Introduction
Eine unvermeidliche Folge des Älterwerdens ist die abnehmende Fähigkeit der Gewebe und Organe funktionsfähig bleibt. Adulte Stammzellen sind für die Aufrechterhaltung Gewebshomöostase und Organfunktionen, aber wie Organismen Alter, die Stammzellen als auch einen Rückgang der biologischen Verhalten. Dies ist besonders schädlich für Gewebe, die eine hohe Umsatzrate aufweisen, wie das Darmepithel. Kennzeichen der im Alter von Stammzellen gehören genomische Beschädigung, verminderte Reparaturmechanismen, gestörte Regulation des Zellzyklus und fehlregulierte Signalwege, die alle auf den normalen Stammzellen Verhalten (in 1-3 überprüft). Durch die Manipulation spezifische Signalwege oder umzuwerfen bestimmter Gene haben wir Einblick in ihre Rollen bei der Regulierung und Aufrechterhaltung der normalen Stammzellverhalten gewonnen. Da die meisten dieser Experimente sind Kandidatenmolekül Ansätze, wir haben sehr wenig Wissen über die körpereigenen molekularen Veränderungen, die während der in Stammzellen auftretenAltern. Ein Weg, um diese Frage zu nähern, ist es, das Transkriptom von jungen Vergleichen gegenüber alten Stammzellen Moleküle, deren Expressionsprofil ändert sich deutlich während der Alterung zu identifizieren. Leider haben die biologischen und technischen Herausforderungen unserer Fortschritte bei diesem Ansatz bisher behindert.
Drosophila melanogaster ist ein gut geeigneter Modellorganismus, um Alterung zu untersuchen, da sie eine kurze Lebensdauer (ca. 60-70 Tage) und Exponate Alterungs Phänotypen (in 4 überprüft). Darüber hinaus kann der Alterungsprozess in Drosophila durch Temperatur beschleunigt werden. Bei der Haltung die Fliegen bei 29 ° C kann ein Alter von Phänotyp im Darmgewebe bereits nach 15 Tagen 5 beachten. Weiterhin ist Drosophila zugänglich für eine Vielzahl von genetischen Manipulationen. Insbesondere hat die Drosophila midgut als ausgezeichnetes Modellsystem entstanden, um den Einfluss der verschiedenen Signalwege und Umweltprobleme zu studierendie Biologie der Darmstammzellen (ISCs) während des Alterns (in 6-10 prüft). Die Drosophila Darmepithel eine hohe Fluktuationsrate und wird alle zwei Wochen bei Frauen im Monat bei Männern 11 erneuert und etwa einmal. ISCs mit Wohnsitz in der Drosophila Mitteldarm haben die Fähigkeit sich zu teilen und produzieren eine Selbst erneuert ISC und eine post-mitotischen Vorläuferzellen genannt enteroblast (EB) 12,13. Die EB unterscheidet entweder in einem saugfähigen Enterozyten oder einen sekretorischen enteroendokrinen Zelle. Zu diesem Zeitpunkt ist die einzige Markerkombination, die eindeutig markiert einen ISC ist die Expression des Transkriptionsfaktors escargot (ESG) und der Notch-Liganden Delta (DL) 14. Dies ist jedoch nur gilt für einen jungen und gesunden Darm. Während der Alterung wird der Mitteldarm-Epithel durch eine Erhöhung der Proliferations ISC 15-17 gekennzeichnet. Zusätzlich stört aberrante Notch-Signal das Schicksal Entscheidung des ISC Tochterzellenund induziert Fehldifferenzierung des EVG 15. Dies führt zu einer Ansammlung von Zellen, die für Notch-Signalweg und Co-express esg und DI aktiv sind, so DI Ausdruck nicht aus, um bona fide Stammzellen zu identifizieren in einer alten Mitteldarm-Rendering. Die Schwierigkeit bei der Identifizierung von echten ISCs hat die Fähigkeit, die endogene Veränderungen Alterungs ISCs bisher untersuchen behindert.
Wir haben dieses Problem durch die Nutzung des esg -Gal4, UAS-GFP transgenen Fliege Linie, in der die Höhe der GFP-Expression in ISCs und EVG ist von Natur aus anders und bleibt während Alterung verschiedenen gangen. Ein ähnlicher Ansatz wurde für die Isolierung von Larvenneuroblasten und Neuronen 18,19 beschrieben. Mitteldärmen von Jung und Alt esg -Gal4, UAS-GFP Fliegen wurden seziert und in Einzelzellen dissoziiert. Die Zellen wurden dann für GFP-positiven Zellen unter Verwendung von Fluoreszenz-aktivierter Zellsortierung (FACS) sortiert. Interessanterweise ist die sortierten GFP-positive cEllen in zwei deutliche Spitzen basierend auf GFP-Fluoreszenzintensität verteilt (GFP hohen und niedrigen GFP). Außerdem ist die Verteilung der GFP-positiven Zellen in den beiden Peaks auch bei Zellgröße korreliert: Die Zellen, die niedrige GFP Intensität zeigten waren klein und weniger körnig während Zellen mit hoher GFP Intensität waren größer und granular. Diese Beobachtung legte nahe, dass die kleineren ISCs konnte von den größeren EVG mittels FACS auf Basis von GFP-Intensität und die Auswahl geeigneter Vorwärtsstreuung (FSC) und Seitwärtsstreuung (SSC) Einstellungen unterscheiden. Interessanterweise blieben die beiden Peaks deutlich beim Altern getrennt. Außerdem ist das Verhältnis der zwei Peaks verändert in einer Weise, die die oben genannten Merkmale der Alterung midguts reflektiert, nämlich daß die Anzahl von großen, misdifferentiated EBs Zeit zunimmt. Aus diesen Ergebnissen schließen wir, dass durch die Sortierung für GFP-positiven Zellen unter Verwendung der geeigneten FACS Parametereinstellungen, die wir für ISCs und EBs zu jedem Zeitpunkt d bereichernährend Alterung.
