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Biology

वयस्क से आंतों स्टेम सेल को अलग-थलग Published: December 16, 2014 doi: 10.3791/52223
Automatic Translation
*1, *2, 1
1Institut für Biochemie und Molekulare Biologie, Universität Ulm, 2Institut für Immunologie, Universitätsklinikum Ulm
* These authors contributed equally

Introduction

बढ़ती उम्र का एक अपरिहार्य परिणाम कार्यात्मक रहने के लिए ऊतकों और अंगों के घटते की क्षमता है। वयस्क स्टेम कोशिकाओं हालांकि उम्र जीवों के रूप में, स्टेम कोशिकाओं को भी उनके जैविक व्यवहार में गिरावट का अनुभव, ऊतक homeostasis और अंग की कार्यक्षमता को बनाए रखने के लिए आवश्यक हैं। यह एक ऐसी आंतों उपकला के रूप में एक उच्च कारोबार दर है कि ऊतकों, विशेष रूप से हानिकारक है। वृद्ध स्टेम कोशिकाओं की पहचान जीनोमिक क्षति, बिगड़ा मरम्मत तंत्र, बिगड़ा सेल चक्र विनियमन और (1-3 में समीक्षा) सामान्य स्टेम सेल व्यवहार को प्रभावित जो सभी के misregulated संकेत दे रास्ते में शामिल हैं। विशिष्ट संकेत दे रास्ते से छेड़छाड़ या विशिष्ट जीन नीचे दस्तक द्वारा, हम को विनियमित करने और सामान्य स्टेम सेल व्यवहार को बनाए रखने में उनकी भूमिकाओं के बारे में विस्तृत जानकारी प्राप्त की है। इन प्रयोगों के सबसे उम्मीदवार अणु दृष्टिकोण हैं के बाद से, हम दौरान स्टेम कोशिकाओं में पाए जाते हैं कि अंतर्जात आणविक परिवर्तन के बारे में बहुत कम जानकारी हैउम्र बढ़ने। इस सवाल का दृष्टिकोण करने के लिए एक तरह से पुराने स्टेम कोशिकाओं जिनकी अभिव्यक्ति प्रोफाइल उम्र बढ़ने के दौरान काफी बदलता अणुओं की पहचान करने के लिए बनाम जवान की transcriptome तुलना करने के लिए है। दुर्भाग्य से, जैविक और तकनीकी चुनौतियों का अब तक इस दृष्टिकोण के बारे में हमारी प्रगति में बाधा उत्पन्न कर दिया है।

ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर यह (4 में समीक्षा) phenotypes के उम्र बढ़ने के एक कम उम्र (लगभग 60-70 दिन) और प्रदर्शन के बाद से उम्र बढ़ने के अध्ययन करने के लिए एक अत्यधिक उपयुक्त मॉडल जीव है। इसके अलावा, ड्रोसोफिला में उम्र बढ़ने की प्रक्रिया के तापमान से तेजी से किया जा सकता है। 29 डिग्री सेल्सियस पर मक्खियों रखने करते हैं, आंतों के ऊतकों में एक वृद्ध फेनोटाइप पहले से ही 15 दिन 5 के बाद देखा जा सकता है। इसके अलावा, ड्रोसोफिला आनुवंशिक जोड़तोड़ की अधिकता के लिए उत्तरदायी है। विशेष रूप से, ड्रोसोफिला आद्यमध्यांत्र अलग संकेत दे रास्ते पर और पर्यावरणीय चुनौतियों के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए एक उत्कृष्ट मॉडल प्रणाली के रूप में उभरा है(6-10 में समीक्षा) उम्र बढ़ने के दौरान आंतों स्टेम कोशिकाओं (ISCs) के जीव विज्ञान। ड्रोसोफिला आंतों उपकला एक उच्च कारोबार दर है और पुरुषों के 11 में एक महीने के बारे में एक बार महिलाओं में हर दो हफ्ते में नए सिरे से और है। ड्रोसोफिला आद्यमध्यांत्र में रहने वाले ISCs विभाजित है और एक आत्म-नए सिरे से आईएससी और enteroblast (ईबी) 12,13 नामक एक बाद mitotic पूर्वज सेल का उत्पादन करने की क्षमता है। ईबी एक अवशोषण enterocyte या एक स्रावी enteroendocrine सेल में या तो differentiates। इस तिथि करने के लिए, स्पष्ट रूप से एक आईएससी लेबल कि केवल मार्कर संयोजन प्रतिलेखन कारक Escargot (ईएसजी) और पायदान ligand के डेल्टा (डीएल) 14 वर्ष की अभिव्यक्ति है। बहरहाल, यह केवल एक युवा और स्वस्थ आंत के लिए सच है। उम्र बढ़ने के दौरान, आद्यमध्यांत्र उपकला आईएससी प्रसार 15-17 में वृद्धि की विशेषता है। इसके अतिरिक्त, न्यायपालिका पायदान संकेतन आईएससी बेटी कोशिकाओं के भाग्य का निर्णय बाधितऔर ईबीएस 15 के misdifferentiation लाती है। इस जिससे एक वृद्ध आद्यमध्यांत्र में सदाशयी स्टेम कोशिकाओं की पहचान करने के लिए अपर्याप्त डेली अभिव्यक्ति प्रतिपादन, पायदान संकेतन और सह एक्सप्रेस ESG और डीएल के लिए सक्रिय हैं कि कोशिकाओं का एक संग्रह में यह परिणाम है। सच ISCs की पहचान करने में कठिनाई अब तक उम्र बढ़ने ISCs में अंतर्जात परिवर्तन की जांच करने की क्षमता बाधित कर दिया है।

हम ISCs और ईबीएस में GFP अभिव्यक्ति के स्तर स्वाभाविक अलग है और उम्र बढ़ने भर में विभिन्न बनी हुई है, जिसमें ESG -Gal4, यूएएस GFP ट्रांसजेनिक उड़ लाइन का लाभ लेने के द्वारा इस मुद्दे पर घेरने की कोशिश की है। एक समान दृष्टिकोण लार्वा neuroblasts और न्यूरॉन्स 18,19 के अलगाव के लिए वर्णित किया गया है। जवान और बूढ़े ESG -Gal4, यूएएस GFP मक्खियों के Midguts विच्छेदित और एकल कक्षों में अलग किया गया। कोशिकाओं तो प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल छँटाई (FACS) का उपयोग GFP पॉजिटिव कोशिकाओं के लिए हल किया गया। दिलचस्प है, हल GFP पॉजिटिव गGFP प्रतिदीप्ति तीव्रता के आधार पर दो अलग-अलग चोटियों में वितरित एल (GFP के उच्च और GFP कम)। इसके अलावा, यह भी सेल के आकार के साथ सहसंबद्ध दो चोटियों में GFP पॉजिटिव कोशिकाओं का वितरण: कम GFP तीव्रता का प्रदर्शन कोशिकाओं है कि छोटे थे और उच्च GFP तीव्रता के साथ कोशिकाओं जबकि कम बारीक बड़ा और अधिक बारीक थे। इस अवलोकन छोटे ISCs GFP तीव्रता के आधार पर FACS का उपयोग करने और उपयुक्त आगे तितर बितर (FSC) और पक्ष तितर बितर (एसएससी) सेटिंग्स चुनने बड़ा ईबीएस से प्रतिष्ठित किया जा सकता है कि सुझाव दिया। दिलचस्प, दो चोटियों साफ़ उम्र बढ़ने के दौरान अलग रहे। इसके अलावा, दो चोटियों के अनुपात उम्र बढ़ने midguts के aforementioned पहचान को दर्शाता है कि एक तरह से बदल दिया है: बड़े की संख्या, समय के साथ ईबीएस बढ़ जाती है misdifferentiated अर्थात् है। इन निष्कर्षों से हम उपयुक्त FACS के पैरामीटर सेटिंग्स का उपयोग GFP पॉजिटिव कोशिकाओं के लिए छँटाई द्वारा हम किसी भी समय बिंदु घ पर ISCs और ईबीएस के लिए समृद्ध कर सकते हैं निष्कर्ष है किuring उम्र बढ़ने।

