Introduction
오래된 성장의 피할 수없는 결과는 기능을 유지하기 위해 조직과 장기의 감소 능력이다. 성체 줄기 세포는 단 나이 유기체 같이 줄기 세포는 또한 생물학적 행동의 감소를 경험, 조직 항상성 및 장기의 기능을 유지하는데 필수적이다. 이는 장내 상피 세포와 같은 높은 회전율을 가지고 조직에 특히 해롭다. 세 줄기 세포의 특징은 게놈 손상 장애가 복구 메커니즘, 손상된 세포주기 조절 및 (1-3에서 검토) 줄기 세포의 정상적인 동작에 영향을 모두 misregulated 신호 전달 경로를 포함한다. 특정 신호 전달 경로를 조작하거나 특정 유전자를 쓰러 뜨린, 우리는 규제와 정상 줄기 세포 행동을 유지하는 자신의 역할에 대한 통찰력을 얻고있다. 이러한 실험의 대부분은 후보 분자 접근법이기 때문에, 우리는 중에 줄기 세포에서 발생 내인성 분자 변화에 대해 거의 지식을 가지고노화. 이 문제를 접근하는 한 가지 방법은 기존의 줄기 세포가 발현 프로파일 에이징 동안 크게 변화 분자를 식별하는 대 영 사체를 비교하는 것이다. 불행하게도, 생물학적, 기술적 문제는 지금까지이 방법에 관한 우리의 진행을 방해했다.
초파리 melanogaster의는 (4 검토) 표현형 노화 수명이 짧은 (60-70 일간) 및 전시회가 있기 때문에 노화를 연구하는 매우 적합 모델 생물이다. 또한, 초파리의 노화 과정은 온도에 의해 가속화 될 수있다. 29 ° C에서 파리를 유지하는 경우, 장 조직의 세 표현형은 이미 십오일 5 이후에 관찰 할 수있다. 또한, 초파리 유전자 조작의 과다에 대한 의무입니다. 특히, 초파리 중장 다른 신호 경로 및 환경 문제에 미치는 영향을 연구하기 위해 우수한 모델 시스템으로서 등장했다(6-10에서 검토) 노화시 장 줄기 세포 (ISCS)의 생물학. 초파리 장내 상피 세포는 높은 회전율 속도를 가지고 있으며, 남성 (11) 한 달에 한 번 여성의 모든 2 주 갱신하고있다. 초파리 중장에 상주 ISCS 이간질 자기 갱신 ISC 및 enteroblast (EB) (12, 13)라는 포스트 유사 분열 전구 세포를 생성하는 능력을 갖는다. EB는 흡수 장 세포 또는 분비 enteroendocrine 셀 하나에 구별합니다. 이 현재까지 명확 ISC 레이블 만 마커 조합은 전사 인자 달팽이 (ESG)과 노치 델타 리간드 (DL) (14)의 표현이다. 그러나 이것은 단지 젊고 건강한 장을위한 마찬가지입니다. 노화 동안, 중장 상피는 증식 15-17 ISC의 증가에 의해 특징된다. 또한, 비정상적인 노치 신호는 ISC의 딸 세포의 운명 결정을 방해EBS를 15 misdifferentiation을 유도한다. 이에 의해 세 중장에 선의 줄기 세포를 식별하기에 불충분 식 DL 렌더링 노치 시그널링 및 CO ESG 표현 및 DL에 대한 활성 세포의 축적을 초래한다. ISCS 사실을 식별하는 어려움은 지금까지 ISCS 내인성 노화 변화를 조사 할 수있는 능력을 방해하고있다.
우리는 ISCS와 EBS의 GFP의 발현 수준이 본질적으로 다른 노화에 걸쳐 다른 남아있는 ESG -Gal4, UAS-GFP 유전자 변형 플라이 라인을 활용하여이 문제를 다루어왔다. 유사한 접근법이 유충 neuroblasts 18,19 뉴런의 분리를 위해 설명되었다. 젊은이와 노인 ESG -Gal4, UAS-GFP 파리의 Midguts 해부 및 단일 세포로 분해되었다. 세포를 형광 활성 세포 분류 (FACS)를 사용하여 GFP 양성 세포에 대해 정렬 하였다. 흥미롭게도, 정렬 GFP 양성 CGFP의 형광 강도에 따라 별개의 두 봉우리로 분산 ELL 학생 (GFP 높은 GFP 낮음). 또한,도 셀 크기와 상관 개의 피크에서 GFP 양성 세포의 분포 : GFP 낮은 강도를 나타내 세포 작다고 GFP 및 높은 강도를 가진 반면, 덜 세분화 된 세포는 더 크고 더 세분화되었다. 이러한 관찰은이 작은 ISCS GFP 강도를 기초 FACS를 이용하여 적절한 순방향 산란 (FSC) 및 측면 스 캐터 (SSC)를 사용하여 설정 큰 EB를 구별 할 수 있다고 제안했다. 흥미롭게도, 2 개의 피크가 명확하게 분리 된 노화 중에 남아 있었다. 또한, 2 개의 피크의 비율은 노화 midguts 상술의 특징을 반영하는 방식으로 변경 : 대규모의 개수가 시간이 지남에 EB를 증가 misdifferentiated 즉있다. 이러한 결과에서 우리는 적절한 FACS 파라미터 설정을 사용하여 GFP 양성 세포에 대해 정렬하여 우리가 임의의 시점에서 D ISCS 및 EBS에 대한 풍요롭게 결론uring 노화.