Zusammenfassend stellen wir eine FACS-Strategie, die Forschern die für zwei unterschiedliche Zellpopulationen, ISCs und EVG zu bereichern, von Drosophila Mitteldärmen jeden Alters und, diese Zellen für die weitere Analyse, wie Next Generation Sequencing. Diese leistungsstarke Methode ermöglicht die Untersuchung der endogenen molekularen Mechanismen, die untrennbar mit Alterung in einer angereicherten Population von Stamm- oder Vorläuferzellen sind. Die aus diesen Untersuchungen erhaltenen Daten werden zweifellos erleichtern die Identifizierung der konservierten Moleküle, die in alternden allen Spezies signifikant sind.
Protocol
HINWEIS: Ist dieses Protokoll zum ersten Mal zu ISCs von FAC Sortierung zu isolieren, sind obligatorisch, um die FACS-Parameter zunächst eingestellt richtig die folgenden Steuerelemente: Dissoziierte Zellen von Wildtyp (zB w 1118) Drosophila Mitteldärmen ohne Sytox. Dissoziierten Zellen vom Wildtyp (zB w 1118) Drosophila Mitteldärmen mit Sytox (siehe Schritt 3.6). Dissoziierten Zellen aus Mitteldärmen des esg -Gal4, UAS-GFP Fliegenschnur ohne Sytox.
1. Herstellung von Lösungen und Geschirr für Gut Dissection
- Bereiten Sie 4-6 Fläschchen mit je 40 weiblichen Linie vom esg -Gal4, UAS-GFP Fliegenschnur.
- Von einem 10-fach PBS Stammlösung werden 500 ml 1x PBS (1,8 mM NaH 2 PO 4 · H 2 O, 8,4 mM Na 2 HPO 4 · 2 H 2 O, 175 mM NaCl, pH-Wert auf 7,4).
- Bereiten Sie eine 3,5% Igen Lösung in 1x PBS (3,5 g Elektrophorese Grade Agarose in 100 ml 1x PBS). Bereiten Dissektion Platten durch Eingießen dieser Lösung in Petrischalen (Durchmesser 8,5 cm), um den Boden zu bedecken. Die Agarose-Schicht verhindert eine Beschädigung der Spitzen der Zange während der Präparation Verfahren. Nachdem das Gel erstarrt ist die Dissektion Platten bei 4 ° C lagern.
- Bereiten Sie 300 ml 1x PBS + 1% BSA frischer vor Sezieren und die Flasche auf Eis oder bei 4 ° C.
- Schalten Sie Zentrifuge und lassen Sie ihn abkühlen auf 4 ° C.
- Flamme die Spitzen 2 Glas Pasteurpipetten, um die Kanten zu glätten.
- Sauber zwei Zangenpaaren und eine Rasierklinge mit 70% Ethanol.
- Platzieren Sie vier vor sechs 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen zum Sammeln seziert Mitteldärmen auf Eis.
2. Vorbereitung des Magen-Darmtraktes und Dissektion der Dünndarm-
- Anesthetize Fliegen aus einem Fläschchen (40 Linie) mit CO 2 auf einem Standard-fly-Bett, alle enthauptenfliegt mit einer Rasierklinge und übergeben sie an die Dissektion Gericht. Gießen Sie kaltes 1x PBS / 1% BSA-Lösung in die Dissektion Gericht, um die Agarose-Gel zu bedecken. Die Fliegen schwimmt.
- Besorgen Sie sich die Fliege Bauch mit einer Pinzette, während der Brustkorb mit der anderen Pinzette halten. Trennen Sie den Brustkorb aus dem Bauch. Die gut sichtbar sein und die Vorderdarm / Ernte wird sehr wahrscheinlich noch auf den Thorax verbunden werden.
- Besorgen Sie sich die gut und ziehen Sie sie aus dem Brustkorb. Um den Darm entfalten, greifen die Ernte und ziehen Sie den Bauch ein wenig nach vorne weg von den Unterleib.
- Besorgen Sie sich die hintere Ende des Unterleibs mit einer Pinzette und den Rand der nach vorne offenen Nagelhaut mit der anderen Pinzette. Achten Sie darauf, den vorstehenden Darmgewebe zu zerstören. Ziehen Sie das hintere Ende weg, um die Nagelhaut zu brechen und weiter nach hinten ziehen sehr vorsichtig, bis der gesamte Darm ist aus der Bauchhöhle herausgezogen worden. Die Ernte kann muss vorher entfernt werden, wenn es zu groß, um fit istdurch die Körperhöhle.
- Entfernen Sie die Vorderdarm, Malpighischen, Enddarm und Eierstöcke Verlassen des kahlen Mitteldarm.
- Mit einem Glas Pasteur Pipette die Charge seziert Mitteldärmen in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen mit kaltem 1x PBS / 1% BSA-Lösung und halten Sie die Röhrchen auf Eis. Die Proben müssen innerhalb von 2 Stunden verarbeitet werden.