सारांश में, हम किसी भी उम्र के ड्रोसोफिला midguts से, दो अलग अलग सेल आबादी, ISCs और ईबीएस के लिए समृद्ध और इस तरह के अगली पीढ़ी के अनुक्रमण के रूप में आगे के विश्लेषण के लिए इन कोशिकाओं को अलग करने के लिए सक्षम बनाता है शोधकर्ताओं कि एक FACS रणनीति परिचय। इस शक्तिशाली विधि स्टेम या पूर्वज कोशिकाओं के एक समृद्ध आबादी में उम्र बढ़ने के लिए निहित हैं कि अंतर्जात आणविक तंत्र के अध्ययन के लिए अनुमति देता है। इन अध्ययनों से प्राप्त आंकड़ों निस्संदेह प्रजातियों भर में उम्र बढ़ने में महत्वपूर्ण हैं कि संरक्षित अणुओं की पहचान की सुविधा होगी।

Protocol

नोट: इस प्रोटोकॉल एफ ए सी छँटाई द्वारा ISCs अलग करने के लिए पहली बार के लिए प्रयोग किया जाता है, तो निम्न नियंत्रण शुरू में ठीक से FACS के मानकों सेट करने के क्रम में अनिवार्य कर रहे हैं: जंगली प्रकार से (उदाहरण के लिए 1118 डब्ल्यू) अलग कोशिकाओं Sytox बिना ड्रोसोफिला midguts। जंगली प्रकार (उदाहरण के लिए 1118 डब्ल्यू) से अलग कोशिकाओं Sytox साथ ड्रोसोफिला midguts (3.6 कदम देखें)। Sytox बिना ESG -Gal4, यूएएस GFP के उड़ लाइन के midguts से अलग कोशिकाओं।

आंत विच्छेदन के लिए समाधान और व्यंजन के 1. तैयारी

  1. प्रत्येक युक्त 40 महिला ESG -Gal4, यूएएस GFP के उड़ लाइन से मक्खियों 4-6 शीशियों तैयार करें।
  2. एक 10x पीबीएस शेयर समाधान से 500 मिलीलीटर 1x पीबीएस (1.8 मिमी नाह 2 पीओ 4 · एच 2 हे, 8.4 मिमी ना 2 HPO 4 · 2 हे 2H, 175 मिमी NaCl, 7.4 पीएच को समायोजित) तैयार करते हैं।
  3. 3.5 तैयार करें1x पीबीएस में% agarose समाधान (100 मिलीलीटर 1X पीबीएस में 3.5 जी वैद्युतकणसंचलन ग्रेड agarose)। नीचे कवर करने के लिए पेट्री डिश में इस समाधान (व्यास 8.5 सेमी) गिरने से विच्छेदन प्लेटें तैयार करें। agarose परत विच्छेदन प्रक्रिया के दौरान संदंश के सुझावों को नुकसान पहुँचाए से रोकती है। जेल 4 डिग्री सेल्सियस पर विच्छेदन प्लेटों की दुकान जम गया है।
  4. विदारक से पहले 1x पीबीएस + 1% BSA के 300 मिलीलीटर ताजा तैयार है और बर्फ पर या 4 डिग्री सेल्सियस पर बोतल जगह है।
  5. सेंट्रीफ्यूज को चालू करें और इसे शांत करने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस करते हैं।
  6. किनारों smoothen करने के लिए दो गिलास पाश्चर pipettes के सुझावों लौ।
  7. स्वच्छ संदंश के दो जोड़े और 70% इथेनॉल के साथ एक रेजर ब्लेड।
  8. बर्फ पर विच्छेदित midguts इकट्ठा करने के लिए चार 1.5 मिलीग्राम से छह microcentrifuge ट्यूब रखें।

आद्यमध्यांत्र के जठरांत्र संबंधी मार्ग और विच्छेदन की 2. तैयारी

  1. एक मानक मक्खी बिस्तर पर सीओ 2 के साथ एक शीशी (40 मक्खियों) से मक्खियों anesthetize, सभी सिर काटनाएक रेजर ब्लेड का उपयोग और विच्छेदन पकवान के लिए उन्हें स्थानांतरित मक्खियों। Agarose जेल कवर करने के लिए विच्छेदन डिश में ठंड 1x पीबीएस / 1% BSA समाधान डालो। मक्खियों जारी करेगी।
  2. संदंश के अन्य जोड़ी के साथ छाती पकड़े, संदंश की एक जोड़ी के साथ मक्खी पेट ले लो। पेट से छाती अलग करें। पेट दिखाई जाएगी और अग्रांत्र / फसल सबसे अधिक संभावना अभी भी छाती से जोड़ा जाएगा।
  3. पेट को पकड़ो और छाती से बाहर खींच। पेट प्रकट करने के लिए, फसल हड़पने और थोड़ा पूर्व से दूर पेट से पेट खींच।
  4. एक संदंश की जोड़ी और संदंश के अन्य जोड़ी के साथ पूर्व से खुला छल्ली की बढ़त के साथ पेट के पीछे अंत पकड़ो। फैला हुआ पेट के ऊतकों को नष्ट करने के लिए नहीं सावधान रहना होगा। छल्ली तोड़ने के लिए और पूरे पेट उदर गुहा से बाहर निकाला गया है जब तक पीछे बहुत धीरे खींच जारी रखने के लिए दूर पीछे अंत खींचो। इसे फिट करने के लिए बहुत बड़ी है अगर फसल पहले से हटाया जा करना पड़ सकता हैशरीर गुहा के माध्यम से।
  5. नंगे आद्यमध्यांत्र छोड़ने अग्रांत्र, Malpighian नलिकाओं, पश्चांत्र और अंडाशय निकालें।
  6. एक गिलास पाश्चर विंदुक का प्रयोग, ठंड 1x पीबीएस / 1% BSA के समाधान युक्त एक 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब विच्छेदित midguts के बैच हस्तांतरण और बर्फ पर ट्यूब रहते हैं। नमूने 2 घंटे के भीतर कार्रवाई की जानी चाहिए।
  7. एक पूरे बैच के विच्छेदन के बाद पूरा हो गया, मलबे के ऊपर छोड़ दिया बंद धोने के लिए डबल आसुत जल के साथ विच्छेदन पकवान कुल्ला। Midguts के अगले बैच (दोहराने 2.1-2.7 कदम) विदारक शुरू करो। 2 घंटे के भीतर संभव के रूप में कई बैचों काटना, तो 3.1 कदम आगे बढ़ना।

