har skilt vekk fra aksonet. Andre aksonale endbulbs ser ut til å være begrenset av myelin (figur 5A). Axoner i tilknytning til ablasjon nettstedet gjennomgå sekundær degenerasjon mens andre synes upåvirket. YFP lave / negative antatte vesikler (blek blå) innenfor axon og aksonale endbulbs er også til stede. I motsetning til caudally trekke fiber, er de fleste av de rostrally Retracting aksonale endbulbs og kuler på tre timer etter Lisci sterkt merket med Nile Red (mindre blå forskjøvet) indikasjon på en miljøendringer innenfor axon (Figur 5B). Nile Red-merkede områder innenfor aktivt å trekke tilbake aksoner ser ut til å hovedsakelig surround eller cap aksonal kjerne. Selv om den nøyaktige plasseringen og identity av disse intra-aksonale Nile Red-merket strukturer er foreløpig ukjent, kan de representere tette vesikkel opphopning via aksonal transport og / eller spaltede proteiner utsette sine hydrofobe kjerne 27. Nile Red-merket myelin forblir hovedsakelig gulorange i normal vises myelin. I skillet, Nile Red undersøkt vesicular myelin vise gult (dvs. blå forskjøvet) indikasjon på miljøendringer innenfor disse strukturene. Etter 7 timer etter Lisci aksoner fortsette trekke bort fra lesjon området; men dette er mer tydelig i rostralt (Figur 5D) versus caudal (figur 5C) endbulbs. Andre aksoner gjennomgå hel eller delvis oppløsning forlater en tom myelin rør eller en tynn stilk flere mikrometer unna degenereres segmentet. Forsinket anvendelse av Nile Red etter Lisci avslører lignende aksonal merking som pre-anvendelse av Nile Red tankevekkende at ablasjon per se og potensielle termiske effekter på protein denaturering erusannsynlig ansvarlig for Nile Red spektrale endringer i myelin og aksoner etter skade (figur 5E, F). Sammen er disse data illustrerer nytten av ex vivo Lisci modell for å etterligne kjente men dårlig forstått mekanismene for akutt axomyelinic skade i sanntid. Modellen kan derfor være nyttig å videreutvikle vår kunnskap om patofysiologien av hvit substans skade, og avdekke viktige molekylære mål å bevare hvit substans integritet. 
Figur 1: Oversikt over disseksjon og bildeoppsettet. (A) En foreslått satt opp for ex vivo avbildning av ryggmargen. Den store utstyr som er nødvendig innbefatter en karbogen (95% O2 / 5% CO2) gassledning oksygenering av aCSF, en perfusjon pumpe for å levere karbogen-Bubblødde aCSF gjennom en in-line varmeapparat / temperaturregulator-enhet utstyrt med en temperatur tilbakemelding sonde, og en åpen-bad utformet avbildningskammeret utstyrt med en vakuumkilde. (B) En større forstørrelse på bildebadet kammeret er vist. (C) En foreslått satt opp for perfusjon og disseksjon av ex vivo ryggmargen. Kjølt lav Ca 2+ aCSF tilføres oksygen med carbogen og brukes til å opprettholde levedyktigheten av ryggmargen under disseksjon. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. 
Figur 2:. Isolering av ryggmargen for imaging (A) Under kontinuerlig kjølt, oksygenrikt lav Ca 2+ perfusjon det skulLCAP er eksponert. (B) Et snitt er gjort gjennom den dorsale overflaten av kraniet på nivået av olfactory pærer (stiplet linje). (C) Bilaterale innsnitt blir så gjort gjennom de laterale kanter av den kalott inntil det kan være forsiktig løftes og trekkes caudally (i pilens retning) for å avdekke hjernestammen. (D) Fortsett bilaterale snitt med fin tippet saks for å klippe den laterale sider av ryggvirvler og utsetter dorsal kolonner (pilspiss). (E) Den eksponerte hjernestammen og hele cervical utvidelse til den øvre thorax segment av ryggmargen blir vist. (F) To snitt med en rekke 11-skalpell blad er laget for å isolere ryggmargen på hjernestammen, utover gracile fasciculus aksonale avslutninger og øvre thorax nivå ( stiplede linjer). (g) isolert ryggmarg blir deretter overført til en petriskål inneholdende kjølt lav Ca2 + aCSF bobletcarbogen gass. Livmorhals Dorsalrøttene (f.eks pilspisser), dorsal root ganglion, og ryggmargen fra øvre thorax segment til hjernestammen (~ 15-20 mm) er intakt. Skala bar i G:. 2 mm Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. 