- Nach der Präparation einer ganzen Charge abgeschlossen ist, spülen Sie die Dissektion Gericht mit doppelt destilliertem Wasser auf über Schmutz abwaschen links. Starten Sie sezieren die nächste Gruppe von Mitteldärmen (wiederholen Sie die Schritte 2,1 bis 2,7). Sezieren soviel Partien wie möglich innerhalb von 2 Stunden, dann fahren Sie mit Schritt 3.1.
3. Die Verdauung der Gut Tissue Harvest Zellen für FAC Sortierung
- Entfernen Sie die 1x PBS / 1% BSA-Lösung von den Mitteldarm und fügen Sie 500 ul von 0,5% Trypsin-EDTA-Lösung zu jeder Probe.
- Vortex gut 20 Sekunden und die Proben unter durch sanfte Schaukeln / 25-30 min rotierenden bei 20 UpM bei Raumtemperatur.
- Vortex wieder nach ca. 30 min und lassen Sie das intakte Mitteldarm Gewebe sinken auf den Boden des Röhrchens. Entfernen Sie vorsichtig die Zellen, die in Suspension mit einem geflammten Pasteurpipette aus Glas sind und filtern sie durch eine 35 & mgr; m Nylon Netz in ein frisches 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen.
- Dreh die Zellen nach unten bei 100 × g für 5 min bei 4 ° C. Zu beachten ist, beim Starten des Verdaus, einem Zellpellet kann zunächst nicht sichtbar sein, sondern werden als Gewebe digest schreitet sichtbar.
- Die Trypsin-Lösung vorsichtig wieder übertragen zu der ursprünglichen Probenröhrchen, das die verbleibenden intakten Mitteldarmgewebe. Vermeiden der Übertragung zu viele Zellen aus dem Pellet.
- Vorsichtig resuspendieren das Zellpellet in 400 ul kaltem 1x PBS / 1% BSA. Halten Sie die Reaktionsgefäße mit den dissoziierten Zellen auf Eis und decken die Rohre mit Aluminiumfolie um die Zellen vor Licht zu schützen.
- Vortex die Trypsin-Lösung, die die verbleibenden intakten Mitteldarm Gewebe wieder und legen Sie die Probenauf die Wippe für weitere 30 Minuten bei Raumtemperatur.
- Wiederholen Sie die Schritte 3.3 bis 3.4.3, bis die gesamte Mitteldarmgewebe wurde verdaut. Kombinieren Sie die dissoziierten Zellen aus allen Reaktionsgefäße in einem Reaktionsgefäß. Dies kann einen Zentrifugationsschritt wie in 3.4, da das Volumen aller Zellsuspensionen dürfen zusammen 1,5 ml überschreiten müssen. Halten Sie die Zellsuspension auf Eis und die Zellen vor Licht schützen.
- Dreh die dissoziierten Zellen nach unten bei 100 xg für 5 Minuten bei 4 ° C. Sorgfältig soviel Überstand wie möglich, so dass ungefähr 50-100 ul des 1x PBS / 1% BSA-Lösung in Mikrozentrifugen-Röhrchen zu entfernen. Vorsichtig resuspendieren dissoziierten Zellen in 800 ul 1x PBS / 1% BSA enthält Sytox (1: 20.000).
- Übertragen der Zellsuspension in einen 5 ml Rundboden Falcon Röhrchen durch Filtern der Zellen durch ein Zellsieb Schnappkappe (35 um Nylon-Mesh). Halten Zellproben auf Eis und vor Licht geschützt. Die Zellen sind nun bereit,sortiert werden.
- Pipettieren Sie 600 ul von RNAlater Lösung in jedes Mikrozentrifugenröhrchen, in die die Zellen für die anschließende RNA-Isolierung sortiert werden. Für andere Downstream-Anwendungen können die Zellen in einer anderen Lösung gesammelt werden, beispielsweise in sterilem PBS.
4. FAC Sortierung auf die Stammzellen des Darms Isolieren
- Schalter auf der Durchflusszytometrie Instrument mindestens eine Stunde vor der Sortierung. Stellen Sie sicher, dass das Fluidsystem ist frei von Luftblasen.
- Wählen Sie die 70 um die Düsengröße, um die Zellen in die Hülse Fluidstrom injizieren.
- Stellen Sie die Amplitude der Kernfluidstrom, so daß der Spaltwert entspricht der Referenzwert (6-7, bei der Verwendung der 70 & mgr; m-Düse). Lassen Sie die Kernfluidstrom vor dem Start zu sortieren stabilisieren.
- Folgen Sie dieser Reihenfolge, wenn zunächst die Einstellung der Parameter für die Sortierung:
- Laden Sie die dissoziierten Zellen vom Wildtyp Mut erhalten. Zuerst stellen Sie die FSC und SSC Spannungenum die Zellen des Grundstückes in der Mitte der Punktwolke. Zweitens einstellen FITC (GFP) Spannung, so dass alle Zellen unter 10 2 auf der logarithmischen x-Achse aufgetragen. Wird der Parameter FITC setzt die Grenze für Autofluoreszenz.
- Laden Sie die dissoziierten Zellen von Wildtyp-Mut mit Sytox erhalten wird. Stellen Sie die Pacific Blue Spannungswert und Tor zu identifizieren und zu getrennt lebenden Zellen von toten, Sytox-positiven Zellen in der Pacific Blue vs. FSC-A Streudiagramm.