एफ ए सी छँटाई के लिए फसल कोशिकाओं को आंत ऊतक 3. पाचन

  1. Midguts से 1x पीबीएस / 1% BSA समाधान निकालें और प्रत्येक नमूने के लिए 0.5% trypsin-EDTA समाधान के 500 μl जोड़ें।
  2. भंवर में अच्छी तरह से करने के लिए 20 सेकंड और 25-30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर 20 rpm पर घूर्णन / कोमल कमाल से नमूने सेते हैं।
  3. फिर से के बारे में 30 मिनट के बाद भंवर और ट्यूब की तह तक बरकरार आद्यमध्यांत्र ऊतक सिंक करते हैं। ध्यान से एक ताजा 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में जाल एक flamed कांच पाश्चर विंदुक के साथ निलंबन में हैं कि कोशिकाओं को हटाने और एक 35 माइक्रोन नायलॉन के माध्यम से उन्हें फिल्टर।
  4. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 100 XG पर कोशिकाओं नीचे स्पिन। डाइजेस्ट जब शुरू ध्यान से, एक सेल गोली पहली बार में दिखाई नहीं हो सकता लेकिन डाइजेस्ट की प्रगति के ऊतकों के रूप में दिखाई बन जाएगा।
    1. ध्यान से शेष बरकरार आद्यमध्यांत्र ऊतक युक्त मूल नमूना ट्यूब को वापस trypsin समाधान हस्तांतरण। गोली से भी कई कोशिकाओं में परिवर्तित करने से बचें।
    2. धीरे ठंड 1x पीबीएस / 1% BSA के 400 μl में सेल गोली फिर से निलंबित। बर्फ पर अलग कोशिकाओं से युक्त microcentrifuge ट्यूब रखें और हल्के से कोशिकाओं की रक्षा करने के लिए एल्यूमीनियम पन्नी के साथ ट्यूबों को कवर किया।
    3. फिर शेष बरकरार आद्यमध्यांत्र ऊतक युक्त trypsin समाधान भंवर और नमूने जगहकमरे के तापमान पर एक और 30 मिनट के लिए घुमाव पर।
  5. आद्यमध्यांत्र ऊतक के सभी पचा कर दिया गया है जब तक दोहराएँ 3.4.3 के लिए 3.3 कदम। एक microcentrifuge ट्यूब में सभी microcentrifuge ट्यूब से अलग कोशिकाओं का मिश्रण। यह 1.5 मिलीग्राम से अधिक हो सकता सभी संयुक्त सेल निलंबन की मात्रा के बाद से 3.4 के रूप में एक centrifugation कदम, आवश्यकता हो सकती है। बर्फ पर सेल निलंबन रखें और हल्के से कोशिकाओं की रक्षा।
  6. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 100 XG पर अलग कोशिकाओं नीचे स्पिन। ध्यान से microcentrifuge ट्यूब में 1x पीबीएस / 1% BSA के समाधान के लगभग 50-100 μl छोड़ने संभव के रूप में सतह पर तैरनेवाला के रूप में ज्यादा हटा दें। धीरे Sytox (: 20,000 1) युक्त पीबीएस / 1% बीएसए 1x 800 μl में अलग कोशिकाओं resuspend।
  7. एक सेल झरनी तस्वीर टोपी (35 माइक्रोन नायलॉन जाल) के माध्यम से कोशिकाओं को छान कर एक 5 मिलीलीटर दौर नीचे फाल्कन ट्यूब सेल निलंबन स्थानांतरण। हमेशा बर्फ पर सेल के नमूने रखने के लिए और प्रकाश से सुरक्षित। कोशिकाओं को अब करने के लिए तैयार कर रहे हैंहल किया।
  8. कोशिकाओं बाद में शाही सेना के अलगाव के लिए भंडारित किया जायेगा जिसमें प्रत्येक microcentrifuge ट्यूब में RNAlater समाधान के 600 μl पिपेट। अन्य बहाव के अनुप्रयोगों के लिए कोशिकाओं बाँझ पीबीएस में जैसे, एक अलग समाधान में एकत्र किया जा सकता है।

एफ ए सी छंटनी आंतों स्टेम कोशिकाओं को अलग करने के लिए 4.

