Brain microvascular endothelial cells (BMEC) are interconnected by specific junctional proteins forming a highly regulated barrier separating blood and the central nervous system (CNS), the so-called blood-brain-barrier (BBB). The isolation of primary murine brain microvascular endothelial cells, as discussed in this protocol, enables detailed in vitro studies of the BBB.
The blood-brain-barrier is ultrastructurally assembled by a monolayer of brain microvascular endothelial cells (BMEC) interconnected by a junctional complex of tight and adherens junctions. Together with other cell-types such as astrocytes or pericytes, they form the neurovascular unit (NVU), which specifically regulates the interchange of fluids, molecules and cells between the peripheral blood and the CNS. Through this complex and dynamic system BMECs are involved in various processes maintaining the homeostasis of the CNS. A dysfunction of the BBB is observed as an essential step in the pathogenesis of many severe CNS diseases. However, specific and targeted therapies are very limited, as the underlying mechanisms are still far from being understood.
Animal and in vitro models have been extensively used to gain in-depth understanding of complex physiological and pathophysiological processes. By reduction and simplification it is possible to focus the investigation on the subject of interest and to exclude a variety of confounding factors. However, comparability and transferability are also reduced in model systems, which have to be taken into account for evaluation. The most common animal models are based on mice, among other reasons, mainly due to the constantly increasing possibilities of methodology. In vitro studies of isolated murine BMECs might enable an in-depth analysis of their properties and of the blood-brain-barrier under physiological and pathophysiological conditions. Further insights into the complex mechanisms at the BBB potentially provide the basis for new therapeutic strategies.
This protocol describes a method to isolate primary murine microvascular endothelial cells by a sequence of physical and chemical purification steps. Special considerations for purity and cultivation of MBMECs as well as quality control, potential applications and limitations are discussed.
Brain mikrovaskulära endotelceller (BMEC) bildar monoskikt som är en integrerad del av den högspecialiserade blod-hjärnbarriären (BBB). BMECs är inbördes förbundna genom junctionala proteiner bundna till en basalmembranet. Tillsammans med pericyter, glatta muskelceller, astrocytiska end fötter och cirkulerande blodceller de bygga upp den så kallade neurovaskulära enhet (NVU) 1. Mot den tidigare föreställningen om en ogenomtränglig barriär mellan blodet och centrala-nervsystemet-system (CNS), är NVU en dynamisk, mycket specifika och reglerade gränssnitt som styr övergången av vätskor, molekyler och celler mellan hjärnans blodkärl och CNS 2 . En dysfunktion eller dysreglering av NVU kan initiera och / eller bidra till en mängd olika neurovaskulära, infektiösa, inflammatoriska eller degenerativa sjukdomar i CNS, såsom ischemisk stroke, HIV-encefalopati, multipel skleros, Alzheimers eller Parkinsons sjukdom 3-6.
_content "> The BMEC monoskiktet är tätt försluten med en skarv komplex bestående av tät (TJ) och adherens korsningar (AJ) 7. Den höga elektriska resistansen och den låga paracellulär permeabilitet BBB huvudsakligen baserade på TJ-proteiner 8. De TJs är komplex som bildas av de transmembranproteiner av claudin och occludin familj, som är kopplade till cytoskelettet av endotelcellerna genom adaptermolekyler, såsom de zonulaoccludens (ZO) proteiner ZO1-3 4. Adherens korsningar är huvudsakligen sammansatt av den integralt membranprotein vascular endothelial (VE) -cadherin, som är kopplat till cytoskelettet via catenins 8.Den förslutning av BBB hindrar det fria utbytet av substrat och celler mellan blod och CSF. Undantag från denna regel är lipofila, små molekyler med en molekylvikt <400 Da, som kan passera BBB från lipid-medierad diffusion 9. Passagen av större och / ellerhydrofila molekyler, såsom glukos, aminosyror, peptider, proteiner och många läkemedel är begränsad till mycket styrda transcellulära transportsystem 10, som kan delas in i fem huvudkategorier: carrier-medierad transport, jon transport, aktiv utflödes transport, receptormedierad transport, och caveolae-medierad transport 4. Dessa transportörsystem hjälper upprätthålla homeostas i CNS, vilket krävs för en korrekt signalgenerering, transduktion och integration. Dessutom BMECs möjlighet att aktivt styra övergången av distinkta molekyler av uttrycket av en mängd olika ectoenzymes. Dessa enzymer är lokaliserade på cellytan och ändra specifika endogena och exogena substrat hindrar eller möjliggör övergången av BBB 11.