Figur 3:. Imaging ex vivo ryggmarg (A) Når plassert i kammeret, er ryggmargen vev sikret ved hjelp av en modifisert vev / skive hold nede utstyrt med Lycra tråder (B) myelin flekken Nile Red legges direkte til. avbildningskammeret. (C) En vann-nedsenking Målet er neddykket i det aCSF og plassert over de gracile fasciculus fibre. 
Fig. 4: Lisci modell av det sentrale myelinated axon skade TPLSM ble benyttet for å fange opp dynamikken i axon og myelin responser følgende Lisci (*). Representative bilder vises som maksimal intensitet projeksjoner av fem 1 mikrometer tykke optiske seksjoner fanget på 0,24 mikrometer / pixel med en Nikon A1RMP + multiphoton / konfokal mikroskop utstyrt med en 25X; NA: 1.1; WD: 2 mm vann nedsenking objektiv. Standard dichroics og emisjonsfiltre ble brukt for å skille YFP + axoner (525/50 DM560, vist i blått) og solvatochromic lipofile fluorescerende fargestoff Nile Red inn i kortere (600/60 DM640, vist i grønt) og lengre (685/70 nm, vist i rødt) utslipps kanaler. De to sistnevnte filterkombinasjoner er fordelaktig som de fanger Nile Red kjente spektrale endringer i forskjellige fysikalsk-kjemiske miljøer. (A) i referanse betingelser aksoner (YFP +, blå) og myelin (NR, gul-oransje) synes normalt orientert med noen kuler eller andre tegn på axomyelinic skade. Rader av gliaceller med karakteristisk morfologi av hvit substans oligodendrocytter (NR, mørk oransje, f.eks pilspisser) er også synlig (noen merket for klarhet), og fine strukturer som noder av Ranvier er også løst (f.eks piler). (B) Ved 10 min etter Lisci, transektert aksoner ligger rostralt og hale til lesjonen begynner å trekke vekk fra skadestedet og danne sigmoidale lignende spoler (piler) innenfor hovne myelin. Myelin ensheathing aksoner fjernt fra ablasjon vises uendret på dette tidspunktet. (C) By 40 min post-Lisci mest primære transektert axoner og aksoner gjennomgår sekundær degenerasjon danner karakteristiske endbulbs som de trekke fra lesjon området (pilspisser). Noen transektert aksoner også danne kuler langs lengden av deres aksoner (piler). Separasjon av myelin fra axon (peri-aksonale svelling) og vesikulært degenerering av myelin er også tydelig (+). (DG). Over tid, primære og sekundære skadde aksoner fortsetter å trekke tilbake vekk fra lesjonen området, og som vist ved yz spring av Lisci, i første omgang spart axoner flankerer ablasjon nettstedet gjennomgå forsinket sekundær degenerasjon (H, venstre panel før Lisci, midtpanelet 10 minutter etter Lisci, og høyre panel 7 hr etter Lisci, hvite prikkene markerer den første Lisci, røde prikker angir tap av axoner etter 10 min og grønne prikker angir utstrekningen av forsinket sekundær degenerasjon av axoner etter 7 timer). Peri-aksonal hevelse blir mer fremtredende på senere tidspunkter post-Lisci. Omfanget of aksonal tilbaketrekking og morfologi aksonale endbulbs mellom proksimale axon stubber og deres distale segmenter blir også tydelig (se også figur 5 for høyere forstørrelse bilder). Målestokk:. 50 mikrometer Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet. 