  1. फ्लो साधन पर स्विच छँटाई करने के लिए कम से कम एक घंटा पहले। Fluidic प्रणाली हवा के बुलबुले के लिए स्वतंत्र है कि सुनिश्चित करें।
  2. म्यान द्रव धारा में कोशिकाओं इंजेक्षन करने के लिए 70 माइक्रोन नोक आकार चुनें।
  3. (70 माइक्रोन नोक का उपयोग करते समय 6-7), खाई मूल्य संदर्भ मूल्य से मेल खाती है, ताकि कोर द्रव धारा के आयाम को समायोजित करें। कोर द्रव धारा सॉर्ट करने के लिए शुरू करने से पहले को स्थिर करते हैं।
  4. शुरू में छँटाई के लिए मानकों की स्थापना करते समय इस आदेश का पालन करें:
    1. जंगली प्रकार हिम्मत से प्राप्त अलग कोशिकाओं लोड करें। सबसे पहले, FSC और एसएससी voltages के समायोजिततितर बितर साजिश के केंद्र में कोशिकाओं साजिश करने के लिए। सभी कोशिकाओं लघुगणक एक्स अक्ष पर 10 2 नीचे प्लॉट किए जाते हैं, इसलिए है कि दूसरा, FITC (GFP) के वोल्टेज समायोजित करें। FITC के पैरामीटर की स्थापना autofluorescence के लिए सीमा निर्धारित करता है।
    2. Sytox के साथ जंगली प्रकार हिम्मत से प्राप्त अलग कोशिकाओं जोड़ा लोड करें। FSC-एक तितर बितर साजिश बनाम प्रशांत ब्लू में मर चुका है, Sytox पॉजिटिव कोशिकाओं से प्रशांत ब्लू वोल्टेज मूल्य और गेट की पहचान करने के लिए और अलग रहने की कोशिकाओं को समायोजित करें।
    3. Sytox बिना ESG -Gal4, यूएएस GFP के उड़ लाइन से प्राप्त अलग कोशिकाओं लोड और सभी GFP पॉजिटिव कोशिकाओं तितर बितर साजिश के भीतर प्लॉट किए जाते हैं कि यह सुनिश्चित करने के लिए FITC वोल्टेज समायोजित करें।
  5. ESG -Gal4 से प्राप्त अलग कोशिकाओं लोड, Sytox साथ यूएएस GFP के उड़ लाइन जोड़ा। मृत, Sytox पॉजिटिव कोशिकाओं (गेट P1) से प्रशांत ब्लू वोल्टेज मूल्य और गेट की पहचान करने के लिए और अलग रहने की कोशिकाओं को समायोजित करें।
    1. एसएससी-एक सेट और FSC-एक फाटक GFP- की पहचान करने के लिएआकार और विघटन (गेट p2) द्वारा निर्धारित (हिस्टोग्राम भूखंड पर आधारित) सकारात्मक कोशिकाओं।
    2. उनके आकार (गेट पी 3) के आधार पर GFP पॉजिटिव सेल दोहरी पहचान करने और बाहर करने के लिए FSC-एच और FSC-डब्ल्यू गेट सेट करें।
    3. एसएससी-एच और की पहचान करने और उनके विघटन (गेट पी 4) के आधार पर GFP पॉजिटिव सेल दोहरी बाहर करने के लिए एसएससी-डब्ल्यू गेट सेट करें।
    4. GFP तीव्रता बनाम कोशिकाओं (गिनती) की संख्या से पता चलता है कि एक हिस्टोग्राम साजिश में GFP पॉजिटिव कोशिकाओं को दर्शाती गेट पी 4 का प्रयोग करें। GFP पॉजिटिव कोशिकाओं की दो अलग चोटियों दिखाई जाएगी। प्रत्येक शिखर (गेट्स पी -5 और P6) के लिए एक गेट बनाएँ। गेट पी -5 ISCs के लिए समृद्ध है और फाटक पी 6 में कोशिकाओं से अलग से हल किया जा सकता है कि सेल की आबादी शामिल है।
    5. एक समोच्च साजिश में पीछे-गेट दो अलग GFP पॉजिटिव सेल आबादी जीवित कोशिकाओं (गेट P1 के साथ तुलना) और सही आकार की कोशिकाओं (गेट p2 के साथ तुलना) होते हैं कि सत्यापित करने के लिए।
  6. 600 & # जिसमें एक 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में कोशिकाओं के आधार पर क्रमबद्ध181; RNAlater समाधान के एल। छँटाई एक कम प्रवाह की दर पर किया जाता है (अधिकतम। 2.0, 70 माइक्रोन नोक, 1000 की घटनाओं / सेकंड, 70 साई) और एक दो तरह पवित्रता प्रकार का काम करते हैं।
  7. छंटाई के बाद पूरा हो, तुरंत सॉर्ट किया गया कोशिकाओं संक्षिप्त भंवर और आरएनए अलगाव या अन्य बहाव के अनुप्रयोगों के साथ आगे बढ़ने जब तक बर्फ पर microcentrifuge ट्यूब रहते हैं।

Representative Results

160 और 200 midguts बीच, छँटाई एफ ए सी से 50,000-100,000 कोशिकाओं के बीच प्राप्त करने के लिए विच्छेदित किए जाने की जरूरत है। जाहिर है इस पूरी प्रक्रिया के कदम सबसे अधिक समय लेने है। चित्रा 1 ए में दिखाया कार्टून यहाँ प्रदान प्रोटोकॉल में विस्तार से वर्णन किया गया हैं जो पेट विच्छेदन के प्रमुख कदम दिखाता है। इस प्रक्रिया को व्यक्तिगत रूप से संशोधित किया जा सकता है। एक विच्छेदित, पूरे जठरांत्र पथ चित्रा 1 बी में दिखाया गया है।

आद्यमध्यांत्र ऊतक के सभी पचा किया गया है, तुरंत एफ ए सी छँटाई के साथ जारी है। प्रोटोकॉल में वर्णित gating रणनीति के बाद युवा (चित्रा 2) से ईबीएस ISCs के लिए और के लिए समृद्ध एक सेल की आबादी का सफल पहचान और छँटाई के लिए और पुराने midguts (चित्रा 3) से अनुमति देता है। P1 के गेट केवल स्वस्थ जीवित कोशिकाओं और बाहर गेट मृत कोशिकाओं को शामिल करने के लिए निर्धारित है। लघुगणक Y-कुल्हाड़ी पर 10 3 से ऊपर की साजिश है कि प्रकोष्ठोंप्रशांत ब्लू चैनल का उपयोग किया जाता है, जब मृत कोशिकाओं के रूप में परिभाषित कर रहे हैं। इसलिए अधिकतर मलबा हैं और है कि एक्स-अक्ष (FSC-ए) पर 40 से नीचे साजिश डॉट्स भी (2A चित्रा) बाहर रखा गया है। FSC-ए बनाम एसएससी-ए के तितर बितर साजिश में कोशिकाओं को उनके आकार और विघटन के आधार पर वितरित कर रहे हैं। Photomultiplier ट्यूब (पीएमटी) वोल्टेज का समायोजन करके चित्रा 2B में दिखाया गया के रूप में एक इष्टतम समाधान के लिए, कोशिकाओं को तितर बितर साजिश में रखा जाता है। तितर बितर भूखंडों FSC-डब्ल्यू बनाम FSC-एच और एसएससी-डब्ल्यू बनाम एसएससी-एच में एकल कक्षों विघटन (चित्रा 2 डी) पर (चित्रा -2) आकार के आधार पर समुच्चय और दोहरी से अलग कर दिया और आधारित हैं। एक हिस्टोग्राम साजिश, GFP नकारात्मक, GFP के कम (गेट पी -5) के विशिष्ट जुदाई और GFP उच्च (गेट पी 6) कोशिकाओं में गेट पी 4 में शामिल कोशिकाओं का चित्रण करते समय दिखाई देता है (चित्रा 2 ई) है। कम GFP तीव्रता का प्रदर्शन कोशिकाओं छोटे और कम बारीक कर रहे हैं और ISCs प्रतिनिधित्व करते हैं। उच्च GFP के पूर्णांक प्रदर्शन प्रकोष्ठोंensity बड़ा और अधिक बारीक कर रहे हैं और ईबीएस प्रतिनिधित्व करते हैं। प्रत्येक GFP पॉजिटिव आबादी की कोशिकाओं की शाही सेना से संश्लेषित सीडीएनए पर DL के लिए ट्रांसक्रिपटेस (आरटी) -PCR रिवर्स (गेट्स p5, पी 6) डेली संकेत बड़ा, GFP के उच्च तुलना में छोटे, GFP के कम कोशिकाओं में वास्तव में मजबूत है, पता चला है कि कोशिकाओं (चित्रा 2H)। कोशिकाओं तो backgated और GFP कम (गेट पी -5) और GFP उच्च (गेट पी 6) कोशिकाओं के आकार और विघटन (चित्रा 2 एफ) में मतभेद है और चित्रा (2 जी) अभी भी जीवित हैं कि पुष्टि करने के लिए समोच्च भूखंडों में चित्रित किया गया। FITC (GFP) के चैनल ठीक से प्रोटोकॉल में वर्णित नियंत्रण का उपयोग कर calibrated किया गया है अगर ध्यान से, GFP पॉजिटिव कोशिकाओं की दो चोटियों (GFP कम और GFP उच्च) ही अच्छी तरह से प्रतिष्ठित किया जा सकता है।