요약하면, 우리는 모든 연령의 초파리 midguts에서, 두 개의 서로 다른 세포 집단, ISCS와 EBS에 대한 풍부하며 차세대 시퀀싱으로 추가 분석을 위해 이러한 세포를 분리하는 연구를 할 수있는 FACS 전략을 소개합니다. 이 강력한 방법은 줄기 또는 전구 세포의 풍부한 인구 고령화에 내재 된 내인성 분자 메커니즘을 연구 할 수 있습니다. 이러한 연구로부터 얻어진 데이터는 의심 종간 노화에 중요 보존 된 분자의 식별을 용이하게한다.
Protocol
참고 :이 프로토콜은 FAC가 정렬하여 ISCS를 분리하기를 처음 사용하는 경우, 다음과 같은 컨트롤이 초기에 제대로 FACS 매개 변수를 설정하기 위해 필수 사항 야생형 (예 : 1,118 원) 해리 된 세포 SYTOX없이 초파리 midguts. 야생 유형 (예 : 1118 w)에서 해리 된 세포 SYTOX와 초파리 midguts은 (단계 3.6 참조). SYTOX없이 ESG -Gal4, UAS-GFP 플라이 라인의 midguts에서 해리 세포.
굿 해부를위한 솔루션 및 요리 1. 준비
- 각 포함 40 여성 ESG -Gal4, UAS-GFP 플라이 라인에서 날아 4-6 유리 병을 준비합니다.
- 10 배 PBS 원액에서 500 ㎖의 1X PBS (1.8 mM의에 NaH 2 PO 4 · H 2 O, 8.4 mM의 나 2 HPO 4 · 2 O 2H, 175 mM의 NaCl을 7.4으로 산도를 조정) 준비합니다.
- 3.5 준비1X PBS에서 % 아가로 오스 용액 (100 ㎖ 1X PBS 3.5 g 전기 등급 아가). 바닥을 충당하기 위해 배양 접시에이 솔루션 (지름 8.5 cm)을 부어 해부 접시를 준비합니다. 아가로 오스 층 해부 절차를 수행하는 동안 집게의 끝 손상을 방지 할 수 있습니다. 젤은 4 ℃에서 해부 접시를 저장 응고 후.
- 해부하기 전에 1X PBS + 1 % BSA 300 ml의 신선한를 준비하고 얼음에 4 ℃에서 병을 배치합니다.
- 원심 분리기를 켜고 멋진 4 ° C를 할 수 있습니다.
- 가장자리를 부드럽게하기 위해이 유리 파스퇴르 피펫의 팁을 불꽃.
- 면도 포셉 두 쌍의 70 % 에탄올로 한 면도날.
- 얼음에 해부 midguts를 수집하기 위해 네 개의 1.5 ml의 여섯의 microcentrifuge 튜브를 놓습니다.
중장의 위장관 해부 2. 준비
- 표준 플라이 침대에 CO 2와 함께 한 유리 병 (40 파리)에서 파리를 마취, 모든 목을 베다면도날을 사용하여 해부 접시로 전송 날아갑니다. 아가로 오스 겔을 커버 해부 접시에 차가운 1X PBS / 1 % BSA 용액을 붓는다. 파리 떠.
- 포셉의 다른 쌍의 가슴을 잡고, 포셉 한 쌍 플라이 복부를 잡아. 복부에서 흉부를 분리합니다. 직감 볼 수 및 foregut / 작물은 대부분 여전히 흉부에 연결됩니다.
- 창자를 잡고 가슴에서 빼냅니다. 장을 펼쳐 자르기를 잡아 약간 앞쪽으로 멀리 배에서 창자를 빼냅니다.
- 하나 포셉 한 쌍의 포셉의 다른 쌍의 전방 열린 표피의 가장자리와 복부의 뒤쪽 끝을 잡아. 돌출 장 조직을 파괴하지 않도록주의하십시오. 표피를 중단하고 전체 창자가 복강에서 철수 할 때까지 뒤쪽으로 매우 부드럽게 계속 가져갈 멀리 뒤쪽 끝을 당겨. 그것은이 너무 큰 경우 작물 미리 제거 할 수도체강 내지.
- 베어 중장을 떠나 foregut, Malpighian 세관, hindgut과 난소를 제거합니다.
- 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 차가운 1X PBS / 1 % BSA 솔루션을 포함하는 1.5 ml의 microcentrifuge 관에 해부 midguts의 배치를 전송하고 얼음에 튜브를 유지. 샘플은 2 시간 이내에 처리해야합니다.
- 전체 배치의 해부가 완료되면, 파편을 통해 왼쪽 씻어 두 번 증류수로 해부 접시를 씻어. midguts의 다음 배치를 (반복 2.1-2.7 단계) 해부 시작합니다. 2 시간 내에 가능한 한 많은 배치를 해부 한 다음 3.1 단계로 진행합니다.