Figur 5:. Representative høyoppløselige bilder av axomyelinic endringer etter Lisci TPLSM ble brukt til å fange opp intrikate detaljer av axon og myelin endrer hale (A, C) og rostralt (B, D) til skade på tre timer (A, B) og 7 timer (C, D) etter Lisci. Representative bilder vises som maksimal intensitet projeksjoner av tre 1 mikrometer tykke optiske seksjonerfanget på 0,0832 mikrometer / pixel med en Nikon A1RMP + multiphoton / konfokal mikroskop. (A) Caudal til Lisci (*), flere aksoner (blå) er å trekke tilbake bort fra lesjon området (store pilspisser) innenfor hovne myelin rør (gul-orange ) som er adskilt fra den aksonal endbulb. Noen axoner i tilknytning til ablasjon nettstedet gjennomgå sekundær degenerasjon (små pilspisser), mens andre synes upåvirket. YFP lave / negative putative vesikler (blek blå) innenfor axon og aksonale endbulbs er tilstede (piler). En sentral node av Ranvier (n) er også godt synlig ved hjelp av denne bildebehandling og merking teknikk. (B) I motsetning til caudally trekke fiber, er de fleste av de rostrally Retracting aksonale endbulbs og kuler på 3 timer etter Lisci sterkt merket med Nile rød (rosa). Nile Red-merkede områdene i tilbaketrekkings aksoner ser ut til å hovedsakelig surround eller cap YFP merket axoner (blå, store pilspisser). Selv om innholdet i disse Nile Red-labeled strukturer er foreløpig ukjent, kan de representere tette vesikkel opphopning via aksonal transport og / eller spaltede proteiner utsette sine hydrofobe kjerne. I skillet, Nile Red merket vesicular myelin (piler) vises gul (dvs. spekteret er blå forskjøvet) sammenlignet med normal myelin (gul-oransje), en indikasjon på mulige miljømessige endringer innenfor det tidligere. Peri-aksonal hevelse er også tydelig (små pilspisser). På syv timer etter Lisci, aksoner fortsette trekke bort fra lesjon området; men dette er mer tydelig i rostralt (D) versus caudal (C) endbulbs. Noen aksoner gjennomgå hel eller delvis oppløsning forlater en tom myelin tube (pil i C) eller en tynn stilk flere mikrometer unna degenereres segmentet (små piler i D), henholdsvis. Forsinket anvendelse av Nile Red gir lignende spektrale endringer i hale versus rostral sentrale myelinerte axoner (E og F
| 2x Stock A (2 mm Ca 2+) | Reagens | mM |
| NaCl | 252 | |
| KCl | 6 | |
| CaCl 2 • 2 H 2 O | 4 | |
| 2x Stock B | NaH 2 PO 4 | 2,5 |
| MgSO4 | 4 | |
| NaHCO3 | 52 | |
| Druesukker (D-glukose) | 20 | |
| 2x lav Ca 2+ Stock C (0,1 mM Ca 2+) | NaCl | 252 |
| KCl | 6 | |
| MgCl • 6 H 2 O | 3.8 | |
| CaCl 2 • 2 H 2 O | 0.2 |
Tabell 1: Kunstig cerebrospinalvæsken (ACSF) buffere.
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Large bath chamber with slice supports | Warner Instruments | RC-27L | For ex vivo imaging chamber |
| Standard Slice Supports | Warner Instruments | SS-3 | For ex vivo imaging chamber |
| Plastic Slice hold-down for RC-27L and RC-29 chambers | Warner Instruments | SHD-27LP/10 | For ex vivo imaging chamber |
| Suction Tube, Series 20 Classic Design, left handed | Warner Instruments | ST-1L | For ex vivo imaging chamber |
| Solution In-line heater/cooler | Warner Instruments | SC-20 | To regulate perfusate temperature during imaging |
| Bipolar temperature controller | Warner Instruments | CL-100 | To regulate perfusate temperature during imaging |
| Liquid Cooling System | Warner Instruments | LCS-1 | To regulate perfusate temperature during imaging |
| Cable assembly for heater controllers | Warner Instruments | CC-28 | To regulate perfusate temperature during imaging |
| Replacement bead thermisitor for CC-28 cable | Warner Instruments | TS-70B | To regulate perfusate temperature during imaging |
| Magnetic holder with suction tubing | Bioscience Tools | MTH-S | To hold the stainless steel vacuum suction tubing |
| Adjustable holder | Bioscience Tools | MTH | To hold the temperature probe |
| clear silicone sealant | For ex vivo imaging chamber | ||
| superglue | For ex vivo imaging chamber | ||
| thin plexiglass strips | For ex vivo imaging chamber | ||
| nile red | Life Technologies | N-1142 | For labeling myelin |
References
- Chew, D. J., Fawcett, J. W., Andrews, M. R. The challenges of long-distance axon regeneration in the injured CNS. Prog Brain Res. 201, 253-294 (2012).
