Brain microvascular endothelial cells (BMEC) are interconnected by specific junctional proteins forming a highly regulated barrier separating blood and the central nervous system (CNS), the so-called blood-brain-barrier (BBB). The isolation of primary murine brain microvascular endothelial cells, as discussed in this protocol, enables detailed in vitro studies of the BBB.
The blood-brain-barrier is ultrastructurally assembled by a monolayer of brain microvascular endothelial cells (BMEC) interconnected by a junctional complex of tight and adherens junctions. Together with other cell-types such as astrocytes or pericytes, they form the neurovascular unit (NVU), which specifically regulates the interchange of fluids, molecules and cells between the peripheral blood and the CNS. Through this complex and dynamic system BMECs are involved in various processes maintaining the homeostasis of the CNS. A dysfunction of the BBB is observed as an essential step in the pathogenesis of many severe CNS diseases. However, specific and targeted therapies are very limited, as the underlying mechanisms are still far from being understood.
Animal and in vitro models have been extensively used to gain in-depth understanding of complex physiological and pathophysiological processes. By reduction and simplification it is possible to focus the investigation on the subject of interest and to exclude a variety of confounding factors. However, comparability and transferability are also reduced in model systems, which have to be taken into account for evaluation. The most common animal models are based on mice, among other reasons, mainly due to the constantly increasing possibilities of methodology. In vitro studies of isolated murine BMECs might enable an in-depth analysis of their properties and of the blood-brain-barrier under physiological and pathophysiological conditions. Further insights into the complex mechanisms at the BBB potentially provide the basis for new therapeutic strategies.
This protocol describes a method to isolate primary murine microvascular endothelial cells by a sequence of physical and chemical purification steps. Special considerations for purity and cultivation of MBMECs as well as quality control, potential applications and limitations are discussed.
Brain mikrovaskulære endotelceller (BMEC) danner monolag, der er en integrerende del af den højt specialiserede blod-hjerne-barrieren (BBB). BMECs er indbyrdes forbundet ved forbindelsesepitoper proteiner bundet til en basalmembran. Sammen med pericytter, glatte muskelceller, astrocytiske ende fødder og cirkulerende blodceller de opbygger den såkaldte neurovascular enhed (NVU) 1. Mod tidligere forestilling om en uigennemtrængelig barriere mellem blod og centralnervesystemet-systemet (CNS), at NVU er en dynamisk, meget specifikke og regulerede grænseflade, der styrer overgangen af væske, molekyler og celler mellem cerebrale blodkar og CNS 2 . En dysfunktion eller dysregulering af NVU kan initiere og / eller bidrage til en række neurovaskulære, infektiøse, inflammatoriske eller degenerative CNS-sygdomme, såsom iskæmisk slagtilfælde, HIV-encefalopati, dissemineret sklerose, Alzheimers eller Parkinsons sygdom 3-6.
_content "> The BMEC monolayer er tæt forseglet med en junctional kompleks bestående af stram (TJ) og adherensovergange (AJ) 7. Den høje elektriske modstand og den lave paracellulære permeabilitet af BBB er hovedsageligt baseret på TJ proteiner 8. TJs er komplekser dannet af de transmembrane proteiner af claudin og occludin familie, som er knyttet til cytoskelettet af endothelcellerne af adaptormolekyler, såsom zonulaoccludens (ZO) proteiner ZO1-3 4. adherensovergange primært samlet af integreret membranprotein vaskulær endotel (VE) -cadherin, som er knyttet til cytoskelettet via catenins 8.Den tætte forsegling af BBB forhindrer fri udveksling af substrater og celler mellem blod og CSF. Undtagelser fra denne regel er lipofile, små molekyler med en molekylvægt <400 Da, som er i stand til at krydse BBB ved lipidmedieret diffusion 9. Passagen af større og / ellerhydrofile molekyler, såsom glucose, aminosyrer, peptider, proteiner og mange stoffer er begrænset til stærkt kontrollerede transcellulær transportsystemer 10, der kan klassificeres i fem hovedkategorier: carrier-medieret transport, ion transport, aktiv udstrømning transport, receptor-medieret transport og caveolae-medieret transport 4. Disse transportør systemer hjælper opretholde homeostase i CNS, som er nødvendig for en nøjagtig generation signal transduktion og integration. Desuden BMECs er i stand til aktivt at styre overgangen særskilte molekyler af ekspressionen af en række ectoenzymes. Disse enzymer er lokaliseret på celleoverfladen og ændre specifikke endogene og exogene substrater hindre eller tillade overgang BBB 11.