पुराने हिम्मत (चित्रा 3) से ली गई ISCs छँटाई जब एक ही gating रणनीति का प्रयोग किया गया था। तितर बितर भूखंडों (Figurई 3 ए-डी), हिस्टोग्राम (चित्रा 3E) और समोच्च भूखंडों (चित्रा 3F, छ) चित्रा 2 में दिखाया गया है वालों के अनुरूप हैं। जैसा कि ऊपर उल्लेख किया है, इसलिए पुराने midguts और में ISCs की पहचान करने के लिए कोई सदाशयी मार्कर नहीं है कोई आरटी पीसीआर डेटा यहां प्रस्तुत किया है। हालांकि, यहां साज़िश का अवलोकन GFP के कम (गेट पी -5) या GFP उच्च (गेट पी 6) कोशिकाओं से युक्त दो चोटियों साफ़ उम्र बढ़ने के दौरान अलग रहते हैं। इसके अलावा, GFP के उच्च (गेट पी 6) शिखर में कोशिकाओं की संख्या में काफी स्पष्ट रूप से उम्र के साथ misdifferentiated ईबीएस के नाम से जाना जाता संचय emulates है, जो उम्र बढ़ने के दौरान बढ़ जाती है। दो सेल आबादी के अनुपात में परिवर्तन भी बिखराव भूखंडों में देखा (2A चित्रा-डी के साथ चित्रा 3 ए-डी तुलना) और समोच्च भूखंडों में (चित्रा 2 एफ, जी के साथ चित्रा 3F, जी तुलना) किया जा सकता है। हम निष्कर्ष निकाल इन निष्कर्षों से कि GFP के लिए छँटाई द्वाराFACS का उपयोग कर -positive कोशिकाओं हम जवान और बूढ़े midguts में ISCs और ईबीएस के लिए समृद्ध कर सकते हैं।

पृथक ISCs और ईबीएस की पवित्रता को मान्य करने के लिए, एक के बाद क्रमबद्ध विश्लेषण (चित्रा 4) का प्रदर्शन किया गया था। पोस्ट हल ISCs और ईबीएस (चित्रा 4 बी, सी) के हिस्टोग्राम भूखंडों 95% और 98% के बीच purities को दर्शाती है।

के रूप में ऊपर वर्णित FACS के मानकों की स्थापना के पदानुक्रम का कड़ाई से पालन किया जाता है, दो अलग अलग सेल आबादी (GFP, कम छोटे और GFP उच्च, बड़ा) पहले से ही एक तितर बितर साजिश FSC-ए (चित्रा 5 ए) बनाम GFP में प्रतिष्ठित किया जा सकता है। इस पदानुक्रम (चित्रा 5 ब-डी) अवहेलना है अगर इन दो सेल आबादी प्रतिष्ठित नहीं किया जा सकता है।

चित्रा 1
चित्रा 1: (ए) disse के प्रमुख कदम का एक योजनाबद्धमक्खी आंत cting। सबसे पहले, सिर पेट बेनकाब करने के लिए छाती और पेट की जुदाई के बाद (पंखों को हटाने के वैकल्पिक है) निकाल दिया जाता है। पेट बाद में निम्न चरणों में शरीर गुहा से मुक्त कर दिया गया है। गहरे लाल तीर खींच दिशा निरूपित जबकि काला तीर, विच्छेदन की प्रगति दिखा। पिछले छवि में लाल लाइनों आद्यमध्यांत्र की पूर्वकाल और कूल्हों की सीमाओं से संकेत मिलता है। (बी) वयस्क मक्खी आंत का एक प्रकाश माइक्रोस्कोप छवि। मुख्य क्षेत्रों और संरचनात्मक सुविधाओं चिह्नित कर रहे हैं। लाल लाइनों आद्यमध्यांत्र की सीमाओं निशान।

चित्रा 2
चित्रा 2:। ISCs का प्रतिनिधित्व एफ ए सी की पहचान करने और युवा (7 दिन) midguts से ISCs और ईबीएस अलग-थलग करने की रणनीति छँटाई बेहतर दृश्य के लिए, कोशिकाओं को लाल रंग में डाला जाता है और ईबीएस का प्रतिनिधित्व कोशिकाओं डाला जाता हैतितर बितर भूखंडों (ई) में नीले और समोच्च भूखंडों (एफ, जी)। में (क) में P1 के गेट लघुगणक Y अक्ष पर 10 3 से ऊपर साजिश रची मृत, Sytox पॉजिटिव कोशिकाओं को बाहर करने के लिए निर्धारित है। FSC-ए की दहलीज भी मृत कोशिकाओं और मलबे को बाहर करने के 40 में स्थापित किया जाएगा। (बी) कोशिकाओं के आकार और विघटन (गेट p2) के अनुसार कोशिकाओं का चयन करने के FSC-ए और एसएससी-A के लिए gated थे। हिस्टोग्राम साजिश (ई) एसएससी-एक तितर बितर साजिश (बी) बनाम FSC-ए में GFP पॉजिटिव कोशिकाओं की पहचान करने के लिए समानांतर में इस्तेमाल किया गया था। (सी, डी) FSC-डब्ल्यू बनाम तितर बितर भूखंडों FSC-एच और एसएससी-डब्ल्यू बनाम एसएससी-एच समुच्चय और दोहरी को हटाने और singlets के लिए (डी सी में गेट पी 3 और फाटक पी 4) का चयन करने के लिए काम करते हैं। (ई) हिस्टोग्राम साजिश कोशिकाओं और उनके GFP तीव्रता की संख्या से पता चलता है। दो चोटियों, GFP के कम (गेट पी -5) और GFP उच्च (गेट पी 6)। (एफ, जी) कोशिकाओं है कि दो अलग GFP पॉजिटिव सेल populat सत्यापित करने के लिए एक समोच्च साजिश में वापस-गेटेड गया प्रतिष्ठित किया जा सकतापहली शिखर (गेट पी -5) में मौजूद कोशिकाओं से अलग शाही सेना से संश्लेषित सीडीएनए पर DL के लिए रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस (आरटी) -PCR और में आयनों सही आकार (एफ) के हैं और उसमें जीवित कोशिकाओं (जी)। (एच) क्रमश: दूसरे शिखर (गेट पी 6),। अधिक डेली अभिव्यक्ति गेट पी 6 बनाम फाटक पी -5 में मौजूद कोशिकाओं में पाया जा सकता है। ट्यूबिलिन एक लोडिंग नियंत्रण के रूप में सेवा की। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 3
चित्रा 3: एफ ए सी की पहचान करने और (60 दिन) पुराने midguts से ISCs और ईबीएस अलग-थलग करने की रणनीति छँटाई बेहतर दृश्य के लिए, ISCs का प्रतिनिधित्व कोशिकाओं लाल रंग में डाला जाता है और ईबीएस का प्रतिनिधित्व कोशिकाओं बिखराव भूखंडों (ई) में नीले रंग में डाला जाता है और में। समोच्च भूखंडों (एफ, जी)। (ए) P1 के गेट लघुगणक Y अक्ष पर 10 3 से ऊपर साजिश रची मृत, Sytox पॉजिटिव कोशिकाओं को बाहर करने के लिए निर्धारित है। FSC-ए की दहलीज भी मृत कोशिकाओं और मलबे को बाहर करने के 40 में स्थापित किया जाएगा। ध्यान से, बड़ा GFP पॉजिटिव कोशिकाओं में उम्र पर निर्भर वृद्धि पहले से ही इस साजिश में स्पष्ट है। (बी) कोशिकाओं के आकार और विघटन (गेट p2) के अनुसार कोशिकाओं का चयन करने के FSC-ए और एसएससी-A के लिए gated थे। हिस्टोग्राम साजिश (ई) एसएससी-एक तितर बितर साजिश (बी) बनाम FSC-ए में GFP पॉजिटिव कोशिकाओं की पहचान करने के लिए समानांतर में इस्तेमाल किया गया था। (सी, डी) FSC-डब्ल्यू बनाम तितर बितर भूखंडों FSC-एच और एसएससी-डब्ल्यू बनाम एसएससी-एच समुच्चय और दोहरी को हटाने और singlets के लिए (डी सी में गेट पी 3 और फाटक पी 4) का चयन करने के लिए काम करते हैं। (ई) हिस्टोग्राम साजिश कोशिकाओं और उनके GFP तीव्रता की संख्या से पता चलता है। दो चोटियों, GFP के कम (गेट पी -5) और GFP उच्च (गेट पी 6) प्रतिष्ठित किया जा सकता है। ध्यान से, बड़ा कोशिकाओं से युक्त सेल की आबादी GFP के उच्च मैं बढ़ गया हैउम्र बढ़ने के दौरान n संख्या। (एफ, जी) प्रकोष्ठों। दो अलग GFP पॉजिटिव सेल आबादी सही आकार (एफ) के हैं और जीवित कोशिकाओं (जी) होते हैं कि सत्यापित करने के लिए एक समोच्च साजिश में वापस-गेटेड थे करने के लिए यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए।