- Laden Sie die dissoziierten Zellen aus der esg -Gal4, UAS-GFP Fliegenschnur ohne Sytox erhalten und stellen Sie die FITC Spannung, um sicherzustellen, dass alle GFP-positiven Zellen werden innerhalb der Punktwolke dargestellt.
- Laden Sie die dissoziierten Zellen aus der esg -Gal4 erhalten, UAS-GFP Fliegenschnur mit Sytox aufgenommen. Stellen Sie die Pacific Blue Spannungswert und Tor zu identifizieren und zu getrennt lebenden Zellen von toten, Sytox-positiven Zellen (Gate P1).
- Stellen Sie die SSC-A und FSC-A-Gate, um die GFP zu identifizierenpositiven Zellen (basierend auf dem Histogramm Grundstück) nach Größe und Granularität (Gate P2) bestimmt.
- Stellen Sie den FSC-H und FSC-W Tor zu identifizieren und auszuschließen GFP-positive Zellen Dubletten anhand ihrer Größe (Gate P3).
- Stellen Sie die SSC-H und die SSC-W Tor zu identifizieren und auszuschließen GFP-positive Zellen Dubletten auf der Grundlage ihrer Granularität (Gate P4).
- Verwenden Tor P4, um die GFP-positiven Zellen in einem Histogramm Plot, der die Anzahl der Zellen (count) gegen GFP Intensität zeigt darzustellen. Zwei unterschiedliche Peaks von GFP-positiven Zellen sichtbar. Erstellen Sie ein Tor für jeden Peak (Toren P5 und P6). Gate P5 enthält die Zellpopulation, die ISCs angereichert ist und unabhängig von den anderen Zellen in Gate-P6 sortiert werden.
- Back-Gate in einem Konturdiagramm zu überprüfen, ob die zwei verschiedene GFP-positiven Zellpopulationen enthalten lebende Zellen (vgl Tor P1) und Zellen in der richtigen Größe (vergleichen mit Tor P2).
- Die Zellen zu sortieren, in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen, die 600 & # enthält181; l RNAlater Lösung. Die Sortierung erfolgt bei niedriger Durchflussrate durchgeführt (max. 2,0, 70 & mgr; m Düse, 1.000 Veranstaltungen / sec, 70 psi) und unter Verwendung einer Zwei-Wege-Reinheit Art.
- Nach Abschluss der Sortierung ist, sofort vortexen die sortierten Zellen kurz und die Reaktionsgefäße auf Eis zu halten, bis mit RNA-Isolierung oder andere nachgelagerte Anwendungen voran.
Representative Results
Um zwischen 50.000-100.000 Zellen von FAC Sortierung, zwischen 160 und 200 midguts erhalten müssen seziert. Offensichtlich ist dies der zeitaufwendige Schritt des gesamten Verfahrens. Die in 1A gezeigten Cartoon zeigt die wichtigsten Schritte des Darms Präparation, die im Detail in den hier zur Verfügung gestellten Protokoll beschrieben sind. Dieses Verfahren kann individuell angepasst werden. A seziert gesamte Gastrointestinaltrakt ist in 1B gezeigt.
Wenn alle der Mitteldarm Gewebe verdaut, sofort mit FAC Sortierung fortsetzen. Nach dem in dem Protokoll beschriebene Gating Strategie ermöglicht die erfolgreiche Identifizierung und Sortierung von einer Zellpopulation für ISCs und EBs angereichert aus jungen (Abbildung 2) und aus alten midguts (Abbildung 3). Die P1-Gate einstellen, dass nur gesunde lebende Zellen und Tor aus toten Zellen umfassen. Zellen, die über 10 3 auf der logarithmischen y-ax plottenwird bei der Verwendung des Pacific Blue Kanal als tote Zellen definiert. Die Punkte, die Handlung unter 40 auf der x-Achse (FSC-A) meist Schmutz und daher sind ebenfalls ausgeschlossen (Abbildung 2A). Im Streudiagramm der SSC-A gegen FSC-A werden die Zellen auf der Grundlage ihrer Größe und Granularität verteilt. Für eine optimale Auflösung, werden die Zellen in dem Streudiagramm angeordnet, wie in Figur 2B durch Einstellung der Photovervielfacherröhre (PMT) Spannung gezeigt. In den Streudiagramme FSC-H vs. FSC-W und SSC-H vs. SSC-W Einzelzellen von Zuschlagstoffen und Dubletten, basierend auf Größe (2C) an Granularität (2D) getrennt und auf der Basis. Bei der Darstellung der im Tor P4 enthalten in einem Histogramm Plot, die klare Trennung von GFP-negative, GFP niedrig (Tor P5) und GFP Hoch (Tor P6) Zellen Zellen sichtbar ist (Abbildung 2E). Cells unteren GFP Intensität zeigen, sind klein und weniger körnig und stellen ISCs. Zellen, die höhere GFP intichte sind größer und körnige und stellen EVG. Reverse Transkriptase (RT) -PCR für Dl auf cDNA aus RNA synthetisiert von Zellen jedes GFP-positive Population (Gatter P5, P6) ergab, dass die DL-Signal auf den kleineren, GFP niedrigen Zellen tatsächlich stärker als in den größeren, GFP hohen Zellen (Figur 2H). Die Zellen wurden dann backgated und Konturdiagrammen dargestellt, um zu bestätigen, dass die GFP-niedrig (Gatters P5) und GFP hoch (Gatters P6) Zellen unterscheiden sich in der Größe und Granularität (2F) und sind noch am Leben (Figur 2G). Zu beachten ist, können die beiden Spitzen der GFP-positiven Zellen (GFP niedrigen und hohen GFP) nur gut unterschieden werden, wenn die FITC (GFP) Kanal kalibriert wurde ordnungsgemäß mit den im Protokoll beschriebenen Kontrollen.