- Eva, R., Andrews, M. R., Franssen, E. H., Fawcett, J. W. Intrinsic mechanisms regulating axon regeneration: an integrin perspective. Int Rev Neurobiol. 106, 75-104 (2012).
- McCall, J., Weidner, N., Blesch, A. Neurotrophic factors in combinatorial approaches for spinal cord regeneration. Cell Tissue Res. 349, 27-37 (2012).
- Pernet, V., Schwab, M. E. The role of Nogo-A in axonal plasticity, regrowth and repair. Cell Tissue Res. 349, 97-104 (2012).
- Bradbury, E. J., et al. Chondroitinase ABC promotes functional recovery after spinal cord injury. Nature. 416, 636-640 (2002).
- Cregg, J. M., et al. Functional regeneration beyond the glial scar. Exp Neurol. 253, 197-207 (2014).
- Park, K. K., et al. Promoting axon regeneration in the adult CNS by modulation of the PTEN/mTOR pathway. Science. 322, 963-966 (2008).
- Coleman, M. P., Freeman, M. R. Wallerian degeneration, wld(s), and nmnat. Annu Rev Neurosci. 33, 245-267 (2010).
- Sulaiman, W., Gordon, T. Neurobiology of peripheral nerve injury, regeneration, and functional recovery: from bench top research to bedside application. Ochsner J. 13, 100-108 (2013).
- Bradke, F., Fawcett, J. W., Spira, M. E. Assembly of a new growth cone after axotomy: the precursor to axon regeneration. Nat Rev Neurosci. 13, 183-193 (2012).
- Erturk, A., Hellal, F., Enes, J., Bradke, F. Disorganized microtubules underlie the formation of retraction bulbs and the failure of axonal regeneration. J Neurosci. 27, 9169-9180 (2007).
- Seif, G. I., Nomura, H., Tator, C. H. Retrograde axonal degeneration 'dieback' in the corticospinal tract after transection injury of the rat spinal cord: a confocal microscopy study. J Neurotrauma. 24, 1513-1528 (2007).
- Fishman, P. S., Mattu, A. Fate of severed cortical projection axons. J Neurotrauma. 10, 457-470 (1993).
- McPhail, L. T., Stirling, D. P., Tetzlaff, W., Kwiecien, J. M., Ramer, M. S. The contribution of activated phagocytes and myelin degeneration to axonal retraction/dieback following spinal cord injury. Eur J Neurosci. 20, 1984-1994 (2004).
- Stirling, D. P., et al. Minocycline treatment reduces delayed oligodendrocyte death, attenuates axonal dieback, and improves functional outcome after spinal cord injury. J Neurosci. 24, 2182-2190 (2004).
- Kerschensteiner, M., Schwab, M. E., Lichtman, J. W., Misgeld, T. In vivo imaging of axonal degeneration and regeneration in the injured spinal cord. Nat Med. 11, 572-577 (2005).
- Kalb, J., Nielsen, T., Fricke, M., Egelhaaf, M., Kurtz, R. In vivo two-photon laser-scanning microscopy of Ca2+ dynamics in visual motion-sensitive neurons. Biochem Biophys Res Commun. 316, 341-347 (2004).
- Hirase, H., Qian, L., Bartho, P., Buzsaki, G. Calcium dynamics of cortical astrocytic networks in vivo. PLoS Biol. 2, 96 (2004).
- Fenrich, K. K., Weber, P., Rougon, G., Debarbieux, F. Long- and short-term intravital imaging reveals differential spatiotemporal recruitment and function of myelomonocytic cells after spinal cord injury. J Physiol. 591, 4895-4902 (2013).