FAC 정렬을위한 수확 세포에 굿 조직 3. 소화
- midguts에서 1X PBS / 1 % BSA 솔루션을 제거하고 각 샘플에 0.5 % 트립신 - EDTA 용액 500 μl를 추가합니다.
- 소용돌이 아니라 20 초 및 25 ~ 30 분 동안 실온에서 20 rpm으로 회전 / 부드러운 흔들어 샘플을 품어.
- 다시 30 분 후, 볼텍스하고 튜브의 바닥에 그대로 중장 조직 싱크하자. 조심스럽게 신선한 1.5 ml의 microcentrifuge 관에 메쉬 골조 유리 파스퇴르 피펫으로 정지에있는 세포를 제거하고 35 μm의 나일론을 통해 필터.
- 4 ° C에서 5 분 동안 100 XG에서 세포를 스핀 다운. 다이제스트를 시작할 때 참고로, 세포 펠렛 처음에는 표시되지 않을 수도 있지만 다이제스트가 진행 조직으로 볼 수있게됩니다.
- 조심스럽게 남아 중장 조직 손상을 포함하는 원래의 샘플 튜브로 다시 트립신 용액을 전송. 펠릿에서 너무 많은 세포를 전송하지 마십시오.
- 부드럽게 감기 1X PBS / 1 % BSA 중 400 μL의 세포 펠렛을 다시 일시. 얼음에 해리 된 세포를 함유하는 마이크로 원심 분리 튜브를 유지하고 빛으로부터 세포를 보호하기 위해 알루미늄 호일로 커버 튜브.
- 다시 남은 그대로 중장 조직을 함유 트립신 용액 와동과 샘플을 배치실온에서 추가로 30 분간 로커 상.
- 중장 조직의 모든 소화 될 때까지 반복 3.4.3 3.3 단계를 반복합니다. 하나 microcentrifuge 관에 모든 마이크로 원심 튜브에서 해리 세포를 결합합니다. 이것은 1.5 ㎖의 결합을 초과 할 수있는 모든 세포 현탁액의 부피 보낸 3.4 같이 원심 분리 단계를 필요로 할 수있다. 얼음에 세포 현탁액을 유지하고 빛으로부터 세포를 보호합니다.
- 4 ℃에서 5 분 동안 100 XG에서 해리 세포를 스핀 다운. 조심스럽게 microcentrifuge 관에 1X PBS / 1 % BSA 용액의 약 50 ~ 100 μl를 떠나 가능한 한 상층 액만큼을 제거합니다. 부드럽게 SYTOX (20,000 1)을 함유하는 PBS / 1 % BSA 800 ㎕의 1X에서 해리 된 세포를 재현 탁.
- 셀 스트레이너 스냅 캡 (35 μm의 나일론 메쉬)를 통해 세포를 필터링하여 5 ml의 둥근 바닥 팔콘 튜브를 세포 현탁액을 전송합니다. 항상 얼음에 세포 샘플을 유지하고 빛으로부터 보호. 세포는 지금 준비정렬.
- 이후 세포 RNA의 분리를 위해 정렬 될 각으로 마이크로 원심 튜브에 RNAlater 용액 600 μL 피펫. 다른 어플리케이션의 하류 세포는 멸균 PBS에서 예, 다른 용액에 회수 할 수있다.
FAC 정렬은 장내 줄기 세포를 분리 4.
- 유동 세포 계측법 기기에 스위치 정렬에 적어도 한 시간 전에. 유체 시스템 기포가 없는지 확인합니다.
- 칼집 유체 스트림으로 세포를 주입하는 70 μm의 노즐 크기를 선택합니다.
- (70 ㎛의 노즐을 사용하는 경우 6-7) 간극 값이 기준 값에 대응하도록 코어 액체 스트림의 진폭을 조정한다. 코어 액체 스트림을 정렬하기 시작하기 전에 안정되도록.
- 처음에 정렬에 대한 매개 변수를 설정할 때이 순서를 따르십시오
- 야생 형 용기에서 얻은 해리 세포를로드합니다. 첫째, FSC와 SSC 전압을 조정산포도의 중앙에 세포를 플롯합니다. 모든 세포가 대수 X 축 상에 플롯 (10)이 아래로되도록 둘째, FITC (GFP)의 전압을 조정한다. FITC 매개 변수를 설정하면 형광도에 대한 제한을 설정합니다.
- SYTOX와 야생 형 용기에서 얻은 해리 세포가 추가로드합니다. FSC-A 산포도 대 태평양 블루 죽은, SYTOX 양성 세포에서 태평양 블루 전압 값 및 게이트 파악하고 별도의 거실 세포를 조절합니다.
- SYTOX없이 ESG -Gal4, UAS-GFP 플라이 라인에서 얻은 해리 세포를 넣고 모든 GFP 양성 세포가 산포도 내에서 플롯되도록 FITC 전압을 조정합니다.