Die gleiche Strategie wurde Gating beim Sortieren ISCs aus alten Eingeweide (3) abgeleitet ist. Die Streudiagramme (Figure 3A-D) das Histogramm (3E) und die Kontur-Plots (3F, G) sind analog zu den in 2 gezeigten Wieder. Wie oben erwähnt, gibt es keine bona fide Marker ISCs in alten midguts und damit zu identifizieren kein RT-PCR-Daten werden hier vorgestellt. Allerdings ist der interessante Beobachtung, dass hier die beiden Peaks enthält GFP niedrig (Gate P5) oder GFP hoch (Gate P6) Zellen bleiben deutlich während der Alterung abgetrennt. Ferner kann die Anzahl von Zellen in der GFP hoch (Gate P6) Peak signifikant während des Alterns, was eindeutig emuliert den bekannten Akkumulation misdifferentiated EBs mit dem Alter zunimmt. Die Veränderung des Verhältnisses der beiden Zellpopulationen können auch in den Streudiagrammen ersichtlich ist (vergleiche 3A-D mit 2A-D) und in den Konturdarstellungen (vergleiche Figur 3F, G mit 2F, G). Aus diesen Befunden schließen wir, dass durch die Sortierung für GFP-positiven Zellen mittels FACS wir für ISCs und EVG in jung und alt Mitteldärmen bereichern können.
Um die Reinheit des isolierten ISCs und EVG zu validieren, wurde ein Postsortieranalyse (Abbildung 4) durchgeführt. Die Histogramm Plot des post sortiert ISCs und EVG (4B, C) zeigen Reinheiten zwischen 95% und 98%.
Wenn die Hierarchie der Einstellung der FACS-Parameter, wie oben beschrieben wird strikt eingehalten, können die zwei verschiedenen Zellpopulationen (GFP niedrig, klein und GFP hoch, größer) bereits in einem Streudiagramm GFP vs. FSC-A (5A) zu unterscheiden. Diese beiden Zellpopulationen nicht unterschieden werden können, wenn diese Hierarchie berücksichtigt (5B-D).
Figur 1: (A) Eine schematische Darstellung der wesentlichen Schritte Disse'schenfesselndes die Fliege Darm. Zuerst wird der Kopf entfernt (Entfernen der Flügel ist optional), gefolgt von einer Trennung des Thorax und Abdomen, um den Darm freizulegen. Der Darm wird anschließend aus dem Körperhohlraum in den folgenden Schritten befreit. Die schwarzen Pfeile zeigen das Fortschreiten der Dissektion, während die dunkelrote Pfeile bezeichnen die Zugrichtung. Die roten Linien im letzten Bild zeigen die vorderen und hinteren Grenzen der Mitteldarm. (B) Ein Lichtmikroskopische Aufnahme der erwachsenen Fliege Darm. Die wichtigsten Regionen und anatomische Merkmale sind beschriftet. Rote Linien kennzeichnen die Grenzen des Mitteldarms.
Abb. 2: FAC Sortierstrategie zu identifizieren und zu isolieren ISCs und EVG von jungen (7 Tage) Mitteldärmen Zur besseren Veranschaulichung Zellen, die ISCs sind rot markiert und die Zellen, die EVG werden hervorgehobenin blau in der Streudiagramme (AD) und in der Kontur-Plots (F, G). (A) Die P1 Tor wird sich tot, Sytox-positiven Zellen über 10 3, aufgetragen auf der logarithmischen Y-Achse aus. Die Schwelle des FSC-A wird auf 40 gesetzt, um auch tote Zellen und Trümmer aus. (B) Die Zellen wurden für FSC-A und SSC-A gated an Zellen nach Größe und Granularität (Gate P2) zu wählen. Das Histogramm Plot (E) wurde parallel verwendet, um die GFP-positiven Zellen in der FSC-A vs. SSC-A Streudiagramm (B) zu identifizieren. (C, D) Die Streudiagramme FSC-H vs. FSC-W und SSC-H vs. SSC-W dienen, Aggregate und Dubletten entfernen, und wählen Sie für Singuletts (Gate P3 in C und Gate P4 in D). (E) Das Histogramm Plot zeigt die Anzahl der Zellen und ihrer GFP Intensität. Zwei Peaks, GFP niedrig (Gate P5) und GFP hoch (Gate P6) unterschieden. (F, G) Die Zellen wurden in einer Konturdarstellung Back-Gate, um sicherzustellen, dass die zwei verschiedenen GFP-positive Zelle populat werdenIonen sind in der richtigen Größe (F) auf und enthalten lebende Zellen (G). (H) Reverse Transkriptase (RT) -PCR für Dl auf cDNA aus RNA, die aus den im ersten Peak (Gate P5) enthaltenen Zellen isoliert, synthetisiert und in der zweiter Peak (Gate P6) sind. Mehr Dl Ausdruck könnte in Tor P5 vs. Tor P6 vorhandenen Zellen erkannt werden. Tubulin diente als Ladekontrolle. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