- Canty, A. J., et al. In-vivo single neuron axotomy triggers axon regeneration to restore synaptic density in specific cortical circuits. Nat Commun. 4, 2038 (2013).
- Dibaj, P., et al. NO mediates microglial response to acute spinal cord injury under ATP control in vivo. Glia. 58, 1133-1144 (2010).
- Davalos, D., et al. Stable in vivo imaging of densely populated glia, axons and blood vessels in the mouse spinal cord using two-photon microscopy. J Neurosci Methods. 169, 1-7 (2008).
- Nimmerjahn, A. Two-photon imaging of microglia in the mouse cortex in vivo. Cold Spring Harb Protoc. 2012, (2012).
- Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. Resting microglial cells are highly dynamic surveillants of brain parenchyma in vivo. Science. 308, 1314-1318 (2005).
- Davalos, D., et al. Fibrinogen-induced perivascular microglial clustering is required for the development of axonal damage in neuroinflammation. Nat Commun. 3, 1227 (2012).
- Buttermore, E. D., Thaxton, C. L., Bhat, M. A. Organization and maintenance of molecular domains in myelinated axons. J Neurosci Res. 91, 603-622 (2013).
- Stirling, D. P., et al. Toll-like receptor 2-mediated alternative activation of microglia is protective after spinal cord injury. Brain. 137, 707-723 (2014).
- Greenspan, P., Fowler, S. D. Spectrofluorometric studies of the lipid probe, nile red. J Lipid Res. 26, 781-789 (1985).
- Greenspan, P., Mayer, E. P., Fowler, S. D. Nile red: a selective fluorescent stain for intracellular lipid droplets. J Cell Biol. 100, 965-973 (1985).
- Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Monitoring of vital signs for long-term survival of mice under anesthesia. Cold Spring Harb Protoc. 2011, (2011).
- Tajima, Y., et al. Cerebral hemodynamic response to acute hyperoxia in awake mice. Brain Res. 1557, 155-163 (2014).
- Andermann, M. L., et al. Chronic cellular imaging of entire cortical columns in awake mice using microprisms. Neuron. 80, 900-913 (2013).
- Nimmerjahn, A., Mukamel, E. A., Schnitzer, M. J. Motor behavior activates Bergmann glial networks. Neuron. 62, 400-412 (2009).
- Tsutsui, S., Stys, P. K. Metabolic injury to axons and myelin. Exp Neurol. 246, 26-34 (2013).
- Matute, C., Ransom, B. R. Roles of white matter in central nervous system pathophysiologies. ASN Neuro. 4, (2012).
- Matute, C. Calcium dyshomeostasis in white matter pathology. Cell Calcium. 47, 150-157 (2010).
- Stys, P. K., Lipton, S. A. White matter NMDA receptors: an unexpected new therapeutic target. Trends Pharmacol Sci. 28, 561-566 (2007).
- Baltan, S. Surviving anoxia: a tale of two white matter tracts. Crit Rev Neurobiol. 18, 95-103 (2006).
- Stirling, D. P., Stys, P. K. Mechanisms of axonal injury: internodal nanocomplexes and calcium deregulation. Trends Mol Med. 16, 160-170 (2010).
- Wang, H., Fu, Y., Zickmund, P., Shi, R., Cheng, J. X. Coherent anti-stokes Raman scattering imaging of axonal myelin in live spinal tissues. Biophys J. 89, 581-591 (2005).
- Beirowski, B., Nogradi, A., Babetto, E., Garcia-Alias, G., Coleman, M. P. Mechanisms of axonal spheroid formation in central nervous system Wallerian degeneration. J Neuropathol Exp Neurol. 69, 455-472 (2010).
- Shi, R., Asano, T., Vining, N. C., Blight, A. R. Control of membrane sealing in injured mammalian spinal cord axons. J Neurophysiol. 84, 1763-1769 (2000).
- Stirling, D. P., Cummins, K., Wayne Chen,, R, S., Stys, P. Axoplasmic reticulum Ca(2+) release causes secondary degeneration of spinal axons. Ann Neurol. 75, 220-229 (2014).