Medan CNS ansågs som en immun privilegierade organ under en lång tid, nya rön tyder på en ganska dynamisk och hårt reglerat system för immun Öveeillance av CNS. De BMECs är kritiskt involverade i regleringen av immunceller transmigration. Genom uttryck av selektiner på sin yta lymfocyterna selektivt induceras att löst fästa till endotelet. Utsöndringen av kemokiner som stöter med specifika receptorer på leukocyter leder till expressionen eller konformationsförändringar av leukocyt-integriner, såsom LFA-1 (lymfocyt-funktionsassocierat antigen-1) och VLA-4 (mycket sen antigen-4). Integrinerna medierar en fast vidhäftning genom att binda deras endoteliala counterreceptors, t.ex. VCAM-I (vaskulär celladhesionsmolekyl), ICAM-I (intercellulär adhesionsmolekyl) som möjliggör transmigration in i hjärnparenkymet mellan eller genom BMECs av BBB 12-14. Dessa och andra fynd betonar aktiv roll i endotelet sig i att reglera immuncellmigration.
Dessutom BMECs som en del av NVU är involverade i regleringen av det cerebrala blodflödet linked till lokala neuronala metaboliska krav. Vid astrocytisk stimulering endotelceller producerar vasoaktiva substanser såsom kväveoxid leder till avslappning av vaskulära glatta muskelceller 15.
Angiogenes och neurogenes i utvecklings liksom i den vuxna hjärnan visar parallell mönstring och utveckling och delar många egenskaper i regel 1, 4. Endotelceller är kritiskt involverade i dessa processer 16, 17.
Sammanfattningsvis BMECs ger viktiga funktioner för att motivera en ordentlig utveckling och funktion av CNS. BBB dysfunktion är kopplad till många allvarliga neurologiska sjukdomar. Dock har bara mycket få mål identifierats på hjärnan-kärl gränssnitt för en specifik och effektiv behandling 18. Förenklat in vitro-modeller har använts för att förstå de mekanismer som är involverade i funktion och reglering av komplexa fysiologiska system för en long tid. Isoleringen som beskrivs av detta manuskript och studiet av murina BMECs in vitro, med tanke på de många olika specifika mus knockout-stammar, kan ge en ytterligare förståelse av BBB-funktion och reglering under fysiologiska och patofysiologiska förhållanden öppnar upp nya terapeutiska möjligheter.
Blod-hjärn-barriären dysfunktion är ett kännetecken för olika skadliga CNS-sjukdomar, till exempel en uppdelning av BBB, multipel skleros utsträckning underlättar CNS invasion av autoreaktiva immunceller och möjliggör mötet och förstörelse av oligodendrocyter. I ischemisk stroke störningar i BBB och den efterföljande bildningen av hjärnödem är kritiska faktorer som påverkar sekundär infarkt tillväxt och den totala överlevnaden hos patienter 6. Genom förändringar av BBB i avlägsna områden fokala ischemiska lesioner kan inducera omfattande funktionella förändringar i hjärnan. Men de bakomliggande molekylära mekanismerna är till stor del okända 5. Däremot hög täthet och mångfald uttransportörer funktionella BMECs minskar koncentrationen av välgörande läkemedel såsom kemoterapeutika för hjärntumörer eller antibiotika för infektionssjukdomar. Därför kan en djupare förståelse av blod-hjärn-barRier funktion under fysiologiska och patofysiologiska tillstånd krävs för att utveckla farmakologiska medel som har förmåga att specifikt reglera barriärfunktionen i den gynnade riktningen 21. Pålitlig in vitro modeller av BBB är oumbärliga verktyg för att studera de regleringsmekanismer på BBB.
Många odödliggjorda hjärnan endothelial cellinjer har etablerats och används som in vitro BBB: modeller 22. Dessa cellinjer ger vissa fördelar jämfört med primära BMECs när de växer snabbare och hålla vissa BBB: egenskaper under flera passager. Däremot kan endotelceller cellinjer inte helt ersätta primära celler som viktiga egenskaper byts som blandas med överförbarhet av experimentella resultat till in vivo-situationen. Till exempel, den murina hjärn endotelcellinje bEnd.5 uttrycker endast låga halter av diskontinuerligt fördelade tight junction proteiner som leder till hög paracellular permeabilitet 23. BEnd.3, en annan ofta använd murina hjärn endotelcellinje visar täta och kontinuerliga distribuerade tight junctions, hög transendoteliala motstånd, flera uttransportörer och låg paracellulär permeabilitet. Men bEND.3 cellager jämfört med primära BMECs saknar en verklig diskriminering med avseende på genomträngning av vissa transcellulär och paracellulära substrat 24.
I beredningar av primära cellkulturer, kan kontaminerande celler signifikant interferera med giltigheten av experimentella upptäckter. I den beskrivna protokollet, pyrumicin användas som ett selektivt medel för endotelceller för att uppnå hög renhet. Icke desto mindre är oundvikligen behövs en regelbunden kvalitetskontroll av cellkulturen för att garantera tillförlitliga experiment. Det finns flera metoder för kvalitetskontroll, förutom typiska morfologiska egenskaper hos endotelceller (se Figur 1A), den transendothelial motstånd kan mätas eller expressionen av endotelial cellmarkör, såsom CD31 (se figur 1B) eller von Willebrand-faktor (vWF) kan utvärderas.