चित्रा 4
चित्रा 4:। एक के बाद क्रमबद्ध विश्लेषण पृथक ISCs और ईबीएस की शुद्धता निर्धारित करने के लिए प्रदर्शन किया था (ए) GFP पॉजिटिव कोशिकाओं (7 दिन) जवान और बूढ़े से (60 दिन) midguts एफ ए सी हल किया गया और हिस्टोग्राम भूखंडों उनके वितरण दिखाने GFP तीव्रता के आधार पर दो चोटियों में। (बी) के पद प्रकार का विश्लेषण> 97% है, जो जवान और बूढ़े midguts से पृथक ISCs की पवित्रता को दर्शाता है। (सी) हल ई के पद प्रकार का विश्लेषणजवान और बूढ़े midguts से बी एस> 95% की पवित्रता को दर्शाता है। मामूली दोष प्रतिदीप्ति शमन या कोशिकाओं को फिर से छंटाई की वजह से यंत्रवत् क्षतिग्रस्त GFP व्यक्त कोशिकाओं से हो सकता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्रा 5: FACS के मापदंडों ठीक से स्थापित नहीं कर रहे थे जब देखा जाता है जो suboptimal FACS के डेटा, बताते हैं कि बिखराव भूखंडों के उदाहरण सभी कोशिकाओं (ए) प्रतिनिधि FACS के प्रोफाइल FACS के मापदंडों के प्रोटोकॉल में वर्णित नियंत्रण के आधार पर ठीक से सेट किया गया है।। ISCs युक्त सेल की आबादी लाल रंग में परिक्रमा कर रहा है और ईबीएस युक्त सेल की आबादी नीले रंग में परिक्रमा कर रहा है। हरे रंग में परिक्रमा की कोशिकाओं की तुलना में एक मजबूत autofluorescence है कि मृत कोशिकाओं रहे हैंलघुगणक Y अक्ष पर 10 3 नीचे प्लॉट किए जाते हैं, जो जीवित कोशिकाओं,। (बी) तितर बितर साजिश FACS के साधन calibrated नहीं किया गया था जब प्राप्त एक विशिष्ट परिणाम दर्शाया गया है। कोई GFP पॉजिटिव कोशिकाओं का पता चला रहे हैं। FSC ठीक से स्थापित नहीं किया जाता है, अलग GFP पॉजिटिव सेल आबादी का पता नहीं कर रहे हैं (सी)। (डी) FITC (GFP) के चैनल सही ढंग से समायोजित नहीं है, तो GFP- के बहुमत सकारात्मक कोशिकाओं तितर बितर साजिश में बल्कि साजिश के ऊपरी किनारे के साथ साजिश रची नहीं कर रहे हैं हल किया जाना। इसके अलावा, यहाँ दिखाया साजिश में, autofluorescence के लिए सीमा कोशिकाओं लघुगणक Y अक्ष पर साजिश के ऊपर 10 2 वास्तव में autofluorescent हैं और GFP पॉजिटिव कोशिकाओं के रूप में गलत हो सकता है कि इसलिए, समायोजित नहीं किया गया था।

Discussion

प्रस्तुत प्रोटोकॉल बाद में इस तरह के अगली पीढ़ी के अनुक्रमण के रूप में आगे आणविक विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, जो जवान और बूढ़े वयस्क ड्रोसोफिला midguts से ISCs अलग करने के लिए एक विधि का वर्णन है। ESG -Gal4 से GFP पॉजिटिव सेल की आबादी का एफ ए सी छँटाई, यूएएस GFP के उड़ लाइन पहले से ही कई समूहों 21,22 से हासिल किया गया है। हालांकि, अब तक GFP पॉजिटिव कोशिकाओं की दो अलग चोटियों की उपस्थिति या तो अनदेखी की या इसका सही मूल्यांकन नहीं किया गया है। हम इस जुदाई न केवल लेकिन यह भी GFP पॉजिटिव कोशिकाओं की दो चोटियों उम्र बढ़ने के दौरान अलग अलग रहते हैं, सेल प्रकार (ISCs और ईबीएस) की दो अलग अलग आबादी का प्रतिनिधित्व करता है कि पता चलता है। इस अवलोकन अत्यधिक प्रासंगिक और उम्र बढ़ने के दौरान स्टेम या पूर्वज कोशिकाओं का अध्ययन करने में रुचि शोधकर्ताओं के लिए मूल्यवान है। पुराने midguts से ISCs के अलगाव एक वृद्ध आद्यमध्यांत्र में ISCs की पहचान करने के लिए कोई आणविक मार्कर संयोजन तथ्य है कि वहाँ के द्वारा बाधा उत्पन्न की गई है। केवल मार्कर कि यूISCs आद्यमध्यांत्र 12,13 में केवल कोशिकाओं को विभाजित कर रहे हैं के बाद से nambiguously एक पुराने आद्यमध्यांत्र में ISCs पहचानती है phospho-histone3 (PH3), है। हालांकि, PH3 किसी भी समय बिंदु पर स्टेम कोशिकाओं को विभाजित करने की संख्या के बाद के विश्लेषण के लिए ISCs की एक सभ्य राशि प्राप्त करने के लिए बहुत कम है क्योंकि ISCs अलग करने के लिए एक अनुपयुक्त मार्कर है। मक्खी लाइन ESG -Gal4, यूएएस GFP के आईएससी समारोह, रखरखाव और भेदभाव जो अध्ययन शोधकर्ताओं द्वारा इस्तेमाल सबसे आम उड़ लाइन है। ISCs homeostasis के आणविक विनियमन पर हमारे वर्तमान ज्ञान विशिष्ट अणुओं और संकेत रास्ते चालाकी से किया गया है, जिसमें अध्ययन के आधार पर किया जाता है (7 में समीक्षा)। इसलिए, हम अभी भी उम्र बढ़ने के दौरान होती है कि अंतर्जात आणविक परिवर्तन के बारे में ज्ञान की कमी है। इस के साथ साथ वर्णित विधि इस अंतर को बंद कर देता है और ISCs उम्र बढ़ने के दौरान किसी भी समय बिंदु पर वयस्क midguts से उनके आकार, विघटन और GFP तीव्रता के आधार पर अलग किया जा सकता है कि इस तथ्य पर आधारित है।