- ESG -Gal4에서 얻은 해리 세포를로드, SYTOX와 UAS-GFP 플라이 라인 덧붙였다. 죽은, SYTOX 양성 세포 (게이트 P1)에서 태평양 블루 전압 값 및 게이트 파악하고 별도의 거실 세포를 조절합니다.
- SSC-A를 설정하고 FSC는-A 게이트 GFP-를 식별하기 위해크기 및 입도 (게이트 P2)에 의해 측정 (히스토그램 플롯에 기초한) 양성 세포.
- 크기 (게이트 P3)를 기반으로 GFP 양성 세포는 이중를 확인하고 제외 할 FSC-H와 FSC-W 게이트를 설정합니다.
- SSC-H 식별하고 그들의 단위 (게이트 P4)을 기반으로 GFP 양성 세포는 이중를 제외 할 SSC-W 게이트를 설정합니다.
- GFP 강도 대 세포 (셀)의 수를 표시하는 막대 그래프 음모에 GFP 양성 세포를 묘사하는 게이트 P4를 사용합니다. GFP 양성 세포의 두 가지 피크가 표시됩니다. 각 피크 (게이트 P5와 P6)에 대한 게이트를 만듭니다. 게이트 P5는 ISCS 용 풍부하고 게이트 P6의 셀에서 개별적으로 정렬 할 수 있습니다 세포 집단이 포함되어 있습니다.
- 윤곽 곡선의 백 게이트는 두 가지 GFP 양성 세포 집단은 살아있는 세포 (게이트 P1과 비교) 및 올바른 크기의 셀 (게이트 P2와 비교)이 포함되어 있는지 확인합니다.
- 600 & # 포함 된 1.5 ml의 마이크로 원심 튜브에 세포를 정렬181; RNAlater 솔루션의 리터. 정렬은 저 유량으로 이루어진다 (최대. 2.0 μm의 노즐 (70), 1000 이벤트 / 초, 70 PSI) 및 양방향 퓨리티 정렬을 채용.
- 정렬이 완료되면, 즉시 분류 세포를 간단히 와동와 RNA 분리 또는 기타 다운 스트림 응용 프로그램을 진행하기까지 얼음에 마이크로 원심 튜브를 유지.
Representative Results
(160) 200 midguts 사이에 정렬 FAC에서 50000 세포 사이 얻으려면 해부 할 필요가있다. 분명히 이것은 전체 공정 단계의 가장 시간이 소요되는 것이다. 도 1a에 도시 된 만화는 여기에 제공된 프로토콜에 자세히 설명되어 장내 해부의 주요 단계를 나타낸다. 이 절차는 개별적으로 변형 될 수있다. 해부 위장관 전체는도 1B에 도시된다.
중장 조직의 모든 소화되면 즉시 FAC 정렬을 계속합니다. 프로토콜에 설명 된 게이팅 전략을 따르는 것은 젊은 (그림 2)에서 사채 ISCS과에 대한 풍부한 세포 인구를 성공적으로 식별 및 분류에 대한 오래된 midguts (그림 3)에서 할 수 있습니다. P1 게이트는 건강한 살아있는 세포 밖으로 게이트 죽은 세포에 포함하도록 설정되어 있습니다. 대수 Y-AX 10 세 이상 플롯 세포태평양 블루 채널을 사용할 때하는 죽은 세포로 정의됩니다. 따라서 대부분 파편이며 X 축 (FSC-A) (40) 아래에 도트 플롯도 (도 2A)를 제외한다. FSC-SSC 대-A의 산포도 세포 크기 및 입도 (granularity)에 기초하여 분포된다. 광전자 증 배관 (PMT)의 전압을 조정함으로써,도 2b에 도시 된 바와 같이, 최적 해상도를 들어, 세포 산점도에 배치된다. 산포도 FSC-W 대 FSC-H와 SSC-W 대 SSC-H에서 단일 세포 단위 (그림 2D)에 (그림 2C) 크기에 따라 단위 및 이중선과 분리를 기반으로합니다. 히스토그램 플롯, GFP 음성, GFP 낮은 (게이트 P5)의 별개의 분리 및 GFP 높은 (게이트 P6) 세포에서 게이트 P4에 포함 된 세포를 묘사 할 때 눈에 보이는 (그림 2E)입니다. 낮은 GFP 강도를 나타내는 세포는 작고 덜 세분화하고 ISCS를 나타낸다. 높은 GFP의 INT를 나타내는 세포ensity는 더 크고 더 세분화하고 사채를 나타냅니다. 각 GFP 양성 집단의 세포 RNA로부터 합성 된 cDNA에 의해 DL 역전사 (RT) -PCR 역 (게이트 P5, P6)은 하향 링크 신호가 크고, GFP 높이보다 더 작은, GFP 낮은 세포에서 실제로 강한 것으로 밝혀 세포 (그림 2H). 세포는 backgated 및 GFP 낮은 (게이트 P5)과 GFP 높은 (게이트 P6) 세포의 크기와 입도 (그림 2 층)에서 차이 (그림 2G) 아직 살아 있는지 확인하기 위해 콘타에 묘사되었다. FITC (GFP) 채널 적절히 프로토콜에서 설명한 제어를 사용하여 보정 한 경우에 참고로, GFP 양성 세포는 2 개의 피크 (GFP GFP 낮고 높음)에만 잘 구별 될 수있다.