Antalet hjärn endotelceller isolerade från en mus hjärna är relativt låg och att inrätta en lämplig cellkultur för flera experiment, hjärnan hos flera möss måste slås samman. Enligt vår erfarenhet, minst 10 möss måste användas för ett experiment som kan vara en begränsande faktor som beror på de resurser som respektive djuranläggning. För att undvika systematiska fel och störfaktorer bör endast möss med en identisk genetiska och miljömässiga bakgrunden slås samman. Däremot nötkreatur och svin preparat hjärna endotelial cell ge ett stort antal av hjärn endotelceller som finns i en hjärna. Men förutom den okomplicerade avel och bostäder, det breda och ständigt växande repertoar av tillgängliga transgena möss gör primära murina BMECs som ett idealmodell för att studera blod-hjärn-barriärfunktion.
Flera viktiga rön om funktionerna i BBB och de underliggande molekylära mekanismer har kommit från studier i 2D vävnadskultursystem. Nyligen har 3D odlingssystem utvecklats 25, där endotelceller är placerade i en kollagenmatris så att de kan bilda lumen och rörformade nätverk. Dessa nya cellodlingssystem möjliggör en ännu mer exakt återgivning av vaskulära processer i den intakta organismen in vivo. Medverkan av ytterligare celler av NVU i 3D cellodlingssystem, såsom pericyter och astrocyter kan revolutionera in vitro studier av blod-hjärn-barriären funktion; första modellerna har nyligen utvecklats 26.
Det finns några rekommendationer för felsökning. Först av allt steril arbetsmiljö är mycket viktigt för kvaliteten på den endoteliala cellkultur. För det andra bör pyrumycin endast till för cellodlingsmedium som användes i de första två dagarna av kultur, kanske längre tillämpning leda till ökad MBMEC celldöd och låg kvalitet barriärfunktion. För det tredje bör de enzymer som används i detta protokoll användas och förvaras enligt tillverkarens anvisningar; annars deras rätta funktion kan äventyras. Dessutom kan beläggningen av cellodlingsplattor ändras om endotelceller inte fäster. Koncentrationer av fibronektin och kollagen kan ändras eller andra matrixproteiner kan tillsättas till beläggningslösningen. Slutligen, ålder, kön, årstid och miljöförhållanden inom djurhuset är viktiga faktorer som kan påverka kvaliteten på MBMEC isolering och jämförbarhet av experiment. Man bör se till att förhållandena är jämförbara mellan oberoende experiment.
Den beskrivna protokollet bör betraktas som en grundläggande neuroimmunological metod för att isolera murina BMECs. De isolerade cellerna kan vara used för en mängd olika tillämpningar för att få ytterligare inblick i BBB funktion, såsom migrationsanalyser, gen och proteinexpressionsstudier, elektrofysiologiska utvärderingar eller permeabilitet experiment. Som nämnts ovan, kan 3D cellodlingssystem BMECs ge nya möjligheter att studera de komplexa mekanismer som är involverade i regleringen av BBB i samband med NVU. Därför kommer isolering av primära endotelceller förbli en ovärderlig teknik inom området för BBB-forskning i framtiden.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av tvärvetenskapligt center för klinisk forskning (IZKF) Münster (SEED 12/3, SB), av Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG), Cells-in-Motion Cluster of Excellence (EXC 1003 – CIM), University of Münster (till SB och SGM) och av Else Kröner-Fresenius-Stiftung (2012_A88 till SB och SGM). Vi tackar Heike Blum för de utmärkta illustrationer.
bFGF | Peprotech | 100-18B | Basic fibroblast growth factor |
BSA | Sigma Aldrich | A9418 | Bovine serum albumine |
Collagenase CLS2 | Worthington | LS004176 | High relative level of protease activity |
Collagenase-dispase | Roche | 10269638001 | Collagenase from V. alginolyticus, Dispase from B. polymyxa |
Collagen IV | Sigma Aldrich | C0543 | From Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane |
DMEM | Sigma Aldrich | D5030 | Warm in 37 °C water bath before use |
DNAse | Sigma Aldrich | D4513 | Deoxyribonuclease I from bovine pancreas |
FCS | Sigma Aldrich | F6178 | Fetal calf serum (also named fetal bovine serum) |
Heparin | Sigma Aldrich | H3393 | Anticoagulant |
PDS | First Link UK Ltd. | 60-00-850 | Plasma-derived serum |
Percoll | Sigma Aldrich | P1644 | Warm to room temperature before use |
Pyrumycin | Sigma Aldrich | P8833 | Should only be used in first 2 d of culture |