जबकिस्थापित करने और हम निम्नलिखित कदम एक विश्वसनीय परिणाम के लिए महत्वपूर्ण हो पाया है कि इस विधि के अनुकूलन। लगभग 200 हिम्मत एफ ए सी छँटाई के लिए ISCs का एक अच्छा राशि प्राप्त करने के क्रम में विच्छेदित किए जाने की जरूरत है। विच्छेदन की गति महत्वपूर्ण है और व्यक्ति के व्यवहार पर निर्भर करता है। एक प्रशिक्षित व्यक्ति 20-30 मिनट के भीतर 40 हिम्मत काटना कर सकते हैं। GFP के भी ESG -Gal4 में Malpighian नलिकाओं में व्यक्त किया जाता है, यूएएस GFP के उड़ लाइन, यह पूरी तरह से आद्यमध्यांत्र से Malpighian नलिकाओं को दूर करने के लिए आवश्यक है। विच्छेदित midguts ऊतक गिरावट से बचने और ऊतकों में RNase गतिविधि को कम करने के लिए एक शांत वातावरण में रखा जाना चाहिए। इसलिए, विच्छेदित midguts 20-30 मिनट की एक अधिकतम के बाद ठंड 1x पीबीएस / 1% BSA के समाधान युक्त microcentrifuge ट्यूबों में विदारक पकवान से स्थानांतरित और बर्फ पर रखा जाना चाहिए। हालांकि, विच्छेदित midguts trypsin के साथ ऊतक हदबंदी शुरू करने से पहले अधिक से अधिक 2 घंटे के लिए बर्फ पर नहीं छोड़ा जाना चाहिए। सबसे efficiईएनटी दृष्टिकोण तो, इन दो घंटा के भीतर संभव के रूप में मक्खियों के रूप में कई बैचों काटना ट्रिप्सिन इन बैचों के लिए पचाने में शुरू करने के लिए है। अधिक midguts की जरूरत है, वे ट्रिप्सिन डाइजेस्ट के ऊष्मायन समय के दौरान विच्छेदित किया जा सकता है।

ट्रिप्सिन एक बहुत शक्तिशाली एंजाइम है और कोशिकाओं पर हानिकारक प्रभाव हो सकता है, हम अभी भी पर्याप्त रहते हैं, बाद में एफ ए सी छँटाई के लिए स्वस्थ कोशिकाओं को प्राप्त किया। बरकरार कोशिकाओं के अलगाव के लिए अनुमति देता है कि हमारी प्रक्रिया का महत्वपूर्ण कदम अलग कोशिकाओं trypsin समाधान के लिए हर 30 मिनट से हटा दिया जाता है। विच्छेदित midguts कमरे के तापमान पर समाधान युक्त एक ट्रिप्सिन में 2 आधा घंटा के लिए incubated रहे हैं, हम मर चुका है, Sytox पॉजिटिव कोशिकाओं में एक 20-30% वृद्धि मनाया। यह उपयोग हम trypsin समाधान EDTA जिसमें बताया जाना चाहिए। EDTA के उपस्थिति शायद बाह्य मैट्रिक्स अणुओं के समुचित कार्य के लिए आवश्यक कैल्शियम और मैग्नीशियम आयनों chelating द्वारा ऊतक विघटन की सुविधा। जवान और बूढ़े हिम्मत से सबसे महत्वपूर्ण कदमों को सफलतापूर्वक क्रमबद्ध ISCs FACS और वर्णित नियंत्रण का उपयोग कर और एक विशिष्ट छँटाई पदानुक्रम निम्नलिखित gating के मापदंडों के उचित प्रारंभिक सेटिंग कर रहे हैं। हम एक ARIA द्वितीय फ्लो cytometer (FACSDiva सॉफ्टवेयर) पर छँटाई एफ ए सी प्रदर्शन किया। यह साधन पूर्व लेज़रों गर्म करने के लिए छँटाई करने के लिए कम से कम एक घंटा चालू है कि महत्वपूर्ण है। ISCs की एफ ए सी छँटाई पहली बार के लिए किया जाता है, जब ध्यान से, छँटाई के लिए और मुआवजे की जरूरत के लिए मानकों के aforementioned नियंत्रण का उपयोग कर स्थापित किया जाना है: (1) जंगली प्रकार से कोशिकाओं को अलग (उदाहरण के लिए 1118 डब्ल्यू) Sytox के अलावा बिना ड्रोसोफिला midguts - इस पैरामीटर (चरण 4.4.1) की स्थापना उनकी autofluorescence के आधार पर कोशिकाओं छँटाई रोकता है; (2) Sytox के साथ जंगली प्रकार से (उदाहरण के लिए 1118 डब्ल्यू) कोशिकाओं ड्रोसोफिला midguts अलग जोड़ - इस पैरामीटर सेटिंग(चरण 4.4.2) (मृत कोशिकाओं को एक उच्च autofluorescence है और हल GFP पॉजिटिव कोशिकाओं को दूषित कर सकते हैं) जीवित कोशिकाओं से मृत को अलग करने की अनुमति देता है; (3) ESG -Gal4 की midguts से कोशिकाओं को अलग, Sytox बिना यूएएस GFP के उड़ लाइन - इस पैरामीटर सेटिंग (चरण 4.4.3) सभी GFP पॉजिटिव कोशिकाओं तितर बितर साजिश के भीतर प्लॉट किए जाते हैं कि यह सुनिश्चित करता है। इन मापदंडों ठीक से स्थापित नहीं कर रहे हैं, हल सेल की आबादी सबसे अधिक संभावना मृत कोशिकाओं और मलबे (चित्रा 5 ब, सी), कई GFP पॉजिटिव कोशिकाओं (चित्रा 5D) याद किया जाएगा और के रूप में GFP पॉजिटिव कोशिकाओं के लिए दो अलग-अलग चोटियों में शामिल होंगे हिस्टोग्राम साजिश में देखा (चित्रा 2 ई और चित्रा 3E) का पता नहीं किया जाएगा। FACS और gating मानकों सेट किया गया है एक बार, उपकरण calibrated और ईएसजी -GAL4, यूएएस GFP के उड़ लाइन से कोशिकाओं को सॉर्ट करने के लिए तैयार कर रहा है। इन मानकों को बचाया जा सकता है, भविष्य की सभी ESG -GAL4, UAS- से ISCs और ईबीएस के लिए सत्रों छँटाईGFP के उड़ लाइन चरण में 4.5 से शुरू कर सकते हैं। "पवित्रता" मोड चुनने और एक दो तरह पवित्रता प्रदर्शन कर क्रमबद्ध सॉर्ट किया गया कोशिकाओं की संख्या कम हो जाती है, यह एक उच्च छँटाई तंगी (चरण 4.6 और 4B चित्रा, सी) के लिए अनुमति देता है। ध्यान से, मृत कोशिकाओं को लेबल करने के बजाय propidium आयोडाइड के Sytox उपयोग करने का लाभ केवल बाहर छलकते के लिए क्षतिपूर्ति करने के लिए यह आसान बनाता है जो FITC (GFP) के चैनल में एक कम बाहर छलकते है कि वहाँ है।