Hvorimod CNS blev betragtet som en immun-privilegeret organ for en lang tid, de seneste resultater tyder på en temmelig dynamisk og stramt reguleret system af immun Oveillance af CNS. De BMECs er kritisk involveret i reguleringen af immun celle sjælevandring. Ved ekspression af selectiner på deres overflade lymfocytter selektivt induceres til løst fastgøre til endotel. Sekretionen af chemokiner, der støder med specifikke receptorer på leukocytter fører til ekspression eller konforme ændringer i leukocyt-integriner, såsom LFA-1 (lymfocytfunktion-associeret antigen-1) og VLA-4 (meget sent antigen-4). Integrinerne medierer en fast adhæsion ved at binde deres endotelceller counterreceptors, fx VCAM-I (vaskulær celleadhæsionsmolekyle), ICAM-I (intercellulært adhæsionsmolekyle) muliggør transmigration i hjerneparenkymet mellem eller gennem BMECs af BBB 12-14. Disse og andre resultater bekræfter, at aktiv rolle endotel selv i reguleringen immuncellemigrering.
Desuden BMECs som en del af NVU er involveret i reguleringen af den cerebrale blodgennemstrømning linked lokale neuronale metaboliske krav. Ved astrocytisk stimulation endotelceller producerer vasoaktive stoffer, såsom nitrogenoxid, der fører til afslapning af vaskulære glatte muskelceller 15.
Angiogenese og neurogenesis i udviklingslandene såvel som i den voksne hjerne show parallel mønster og udvikling og deler mange egenskaber i regel 1, 4. Endotelceller kritisk involveret i disse processer 16, 17.
Sammenfattende BMECs indeholde vigtige funktioner til at berettige en ordentlig udvikling og funktion af CNS. BBB dysfunktion er forbundet med mange alvorlige neurologiske lidelser. Imidlertid har kun meget få mål blevet identificeret på hjernen-kar-interface til en specifik og effektiv behandling 18. Forenklet in vitro modeller er blevet brugt til at forstå de mekanismer, der er involveret i funktion og regulering af komplekse fysiologiske systemer til en long tid. Den som beskrevet af dette manuskript og in vitro-undersøgelse af murine BMECs, i betragtning af den brede vifte af specifik muse knockout-stammerne isolation, kunne give en yderligere forståelse af BBB funktion og regulering under fysiologiske og patofysiologiske tilstande åbner op for nye terapeutiske muligheder.
Blod-hjerne-barrieren dysfunktion er kendetegnende for forskellige skadelige CNS-sygdomme, fx en opdeling af BBB i multipel sklerose i udstrakt grad letter CNS invasion af autoreaktive immunceller og muliggør mødet og destruktion af oligodendrocytter. Iskæmisk slagtilfælde afbrydelse af BBB og den efterfølgende dannelse af hjerneødem er kritiske faktorer, der påvirker sekundær infarkt vækst og den samlede overlevelse af patienterne 6. Endvidere ved ændringer af BBB i fjerntliggende områder fokale iskæmiske læsioner er i stand til at fremkalde omfattende funktionelle ændringer i hjernen. Men de underliggende molekylære mekanismer er stort set ukendte 5. I modsætning hertil høj tæthed og mangfoldighed af effluxtransportører i funktionelle BMECs nedsætter koncentrationen af gavnlige stoffer som kemoterapeutika for hjerne maligniteter eller antibiotika til infektionssygdomme. Derfor en dybere forståelse af blod-hjerne-barRier funktion under fysiologiske og patofysiologiske tilstande er nødvendig for at udvikle farmakologiske midler, der er i stand til specifikt at regulere barriere funktion i den foretrukne retning 21. Pålidelig in vitro modeller af BBB er uundværlige værktøjer til at studere reguleringsmekanismer på BBB.
Mange udødeliggjort hjerne endotel cellelinjer er blevet etableret og ansat som in vitro BBB-modeller 22. Disse cellelinier giver visse fordele i forhold til de primære BMECs som de vokser hurtigere og holde visse BBB egenskaber over flere passager. Dog kan endoteliale cellelinjer ikke fuldt ud erstatte primære celler som vigtige egenskaber er ændret, der blander sig med overførsel af eksperimentelle resultater til den in vivo situation. For eksempel murine hjerne endotelcellelinje bEnd.5 kun udtrykker lave niveauer af diskontinuerligt fordelt tight junction proteiner fører til høj Paracellular permeabilitet 23. BEnd.3, en anden hyppigt anvendt murine hjerne endotelcellelinje, viser tætte og kontinuerlige distribuerede tight junctions, en høj transendotheliale modstand, flere effluxtransportører og lav paracellulær permeabilitet. Men bEND.3 cellelag i forhold til primære BMECs mangler en reel diskrimination med hensyn til gennemtrængning af visse transcellulær og paracellulære substrater 24.
I præparater af primære cellekulturer, kan kontaminerende celler væsentligt forstyrre gyldigheden af eksperimentelle resultater. I den beskrevne protokol, er pyrumicin anvendes som et selektivt middel til endothelceller for at opnå høj renhed. Ikke desto mindre er uundgåeligt behov for en regelmæssig kvalitetskontrol af cellekulturen for at sikre pålidelige forsøg. Der er flere metoder til kvalitetskontrol, foruden typiske morfologiske egenskaber af endotelceller (se figur 1A), den transendotheliakan måles l resistens eller ekspressionen af endotelcelle markør, såsom CD31 (se figur 1B) eller von Willebrand faktor (vWF) kan evalueres.