Abbildung 3: FAC Sortierstrategie zu identifizieren und zu isolieren, ISCs und EBs aus den alten (60 Tage) Mitteldärmen Zur besseren Veranschaulichung Zellen, die ISCs sind rot markiert und die Zellen, die EVG sind blau in den Streudiagrammen (AD) markiert und in der. Konturdiagramme (F, G). (A) Die P1-Gatter so eingestellt ist, tot, Sytox-positiven Zellen über 10 3, aufgetragen auf der logarithmischen y-Achse aus. Die Schwelle des FSC-A wird auf 40 gesetzt, um auch tote Zellen und Trümmer aus. Zu beachten ist, ist die altersabhängige Zunahme in größeren GFP-positiven Zellen bereits in diesem Diagramm auf der Hand. (B) Die Zellen wurden für FSC-A und SSC-A gated an Zellen nach Größe und Granularität (Gate P2) zu wählen. Das Histogramm Plot (E) wurde parallel verwendet, um die GFP-positiven Zellen in der FSC-A vs. SSC-A Streudiagramm (B) zu identifizieren. (C, D) Die Streudiagramme FSC-H vs. FSC-W und SSC-H vs. SSC-W dienen, Aggregate und Dubletten entfernen, und wählen Sie für Singuletts (Gate P3 in C und Gate P4 in D). (E) Das Histogramm Plot zeigt die Anzahl der Zellen und ihrer GFP Intensität. Zwei Peaks, GFP niedrig (Gate P5) und GFP hoch (Gate P6) unterschieden werden können. Zu beachten ist, hat sich die Zellpopulation GFP Hoch mit größeren Zellen i erhöhtn Anzahl während des Alterns. (F, G) Die Zellen wurden in einem Konturdiagramm Back-Gate, um zu überprüfen, dass die zwei verschiedenen GFP-positiven Zellpopulationen sind in der richtigen Größe (F) und enthält lebende Zellen (G). Bitte klicken Sie hier, um sehen eine größere Version dieser Figur.
Abb. 4: Ein Postsortieranalyse wurde von den jungen (7 Tage) und alte geführt, um die Reinheit des isolierten ISCs und EVG zu ermitteln (A) GFP-positiven Zellen (60 Tage) Mitteldärmen waren FAC sortiert und in der Histogramm Plot zeigen ihre Verteilung in zwei Peaks basierend auf GFP Intensität. (B) Die Postsortieranalyse zeigt die Reinheit der isolierten ISCs von jung und alt Mitteldärmen, die> 97% ist. (C) Das Postsortieranalyse von sortierten EBs von jung und alt Mitteldärmen zeigt eine Reinheit von> 95%. Die leichte Verunreinigungen können aus Fluoreszenzlöschung oder mechanisch beschädigt GFP-exprimierenden Zellen durch wieder Sortieren der Zellen verursacht werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
Abbildung 5: Beispiele für Streudiagramme, die suboptimal FACS-Daten, was gesehen wird, wenn die FACS-Parameter nicht richtig gesetzt zeigen (A) Repräsentative FACS Profile aller Zellen, wenn die FACS-Parameter richtig eingestellt wurden, basierend auf den im Protokoll beschriebenen Kontrollen.. Die Zellpopulation, die ISCs ist rot eingekreist und die Zellpopulation, die EVG ist blau eingekreist. Die grün eingekreist Zellen sind tote Zellen, die eine stärkere Eigenfluoreszenz im Vergleich zu habenlebende Zellen, die unter 10 3 auf der logarithmischen y-Achse aufgetragen werden. (B) Das Streudiagramm zeigt ein typisches Ergebnis erhalten, wenn die FACS Instrument nicht kalibriert. Keine GFP-positiven Zellen nachgewiesen werden. (C) Wenn der FSC nicht richtig eingestellt ist, werden die verschiedenen GFP-positiven Zellpopulationen nicht erkannt. (D) Wenn der FITC (GFP) Kanal nicht richtig eingestellt ist, die Mehrheit der GFP- positiven Zellen, die sortiert werden sollen, nicht in der Punktwolke, sondern am oberen Rand des Grundstücks aufgetragen. Auch in der hier gezeigten Handlung, die Grenze für Autofluoreszenz wurde nicht eingestellt, daher Zellen, das Grundstück über 10 2 auf der logarithmischen Y-Achse sind eigentlich autofluoreszierenden und könnte fälschlicherweise als GFP-positiven Zellen sein.