오래된 용기 (그림 3)에서 파생 된 ISCS을 정렬 할 때 같은 게이트 전략을 사용 하였다. 산포도 (Figur전자 3A-D), 히스토그램 (도 3e) 및 등고선 플롯 (도 3f, G)은도 2에 도시 된 것과 유사하다. 전술 한 바와 같이, 따라서 이전 midguts 이상에서 ISCS를 식별하는 선의 마커는 없다 아니 RT-PCR 데이터가 여기에 표시됩니다. 그러나, 여기에 흥미로운 관찰 GFP 낮은 (게이트 P5) 또는 GFP 높은 (게이트 P6) 세포를 포함하는 두 개의 봉우리가 뚜렷하게 노화 동안 분리 된 상태를 유지한다는 것이다. 또한, 높은 GFP (게이트 P6) 피크 셀수 상당히 명확 연령 misdifferentiated 사채의 공지 된 축적을 에뮬레이트하는, 노화 동안 증가한다. 두 세포 집단의 비율 변화는 산포도에서 본 (도 2A-D와도 3A-D)와 비교하여 윤곽 플롯 (도 2F, G와도 3f, G)와 비교 될 수있다. 우리가 결론 이러한 연구 결과에서 그 GFP에 대한 분류 작업FACS를 사용하여 양성 세포는 우리는 젊은이와 노인 midguts에 ISCS와 EBS에 대한 풍부하게 할 수 있습니다.
고립 된 ISCS 및 사채의 순도를 확인하기 위해, 포스트 정렬 분석 (그림 4)을 실시 하였다. 포스트 분류 ISCS 및 사채 (그림 4B, C)의 히스토그램 플롯은 95 %와 98 % 사이의 순도를 묘사.
로서 상술 FACS 파라미터를 설정 계층 구조를 무시한 경우, 두 개의 서로 다른 세포 집단 (GFP, 낮은 작고 GFP 높은, 더 큰)는 이미 산점도 FSC-A (도 5a) 대 GFP에서 구별 될 수있다. 이 계층 구조 (그림 5B-D)를 무시하는 경우이 두 세포 집단은 구별 할 수 없습니다.
도 1 (A) 너가 너무의 주요 단계를 개략적플라이 장을 cting. 먼저, 헤드가 소화관을 노출 흉부 및 복부의 분리 하였다 (날개의 제거는 선택)을 제거한다. 굿이어서 다음 단계에서 체강에서 해방된다. 어두운 빨간색 화살표가 풀 방향을 표시하는 반면, 검은 색 화살표는, 박리의 진행을 보여줍니다. 마지막 이미지에서 빨간색 선은 중장의 전방 및 후방 경계를 나타냅니다. (B) 성인 플라이 소장의 광학 현미경 이미지. 주요 지역과 해부학 적 특징이 표시되어 있습니다. 적색 선은 중장의 경계를 표시한다.
그림 2 :. ISCS를 나타내는 FAC를 식별하고 젊은 (7 일) midguts에서 ISCS과 사채를 분리하는 전략을 정렬 더 나은 시각화를 들어, 세포는 빨간색으로 강조하고 사채를 나타내는 세포가 강조 표시됩니다산점도 (AD)에서 파란색과 콘타 (F, G).의 (a)에서 P1 게이트는 대수 Y 축에 10 세 이상 플롯 죽은 SYTOX 양성 세포를 배제하도록 설정된다. FSC-A의 임계 값은 또한 죽은 세포와 파편을 제외 (40)에 설정되어 있습니다. (B) 세포는 크기와 입도 (게이트 P2)에 따라 셀을 선택하는 FSC-A와 SSC-A에 대한 문이되었다. 히스토그램 플롯 (E)는 SSC-A 산점도 (B) 대 FSC-A에서 GFP 양성 세포를 식별하기 위해 병렬로 사용 하였다. (C, D) FSC-W 대 산포도 FSC-H 및 SSC-W 대 SSC-H는 단위 및 이중선을 제거하고 단봉을 위해 (D에서 C에서 게이트 P3 게이트 P4)을 선택하는 역할을한다. (E) 히스토그램 플롯 세포 및 GFP 강도의 수를 표시합니다. 두 봉우리, GFP 낮은 (게이트 P5)과 GFP 높은 (게이트 P6)가. (F, G) 세포가 그 두 가지 GFP 양성 세포의 populat을 확인 윤곽 플롯에 백 게이트했다 구별 할 수있다제 1 피크 (게이트 P5)에 존재하는 세포로부터 단리 된 RNA로부터 합성 된 cDNA에 DL위한 역전사 (RT) -PCR과의 이온이 정확한 크기 (F)의이고 포함 살아있는 세포 (G). (H) 각각 제 2 피크 (게이트 P6). 