ISCs और ईबीएस के लिए समृद्ध बनाने का हमारा तरीका है, क्रमशः, अलग GFP अभिव्यक्ति के स्तर के अनुसार कोशिकाओं छँटाई पर आधारित है। यह misdifferentiated ईबीएस भी एक निचले स्तर पर व्यक्त GFP और ISCs के रूप में गलत हो सकता है उम्र बढ़ने के दौरान हो सकती है। छाँटे गए कोशिकाओं को भी आकार और विघटन में अलग हालांकि, बाद से, हम अपने छँटाई रणनीति ISCs और ईबीएस के लिए समृद्ध करने के लिए इस तिथि करने के लिए सबसे उपयुक्त है कि विश्वास करते हैं। इसके अलावा, यह आईएससी पहचान को बनाए रखना एक उम्र बढ़ने आद्यमध्यांत्र में कोशिकाओं के एक छोटे नाभिक है कि जाना जाता है 15। सॉर्ट किया गया कोशिकाओं की पहचान के बारे में अधिक स्पष्टता प्राप्त करने के लिए, एक -GAL4 ESG किया जाता है कि एक ट्रांसजेनिक उड़ लाइन, यूएएस GFP और एक पायदान संकेतन संवाददाता transgene से कोशिकाओं को सॉर्ट सकता है। पायदान केवल ईबीएस 12,13 में सक्रिय होने के लिए दिखाया गया है के बाद से, ISCs ईबीएस पायदान रिपोर्टर के लिए सकारात्मक होगा, जबकि पायदान रिपोर्टर के लिए नकारात्मक होगा एक युवा आद्यमध्यांत्र से अलग। हालांकि, के दौरान पायदान संकेतन उम्र बढ़ने आद्यमध्यांत्र ऊतक में न्यायपालिका हो जाता है। इसलिए, यह स्थापित किया है कि इस प्रयोगात्मक वास्तव में अधिक ISCs और ईबीएस के बीच भेद करने के लिए विश्वसनीय एक पुराने आद्यमध्यांत्र से अलग है कि क्या परीक्षण किया जाना चाहिए।

हम पहले से ही जवान और बूढ़े midguts से ISCs के तुलनात्मक transcriptome विश्लेषण के लिए इस दृष्टिकोण कार्यरत हैं और उम्र बढ़ने के दौरान विभिन्न विनियमित रहे हैं कि कारकों में से एक नंबर की पहचान की है (unpub। Observ।)। साथ ही, इस विधि ISCs और ईबीएस के बीच जीन की अभिव्यक्ति में मतभेद का विश्लेषण करने के लिए अनुमति देता है। ऐसी जांचएक सेल भेदभाव प्रक्रिया में प्रवेश करती है के रूप में होती है कि प्रारंभिक आणविक परिवर्तन में अंतर्दृष्टि प्रदान करेगा। इसके अलावा, उम्र बढ़ने और बाद के विश्लेषण के दौरान ईबीएस के अलगाव उम्र प्रेरित misdifferentiation की आणविक परिवर्तन पर प्रकाश डाला जाएगा। इसके अलावा, इस विधि जीन समारोह का अध्ययन करने के लिए ड्रोसोफिला में इस्तेमाल अन्य आनुवंशिक उपकरणों के साथ जोड़ा जा सकता है। सारांश में, इस विधि उम्र बढ़ने के दौरान आणविक विशेषताओं और ISCs और ईबीएस के परिवर्तन की जांच के लिए एक निष्पक्ष दृष्टिकोण प्रदान करता है। इस वयस्क स्टेम और पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं में तंत्र उम्र बढ़ने के अन्वेषण की सुविधा होगी कि एक महत्वपूर्ण उपकरण है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Forceps: Dumont, Inox Biologie #5 Fine Science Tools 11252-20
SefarNitex 03-150um/38 (35 µm nylon mesh) Sefar 3A03-0150-102-00
Falcon 5 ml Round Bottom Polystyrene Test Tube with Cell Strainer Snap Cap Corning 352235
Polymax 1040 Heidolph 543-42210-00
Albumin from bovine serum (BSA) Sigma A4503-50G
0.5% Trypsin-EDTA Invitrogen 15400-054 Trypsin obtained from a different company most likely has a different activity and the duration of the trypsin digest has to be adjusted accordingly.
SYTOX Blue Dead Cell Stain for flow cytometry Life Technologies S34857
RNAlater Stabilization Solution Life Technologies AM7023 Other solutions, e.g., Trizol can be used for subsequent RNA isolation
FACSAria II cell sorter Becton Dickinson Turn on one hour prior to sorting

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References

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कोशिका जीव विज्ञान अंक 94 आंतों स्टेम कोशिकाओं को स्टेम उम्र बढ़ने आद्यमध्यांत्र विच्छेदन transcriptome प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल छंटनी
वयस्क से आंतों स्टेम सेल को अलग-थलग<em&gt; ड्रोसोफिला</em&gt; FACS द्वारा Midguts उम्र बढ़ने के दौरान स्टेम सेल व्यवहार का अध्ययन करने के लिए
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Tauc, H. M., Tasdogan, A., Pandur,… More

Tauc, H. M., Tasdogan, A., Pandur, P. Isolating Intestinal Stem Cells from Adult Drosophila Midguts by FACS to Study Stem Cell Behavior During Aging. J. Vis. Exp. (94), e52223, doi:10.3791/52223 (2014).

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