Discussion
Das vorgestellte Protokoll beschreibt ein Verfahren zur ISCs von Jung und Alt erwachsenen Drosophila Mitteldärmen, die anschließend für die weitere molekulare Analysen wie Next Generation Sequencing verwendet werden können zu isolieren. FAC Sortierung der GFP-positive Zellpopulation von der esg -Gal4 hat UAS-GFP Fliegenschnur bereits von mehreren Gruppen 21,22 erreicht. Bis heute jedoch die Anwesenheit der zwei unterschiedliche Peaks von GFP-positiven Zellen wurde entweder vergessen oder unterbewertet. Wir zeigen, dass diese Trennung ist nicht nur zwei verschiedene Populationen von Zelltypen (ISCs und EBS), sondern auch, dass die beiden Spitzen der GFP-positiven Zellen bleiben während der Alterung deutlich getrennt. Diese Beobachtung ist äußerst relevant und wertvoll für Forscher Interesse an einem Studium Stamm- oder Vorläuferzellen während der Alterung. Isolierung der ISCs aus alten midguts wurde durch die Tatsache, dass es keinen molekularen Markerkombination auf ISCs in einem gealterten midgut identifizieren behindert. Die einzige Markierung, die unambiguously identifiziert ISCs in einem alten Mitteldarm ist Phospho-histone3 (PH 3), da ISCs sind die einzigen sich teilenden Zellen im Mitteldarm 12,13. Allerdings ist PH3 eine ungeeignete Marker ISCs zu isolieren, da die Anzahl der Teilungs Stammzellen zu einem bestimmten Zeitpunkt zu niedrig ist, um einen angemessenen Betrag von ISCs für spätere Analysen zu erhalten. Die Fliegenschnur esg -Gal4, UAS-GFP ist die häufigste Fluglinie von Forschern, die ISC-Funktion, die Wartung und die Differenzierung zu studieren verwendet. Unser aktuelles Wissen über die molekulare Regulation der Homöostase ISCs basiert auf Studien, in denen spezifische Moleküle und Signalwege manipuliert wurden auf der Basis (in 7 überprüft). Daher fehlt uns noch das Wissen über die endogenen molekularen Veränderungen, die während des Alterns auftreten. Das hier beschriebene Verfahren schließt diese Lücke und basiert auf der Tatsache, dass ISCs können basierend auf ihrer Größe, Granularität und GFP-Intensität von erwachsenen midguts zu jedem Zeitpunkt während des Alterns, isoliert werden kann.
WährendEtablierung und Optimierung dieser Methode gefunden, die folgenden Schritte entscheidend für eine zuverlässige Ergebnisse zu sein. Rund 200 Mut brauchen, um eine gute Menge von ISCs für FAC Sortierung erhalten seziert werden. Die Geschwindigkeit der Dissektion ist entscheidend und hängt von der individuellen Praxis. Eine ausgebildete Person kann 40 Eingeweide innerhalb von 20-30 min zu sezieren. Da GFP wird auch in den Malpighischen im esg -Gal4 ausgedrückt, UAS-GFP Fliege Linie, ist es wichtig, die Malpighischen vollständig aus dem Mitteldarm. Die seziert Mitteldärmen muss in einer kühlen Umgebung aufbewahrt werden, um den Abbau von Gewebe zu vermeiden und zu reduzieren RNAse-Aktivität im Gewebe. Deshalb müssen die seziert Mitteldärmen vom Sezieren Gericht in Mikrozentrifugenröhrchen mit kaltem 1x PBS / 1% BSA-Lösung nach maximal 20-30 Minuten übertragen werden und auf Eis gehalten. Jedoch sind die seziert midguts sollte nicht auf Eis für mehr als 2 Stunden vor dem Beginn der Gewebe Dissoziation mit Trypsin gelassen werden. Die efficilichen Ansatz ist es, so viele Partien von Fliegen wie möglich innerhalb dieser 2 Stunden zu zerlegen, dann starten Sie das Trypsin zu verdauen für diese Chargen. Wenn mehr midguts benötigt werden, können sie während der Inkubationszeiten des Trypsins Verdau präpariert werden.
Obwohl Trypsin ist eine sehr potente Enzym und könnte nachteilige Auswirkungen auf Zellen haben wir noch erhalten genug Lebens, gesunde Zellen für die anschließende Sortierung FAC. Der entscheidende Schritt der Prozedur, die für die Isolierung von intakten Zellen ermöglicht ist, dass die dissoziierten Zellen von der Trypsin-Lösung alle 30 Minuten entfernt. Wenn die seziert Mitteldärmen für 2 ½ Stunden in einer Trypsin-haltigen Lösung bei Raumtemperatur inkubiert, beobachteten wir einen Anstieg von 20-30% in tot, Sytox-positiven Zellen. Es sollte darauf hingewiesen werden, daß die Trypsinlösung wir enthält EDTA. Die Anwesenheit von EDTA wahrscheinlich erleichtert Gewebszerfall Chelatisierung für die ordnungsgemäße Funktion der extrazellulären Matrixmoleküle benötigt Calcium und Magnesiumionen. Die wichtigsten Schritte zur erfolgreichen Art ISCs von Jung und Alt Mut sind die entsprechenden Anfangseinstellungen der FACS und Gating-Parameter mit den beschriebenen Kontrollen und im Anschluss an eine bestimmte Sortierhierarchie. Wir führten die FAC Sortierung auf einer ARIA II Durchflusszytometer (FACSDiva Software). Es ist wichtig, dass das Gerät auf mindestens eine Stunde vor der Sortierung zum Aufwärmen der Laser ausgeschaltet. Zu beachten ist, wenn FAC Sortierung von ISCs wird zum ersten Mal durchgeführt wird, unter Verwendung der oben genannten Kontrollen festgelegt werden die Parameter für das Sortieren und für die Entschädigung müssen: (1) dissoziierten Zellen vom Wildtyp (zB w 1118) Drosophila Mitteldärmen