더 DL 표현은 게이트 P6 대 게이트 P5에 존재하는 세포에서 발견 할 수있다. 튜 불린은 로딩 대조군으로. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : FAC를 식별하고 (육십일) 이전 midguts에서 ISCS과 사채를 분리하는 전략을 정렬 더 나은 시각화를 들어, ISCS를 나타내는 세포가 빨간색으로 강조하고 사채를 나타내는 세포가 산포도 (AD)에서 파란색으로 강조하고있다. 콘타 (F, G). (A) P1 게이트는 대수 y 축 상에 플롯 (10) 위에 3 죽은 SYTOX 양성 세포를 배제하도록 설정된다. FSC-A의 임계 값은 또한 죽은 세포와 파편을 제외 (40)에 설정되어 있습니다. 참고로, 큰 GFP 양성 세포의 연령에 따라 증가는 이미이 음모에 분명하다. (B) 세포는 크기와 입도 (게이트 P2)에 따라 셀을 선택하는 FSC-A와 SSC-A에 대한 문이되었다. 히스토그램 플롯 (E)는 SSC-A 산점도 (B) 대 FSC-A에서 GFP 양성 세포를 식별하기 위해 병렬로 사용 하였다. (C, D) FSC-W 대 산포도 FSC-H 및 SSC-W 대 SSC-H는 단위 및 이중선을 제거하고 단봉을 위해 (D에서 C에서 게이트 P3 게이트 P4)을 선택하는 역할을한다. (E) 히스토그램 플롯 세포 및 GFP 강도의 수를 표시합니다. 두 봉우리, GFP 낮은 (게이트 P5)과 GFP 높은 (게이트 P6)를 구별 할 수 있습니다. 참고로, 더 큰 세포를 포함하는 세포 집단의 GFP의 높은 내가 증가했다노화 동안 n 개. (F, G) 세포. 두 가지 GFP 양성 세포 집단이 올바른 크기 (F)의이고 살아있는 세포 (G)를 포함하는지 확인 윤곽 플롯에 백 게이트이었다 하려면 여기를 클릭하십시오 이 그림의 더 큰 버전을 확인합니다.
그림 4 :. 포스트 정렬 분석은 고립 ISCS 및 사채의 순도를 결정하기 위해 수행되었다 (A) GFP 양성 세포를 (7 일) 젊은이와 노인에서 (육십일) midguts는 FAC 정렬했다 히스토그램 플롯은 자신의 분포를 보여 GFP 강도에 따라 두 봉우리로. (B) 포스트 정렬 분석> 97 %이다 젊은이와 노인 midguts에서 고립 된 ISCS의 순도를 보여줍니다. (C) 정렬 E의 포스트 정렬 분석젊은이와 노인 midguts에서 기지국은> 95 %의 순도를 보여줍니다. 약간의 불순물은 형광 담금질 또는 세포를 다시 정렬에 의한 기계적 손상 GFP 발현하는 세포 발생할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 5 : FACS 파라미터를 적절하게 설정되지 않은 경우에 볼 차선 FACS 데이터를 표시 산포도로서는 모든 셀 (A) 주제 FACS 프로필 FACS 파라미터 프로토콜에 설명 된 제어에 기초하여 적절하게 설정했다.. ISCS를 포함하는 세포 인구는 빨간색으로 동그라미과 사채를 포함하는 세포 집단은 파란색 동그라미. 녹색 원으로 세포에 비해 더 강한자가 형광이 죽은 세포이다로그 y 축에 10 세 이하 플롯 살아있는 세포,. (B) 산포도 FACS 악기를 보정하지 않은 때의 전형적인 결과를 보여줍니다. 어떠한 GFP 양성 세포가 발견되지 않는다. FSC가 적절히 설정되지 않는 경우, 다른 GFP 양성 세포 집단이 검출되지 않은 (C). (D) FITC (GFP) 채널이 정확하게 조정되지 않으면 GFP-의 대부분 양성 세포는 산포도도 아닌 플롯의 상단 가장자리를 따라 그려되지 않습니다 정렬 할 수 있습니다. 또한, 여기에 표시된 음모에, 형광도에 대한 제한은 세포 대수 y 축에 플롯 위 (10)이 실제로 autofluorescent하고 GFP 양성 세포로 오인 될 수있는, 따라서 조정되지 않았습니다.