Antallet af hjernens endotelceller isoleret fra musehjerne er forholdsvis lav, og at etablere en ordentlig cellekultur for flere forsøg, hjernerne fra flere mus skal samles. Det er vores erfaring, mindst 10 mus skal benyttes til et eksperiment, som kan være en begrænsende faktor afhængigt af ressourcer respektive dyr facilitet. For at undgå afvigelser og confoundere, bør kun mus med et identisk genetisk og miljømæssig baggrund samles. I modsætning hertil kvæg og svin hjerne endotelcelle præparater levere et stort antal af hjernens endotelceller tilgængelige i en hjerne. Men ud over den ukomplicerede avl og boliger, den brede og stadigt voksende repertoire af tilgængelige transgene mus gør primære murine BMECs som et idealmodel til at studere blod-hjerne-barriere-funktion.
Flere vigtige konklusioner vedrørende funktioner BBB og de underliggende molekylære mekanismer er kommet fra undersøgelser i 2D vævskultursystemer. For nylig har 3D dyrkningssystemer blevet udviklet 25, hvor endotelceller er placeret i en collagenmatrix muligt for dem at danne hulrum og rørformede net. Disse nye celledyrkningssystemer giver mulighed for en endnu mere nøjagtig gengivelse af vaskulære processer i den intakte organisme in vivo. Inddragelsen af yderligere celler af NVU i 3D cellekultur systemer, såsom pericytter og astrocytter kan revolutionere in vitro undersøgelse af blod-hjerne-barriere-funktion; første modeller er for nylig blevet udviklet 26.
Der er nogle anbefalinger til fejlfinding. Først og fremmest sterile bearbejdning er afgørende for kvaliteten af endothelial cellekultur. For det andet bør pyrumycin kun tilsættes for celledyrkningsmedium anvendt i de første 2 dage af kultur, kan længere anvendelse føre til øget MBMEC celledød og lav kvalitet barriere funktion. For det tredje bør de enzymer, der anvendes i denne protokol skal anvendes og opbevares i henhold til producentens anvisninger; ellers deres rette funktion kan blive kompromitteret. Desuden kan belægningen af cellekulturplader ændres, hvis endotelceller ikke vedhæfte. Koncentrationer af fibronectin og collagen kan ændres eller andre matrixproteiner kan tilføjes til coatingopløsningen. Endelig, alder, køn, sæson betingelser året og miljømæssige inden dyreanlægget er vigtige faktorer, der kan påvirke kvaliteten af MBMEC isolation og sammenligneligheden af eksperimenter. Det bør sikres, at vilkårene er sammenlignelige mellem uafhængige forsøg.
Den beskrevne protokol bør betragtes som en grundlæggende neuroimmunologiske fremgangsmåde til isolering af murine BMECs. De isolerede celler kan være used for en bred vifte af applikationer til at opnå yderligere indsigt i BBB funktion, såsom migration assays, gen- og proteinekspressionssystemer undersøgelser, elektrofysiologiske evalueringer eller permeabilitet eksperimenter. Som nævnt ovenfor, kan 3D-cellekultur systemer BMECs give nye muligheder for at studere de komplekse mekanismer, der er involveret i reguleringen af BBB i forbindelse med NVU. Derfor vil isolering af primære endotelceller forblive en uvurderlig teknik inden for BBB forskning i fremtiden.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af Interdisciplinært Center for Klinisk Forskning (IZKF) Münster (SEED 03/12, SB) af Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG), Celler i bevægelse Cluster of Excellence (EXC 1003 – CIM), University of Muenster (til SB og SGM) og af Else Kröner-Fresenius-Stiftung (2012_A88 til SB og SGM). Vi takker Heike Blum for de fremragende illustrationer.
bFGF | Peprotech | 100-18B | Basic fibroblast growth factor |
BSA | Sigma Aldrich | A9418 | Bovine serum albumine |
Collagenase CLS2 | Worthington | LS004176 | High relative level of protease activity |
Collagenase-dispase | Roche | 10269638001 | Collagenase from V. alginolyticus, Dispase from B. polymyxa |
Collagen IV | Sigma Aldrich | C0543 | From Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane |
DMEM | Sigma Aldrich | D5030 | Warm in 37 °C water bath before use |
DNAse | Sigma Aldrich | D4513 | Deoxyribonuclease I from bovine pancreas |
FCS | Sigma Aldrich | F6178 | Fetal calf serum (also named fetal bovine serum) |
Heparin | Sigma Aldrich | H3393 | Anticoagulant |
PDS | First Link UK Ltd. | 60-00-850 | Plasma-derived serum |
Percoll | Sigma Aldrich | P1644 | Warm to room temperature before use |
Pyrumycin | Sigma Aldrich | P8833 | Should only be used in first 2 d of culture |