ohne Zusatz von Sytox - die Einstellung dieses Parameters (Schritt 4.4.1) verhindert Sortieren von Zellen auf der Basis ihrer Eigenfluoreszenz; (2) dissoziierten Zellen vom Wildtyp (zB w 1118) Drosophila Mitteldärmen mit Sytox hinzugefügt - die Einstellung dieses Parameters(Schritt 4.4.2) ermöglicht Trennung Toten aus lebenden Zellen (abgestorbene Zellen haben eine hohe Autofluoreszenz und die sortierten GFP-positiven Zellen kontaminiert); (3) dissoziierten Zellen aus Mitteldärmen des esg -Gal4, UAS-GFP Fliegenschnur ohne Sytox - sorgt für die Einstellung dieses Parameters (Schritt 4.4.3), dass alle GFP-positiven Zellen werden innerhalb der Punktwolke dargestellt. Wenn diese Parameter nicht richtig eingestellt ist, wird der sortierten Zellpopulation wahrscheinlich enthalten toten Zellen und Zelltrümmer (5B, C), viele GFP-positiven Zellen wird uns fehlen (5D) und die zwei deutliche Spitzen für GFP-positiven Zellen als im Histogramm Grundstück aus sieht (2E und 3E) werden nicht erkannt. Sobald die FACS und Gating-Parameter eingestellt sind, wird das Gerät kalibriert und bereit, Zellen aus der esg -GAL4, UAS-GFP Fliegenschnur zu sortieren. Da diese Parameter können gespeichert, alle künftigen Sortierung Sitzungen für ISCs und EVG von der esg -GAL4, UAS-GFP Fliegenschnur aus Schritt 4.5 starten. Obwohl die Wahl der "Reinheit" Modus und Durchführen einer Zweiwege-Reinheit Art verringert die Anzahl von Zellen sortiert, ermöglicht es eine höhere Sortier Stringenz (Schritt 4.6 und 4B, C). Zu beachten ist, ist der Vorteil der Verwendung Sytox statt Propidiumiodid, um tote Zellen zu kennzeichnen, dass es nur eine geringe Übergreifen in die FITC (GFP) Kanal, der es einfach, für die Spillover-Ausgleich macht.
Unser Verfahren zum Anreichern ISCs und EBs jeweils auf das Sortieren der Zellen gemäß den verschiedenen GFP-Expressionsniveaus basieren. Mag sein, dass während der Alterung der misdifferentiated EVG auch Ausdruck GFP auf einem niedrigeren Niveau und konnte sich irren als ISCs können. Da jedoch die sortierten Zellen in Größe und Granularität unterscheiden sich auch, glauben wir, dass unsere Sortierstrategie ist die am besten geeignete zu diesem Zeitpunkt für ISCs und EBs reichern. Auch ist es bekannt, dass Zellen in einer alternden midgut Halte ISC Identität haben einen kleinen Kern 15. Um mehr Klarheit über die Identität der sortierten Zellen zu erhalten, kann man Zellen aus einem transgenen Fliege Linie, die esg -GAL4 trägt, UAS-GFP und einem Notch-Signal Reporter-Transgen zu sortieren. Seit Notch hat sich gezeigt, nur aktiv in den EVG 12,13 sein, isoliert ISCs von einem jungen Mitteldarm wäre negativ für die Notch-Reporter, während die EVG wäre positiv für den Notch-Reporter. , Während der Alterung Notch-Signalweg wird jedoch aberrante im Mitteldarm Gewebe. Daher muss sie geprüft, ob dieser Versuchsanordnung ist in der Tat mehr als zuverlässig zwischen ISCs und EVG unterscheiden getrennt von einem alten Mitteldarm werden.
Wir haben dieses Konzept bereits für vergleichende Transkriptom Analyse der ISCs beschäftigt von jung und alt Mitteldärmen und nennt eine Reihe von Faktoren, die unterschiedlich reguliert werden während des Alterns (uv. Observ.). Darüber hinaus ermöglicht dieses Verfahren zur Analyse der Unterschiede in der Genexpression zwischen ISCs und EBs. Eine solche Untersuchungs wird Einblick in die ersten molekularen Veränderungen, wie eine Zelle die Differenzierung tritt auftreten. Auch die Isolierung der EVG bei Alterung und weiteren Analysen Aufschluss über die molekularen Veränderungen der altersbedingte Fehldifferenzierung zu vergießen. Außerdem kann dieses Verfahren mit anderen genetischen Werkzeugen in Drosophila verwendet, um Genfunktion kombiniert werden. Zusammenfassend bietet diese Methode eine unvoreingenommene Herangehensweise an molekularen Merkmalen sowie Änderungen der ISCs und EVG während der Alterung zu untersuchen. Dies ist ein wertvolles Werkzeug, Erforschung von Alterungsmechanismen in adulten Stammzellen und Vorläuferzellen erleichtert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Forceps: Dumont, Inox Biologie #5 | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| SefarNitex 03-150um/38 (35 µm nylon mesh) | Sefar | 3A03-0150-102-00 | |
| Falcon 5 ml Round Bottom Polystyrene Test Tube with Cell Strainer Snap Cap | Corning | 352235 | |
| Polymax 1040 | Heidolph | 543-42210-00 | |
| Albumin from bovine serum (BSA) | Sigma | A4503-50G | |
| 0.5% Trypsin-EDTA | Invitrogen | 15400-054 | Trypsin obtained from a different company most likely has a different activity and the duration of the trypsin digest has to be adjusted accordingly. |
| SYTOX Blue Dead Cell Stain for flow cytometry | Life Technologies | S34857 | |
| RNAlater Stabilization Solution | Life Technologies | AM7023 | Other solutions, e.g., Trizol can be used for subsequent RNA isolation |
| FACSAria II cell sorter | Becton Dickinson | Turn on one hour prior to sorting |
References
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