Discussion
제시된 프로토콜은 이후 같은 차세대 시퀀싱으로 더 분자 분석에 사용할 수있는 젊은이와 노인 성인 초파리 midguts에서 ISCS를 분리하는 방법을 설명합니다. ESG -Gal4에서 GFP 양성 세포 인구의 FAC 정렬은, UAS-GFP 플라이 라인은 이미 여러 그룹 (21, 22)에 의해 달성되었다. 그러나, 지금까지 GFP 양성 세포의 두 가지 피크의 존재는 간과하거나 또는 과소되었다. 우리는이 분리뿐만 아니라, GFP 양성 세포의 2 개의 피크가 명확하게 분리 된 노화 동안 유지 하는게, 세포 유형 (EBS를 ISCS)의 두 개의 다른 개체군을 나타낸다는 것을 보여준다. 이 관찰은 관련성이 높은 노화 동안 줄기 또는 전구 세포를 공부에 관심이 연구자들에게 유용하다. 옛부터 midguts ISCS의 아이솔레이션에 세 중장 ISCS를 식별하는 분자 마커의 조합이 없다는 사실에 의해 저해되었다. 유일한 표식이 유를ISCS는 중장 (12, 13)에서 유일하게 나누어 세포이기 때문에 nambiguously 오래 중장에 ISCS를 식별 포스 histone3 (PH3)이있다. 그러나, PH3는 임의의 주어진 시점에서 줄기 세포의 분할 수는 후속 분석을 위해 ISCS 적당량을 얻기 위해서는 너무 낮기 때문에 ISCS을 분리 마커 부적합하다. 플라이 라인 ESG -Gal4, UAS-GFP는 ISC 기능, 유지 보수 및 분화를 연구 연구자들에 의해 사용되는 가장 일반적인 플라이 라인입니다. ISCS 항상성의 분자 규제에 대한 우리의 지식이 특정 분자와 신호 전달 경로가 조작 된 한 연구에 기초한다 (7 검토). 따라서, 우리는 여전히 노화 과정에서 발생하는 내인성 분자 변경 사항에 대한 지식이 부족하다. 본원에 기재된 방법은,이 갭을 닫고 ISCS 노화 중에 어느 시점에서 성인 midguts 크기, 입도 및 GFP 강도에 기초하여 분리 될 수 있다는 사실에 기초한다.
동안구축하고 우리는 다음 단계는 신뢰할 수있는 결과에 중요한 것으로 발견이 방법을 최적화. 약 200 배짱은 FAC 정렬을 위해 ISCS의 좋은 금액을 얻기 위해 해부 할 필요가있다. 해부의 속도는 매우 중요하고 개인의 관행에 따라 달라집니다. 교육을받은 개인은 20 ~ 30 분 이내에 40 배짱을 해부 할 수 있습니다. GFP는 또한 ESG -Gal4의 Malpighian 세뇨관에서 발현되기 때문에, UAS-GFP 플라이 라인 완전히 중장 Malpighian 세관을 제거하는 것이 필수적이다. 해부 midguts은 조직 저하를 방지하고 조직에서의 RNAse 활동을 줄이기 위해 멋진 환경에서 보관해야합니다. 따라서 해부 midguts 20-30 분 후에 최대 감기 1X PBS / 1 % BSA 용액을 함유하는 마이크로 원심 분리 튜브로 해부 접시로부터 옮기고 얼음에 보관해야한다. 그러나, 해부 midguts 트립신과 조직 분리를 시작하기 전에 이상 2 시간 동안 얼음에 남아 할 수 없습니다. 가장 effici엔트 방법은 다음이 2 시간 내에 가능한 한 파리의 많은 배치를 해부 트립신이 배치 다이제스트 시작하는 것입니다. 더 midguts가 필요하면, 이들은 트립신의 다이제스트 배양 시간 동안 해부 될 수있다.
트립신은 매우 강력한 효소 및 세포에 해로운 영향을 미칠 수 있지만, 우리는 여전히 충분한 생활, 이후 FAC 정렬을위한 건강한 세포를 얻을. 손상 세포의 분리를 허용 우리 절차 핵심 단계는 세포 해리 용액 트립신 매 30 분에서 제거된다는 점이다. 해부 midguts 실온에서 용액을 함유 트립신 2 ½ 시간 동안 배양하는 경우, 우리는 죽은 SYTOX 양성 세포의 20 ~ 30 %의 증가를 관찰 하였다. 그것은 우리가 사용하는 트립신 솔루션은 EDTA가 포함되어 있음을 지적한다. EDTA의 존재가 아마 세포 외 매트릭스 분자의 적절한 기능을 위해 필요한 칼슘 및 마그네슘 이온을 킬레이트 화하여 조직의 붕괴를 용이하게한다. 젊은이와 노인의 용기에서 가장 중요한 단계에 성공적으로 정렬 ISCS는 FACS 및 설명 컨트롤을 사용하여 특정 분류 계층 구조를 다음 게이팅 매개 변수의 적절한 초기 설정입니다. 우리는 ARIA II 흐름 사이토 (FACSDiva 소프트웨어)에 정렬 FAC을 수행 하였다. 이 악기는 전에 레이저를 따뜻하게 정렬에 한 시간 이상 전원이 켜져 있는지 중요합니다. ISCS의 FAC 정렬이 처음으로 수행되는 경우에 참고로, 정렬 및 보상 요구에 대한 파라미터는, 상기 컨트롤을 사용하여 설정되어야한다 : (1) 야생형 세포를 해리 (예 1118 w) SYTOX 무첨가 초파리 midguts -이 매개 변수 (단계 4.4.1)를 설정하는 것은 자신의 형광도에 따라 세포를 정렬 방지; (2) SYTOX와 야생형 (예 : 1118 w) 세포 초파리 midguts 해리 추가 -이 매개 변수를 설정(단계 4.4.2) (죽은 세포는 높은자가 형광을 가지고 정렬 GFP 양성 세포를 오염시킬 수있는) 살아있는 세포에서 죽은 사람을 분리 할 수 있습니다; (3) ESG -Gal4의 midguts에서 세포를 해리, SYTOX없이 UAS-GFP 플라이 라인 -이 매개 변수를 설정한다 (단계 4.4.3)는 모든 GFP 양성 세포가 산포도 내에서 플롯되도록합니다. 이러한 매개 변수가 제대로 설정되지 않으면 정렬 된 세포 집단은 대부분 죽은 세포와 파편 (그림 5B, C), 많은 GFP 양성 세포 (그림 5D)를 놓친 것 등 GFP 양성 세포의 두 가지 피크를 포함합니다 히스토그램 플롯에서 볼 (그림 2E와 그림 3E)은 감지되지 않습니다. FACS 및 게이팅 매개 변수가 설정되고 나면, 장비는 교정 및 ESG의 -GAL4, UAS-GFP 플라이 라인에서 셀을 정렬 할 준비가되었습니다. 이러한 매개 변수가 저장 될 수 있기 때문에, 모든 미래는 ESG -GAL4, UAS-에서 ISCS와 EBS에 대한 세션을 정렬GFP 플라이 라인은 4.5 단계에서 시작할 수 있습니다. "순도"모드 선택 및 양방향 순도를 수행하는 정렬 정렬 세포의 수를 감소 있지만, 높은 엄격한 정렬한다 (단계 4.6 및도 4b, C)을 허용한다. 참고로, 죽은 세포를 라벨 대신 프로피 듐 요오드화 SYTOX 사용의 장점은 스필 오버를 쉽게 해결할 FITC (GFP) 채널로 둘러 유출 있다는 것이다.
ISCS 및 EBS에 대한 우리의 농축 방법은, 각각 상이한 GFP 발현 수준에 의한 세포 분류에 기초한다. 그것은 misdifferentiated 사채는 낮은 수준에서 GFP를 표현하고 ISCS로 오인 될 수있는 노화하는 동안 그 일 수있다. 정렬 된 세포는 크기와 입도에 차이가 있기 때문에, 우리는 우리의 정렬 전략 ISCS와 EBS에 대한 풍요롭게이 현재까지 가장 적합 함을 믿는다. 또한,이 ISC ID를 유지 중장 노화 세포는 핵이 작은 것으로 알려져있다 (15). 정렬 된 세포의 신원에 대한 자세한 선명도를 얻으려면 하나는 -GAL4는 ESG 전달하는 유전자 변형 플라이 라인, UAS-GFP 및 노치 신호 기자 유전자에서 세포를 정렬 할 수 있습니다. 노치 만 사채 12, 13에서 활성이있는 것으로 입증되었다 때문에, ISCS는 사채가 노치 기자에 긍정적 인 반면, 노치 기자에 대한 부정적인 것 젊은 중장입니다. 그러나시 노치 신호를 노화 중장 조직에서 비정상적된다. 따라서 설정이 실험이 실제로 더 ISCS 및 EB를 구별 할 신뢰할 수있는 오래된 중장에서 분리 여부를 테스트 할 필요가있다.
우리는 이미 젊은이와 노인 midguts에서 ISCS의 비교 전 사체 분석을 위해이 방법을 채택하고 노화 동안 차등 규제 요인을 확인했다 (unpub. observ.). 또한,이 방법과 ISCS 사채 간의 유전자 발현의 차이를 분석한다. 이러한 조사s는 세포 분화 과정을 들어갈 때 발생하는 초기 분자 변화에 대한 통찰력을 제공 할 것입니다. 또한, 노화 및 후속 분석 중 사채의 분리는 연령에 의한 misdifferentiation의 분자 변화를 밝혀 줄 것입니다. 또한,이 방법은 유전자 기능을 연구하기 위해 사용되는 다른 초파리 유전 도구와 결합 될 수있다. 요약하면,이 방법은 노화 중 분자의 특성과 ISCS 및 사채의 변화를 조사하기 위해 공정한 접근 방식을 제공합니다. 이 성체 줄기 및 전구 세포 메커니즘을 노화의 탐사를 촉진하는 유용한 도구입니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Forceps: Dumont, Inox Biologie #5 | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| SefarNitex 03-150um/38 (35 µm nylon mesh) | Sefar | 3A03-0150-102-00 | |
| Falcon 5 ml Round Bottom Polystyrene Test Tube with Cell Strainer Snap Cap | Corning | 352235 | |
| Polymax 1040 | Heidolph | 543-42210-00 | |
| Albumin from bovine serum (BSA) | Sigma | A4503-50G | |
| 0.5% Trypsin-EDTA | Invitrogen | 15400-054 | Trypsin obtained from a different company most likely has a different activity and the duration of the trypsin digest has to be adjusted accordingly. |
| SYTOX Blue Dead Cell Stain for flow cytometry | Life Technologies | S34857 | |
| RNAlater Stabilization Solution | Life Technologies | AM7023 | Other solutions, e.g., Trizol can be used for subsequent RNA isolation |
| FACSAria II cell sorter | Becton Dickinson | Turn on one hour prior to sorting |
References
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