Understanding the endogenous molecular changes in adult stem cells during aging requires isolating the cells of interest. The method described here presents a simple and robust approach to enrich for and isolate Drosophila intestinal stem cells and the enteroblast progenitor cells by FACS at any time point during aging.
Aging tissue is characterized by a continuous decline in functional ability. Adult stem cells are crucial in maintaining tissue homeostasis particularly in tissues that have a high turnover rate such as the intestinal epithelium. However, adult stem cells are also subject to aging processes and the concomitant decline in function. The Drosophila midgut has emerged as an ideal model system to study molecular mechanisms that interfere with the intestinal stem cells’ (ISCs) ability to function in tissue homeostasis. Although adult ISCs can be easily identified and isolated from midguts of young flies, it has been a major challenge to study endogenous molecular changes of ISCs during aging. This is due to the lack of a combination of molecular markers suitable to isolate ISCs from aged intestines. Here we propose a method that allows for successful dissociation of midgut tissue into living cells that can subsequently be separated into distinct populations by FACS. By using dissociated cells from the esg-Gal4, UAS-GFP fly line, in which both ISCs and the enteroblast (EB) progenitor cells express GFP, two populations of cells are distinguished based on different GFP intensities. These differences in GFP expression correlate with differences in cell size and granularity and represent enriched populations of ISCs and EBs. Intriguingly, the two GFP-positive cell populations remain distinctly separated during aging, presenting a novel technique for identifying and isolating cell populations enriched for either ISCs or EBs at any time point during aging. The further analysis, for example transcriptome analysis, of these particular cell populations at various time points during aging is now possible and this will facilitate the examination of endogenous molecular changes that occur in these cells during aging.
बढ़ती उम्र का एक अपरिहार्य परिणाम कार्यात्मक रहने के लिए ऊतकों और अंगों के घटते की क्षमता है। वयस्क स्टेम कोशिकाओं हालांकि उम्र जीवों के रूप में, स्टेम कोशिकाओं को भी उनके जैविक व्यवहार में गिरावट का अनुभव, ऊतक homeostasis और अंग की कार्यक्षमता को बनाए रखने के लिए आवश्यक हैं। यह एक ऐसी आंतों उपकला के रूप में एक उच्च कारोबार दर है कि ऊतकों, विशेष रूप से हानिकारक है। वृद्ध स्टेम कोशिकाओं की पहचान जीनोमिक क्षति, बिगड़ा मरम्मत तंत्र, बिगड़ा सेल चक्र विनियमन और (1-3 में समीक्षा) सामान्य स्टेम सेल व्यवहार को प्रभावित जो सभी के misregulated संकेत दे रास्ते में शामिल हैं। विशिष्ट संकेत दे रास्ते से छेड़छाड़ या विशिष्ट जीन नीचे दस्तक द्वारा, हम को विनियमित करने और सामान्य स्टेम सेल व्यवहार को बनाए रखने में उनकी भूमिकाओं के बारे में विस्तृत जानकारी प्राप्त की है। इन प्रयोगों के सबसे उम्मीदवार अणु दृष्टिकोण हैं के बाद से, हम दौरान स्टेम कोशिकाओं में पाए जाते हैं कि अंतर्जात आणविक परिवर्तन के बारे में बहुत कम जानकारी हैउम्र बढ़ने। इस सवाल का दृष्टिकोण करने के लिए एक तरह से पुराने स्टेम कोशिकाओं जिनकी अभिव्यक्ति प्रोफाइल उम्र बढ़ने के दौरान काफी बदलता अणुओं की पहचान करने के लिए बनाम जवान की transcriptome तुलना करने के लिए है। दुर्भाग्य से, जैविक और तकनीकी चुनौतियों का अब तक इस दृष्टिकोण के बारे में हमारी प्रगति में बाधा उत्पन्न कर दिया है।
ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर यह (4 में समीक्षा) phenotypes के उम्र बढ़ने के एक कम उम्र (लगभग 60-70 दिन) और प्रदर्शन के बाद से उम्र बढ़ने के अध्ययन करने के लिए एक अत्यधिक उपयुक्त मॉडल जीव है। इसके अलावा, ड्रोसोफिला में उम्र बढ़ने की प्रक्रिया के तापमान से तेजी से किया जा सकता है। 29 डिग्री सेल्सियस पर मक्खियों रखने करते हैं, आंतों के ऊतकों में एक वृद्ध फेनोटाइप पहले से ही 15 दिन 5 के बाद देखा जा सकता है। इसके अलावा, ड्रोसोफिला आनुवंशिक जोड़तोड़ की अधिकता के लिए उत्तरदायी है। विशेष रूप से, ड्रोसोफिला आद्यमध्यांत्र अलग संकेत दे रास्ते पर और पर्यावरणीय चुनौतियों के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए एक उत्कृष्ट मॉडल प्रणाली के रूप में उभरा है(6-10 में समीक्षा) उम्र बढ़ने के दौरान आंतों स्टेम कोशिकाओं (ISCs) के जीव विज्ञान। ड्रोसोफिला आंतों उपकला एक उच्च कारोबार दर है और पुरुषों के 11 में एक महीने के बारे में एक बार महिलाओं में हर दो हफ्ते में नए सिरे से और है। ड्रोसोफिला आद्यमध्यांत्र में रहने वाले ISCs विभाजित है और एक आत्म-नए सिरे से आईएससी और enteroblast (ईबी) 12,13 नामक एक बाद mitotic पूर्वज सेल का उत्पादन करने की क्षमता है। ईबी एक अवशोषण enterocyte या एक स्रावी enteroendocrine सेल में या तो differentiates। इस तिथि करने के लिए, स्पष्ट रूप से एक आईएससी लेबल कि केवल मार्कर संयोजन प्रतिलेखन कारक Escargot (ईएसजी) और पायदान ligand के डेल्टा (डीएल) 14 वर्ष की अभिव्यक्ति है। बहरहाल, यह केवल एक युवा और स्वस्थ आंत के लिए सच है। उम्र बढ़ने के दौरान, आद्यमध्यांत्र उपकला आईएससी प्रसार 15-17 में वृद्धि की विशेषता है। इसके अतिरिक्त, न्यायपालिका पायदान संकेतन आईएससी बेटी कोशिकाओं के भाग्य का निर्णय बाधितऔर ईबीएस 15 के misdifferentiation लाती है। इस जिससे एक वृद्ध आद्यमध्यांत्र में सदाशयी स्टेम कोशिकाओं की पहचान करने के लिए अपर्याप्त डेली अभिव्यक्ति प्रतिपादन, पायदान संकेतन और सह एक्सप्रेस ESG और डीएल के लिए सक्रिय हैं कि कोशिकाओं का एक संग्रह में यह परिणाम है। सच ISCs की पहचान करने में कठिनाई अब तक उम्र बढ़ने ISCs में अंतर्जात परिवर्तन की जांच करने की क्षमता बाधित कर दिया है।
हम ISCs और ईबीएस में GFP अभिव्यक्ति के स्तर स्वाभाविक अलग है और उम्र बढ़ने भर में विभिन्न बनी हुई है, जिसमें ESG -Gal4, यूएएस GFP ट्रांसजेनिक उड़ लाइन का लाभ लेने के द्वारा इस मुद्दे पर घेरने की कोशिश की है। एक समान दृष्टिकोण लार्वा neuroblasts और न्यूरॉन्स 18,19 के अलगाव के लिए वर्णित किया गया है। जवान और बूढ़े ESG -Gal4, यूएएस GFP मक्खियों के Midguts विच्छेदित और एकल कक्षों में अलग किया गया। कोशिकाओं तो प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल छँटाई (FACS) का उपयोग GFP पॉजिटिव कोशिकाओं के लिए हल किया गया। दिलचस्प है, हल GFP पॉजिटिव गGFP प्रतिदीप्ति तीव्रता के आधार पर दो अलग-अलग चोटियों में वितरित एल (GFP के उच्च और GFP कम)। इसके अलावा, यह भी सेल के आकार के साथ सहसंबद्ध दो चोटियों में GFP पॉजिटिव कोशिकाओं का वितरण: कम GFP तीव्रता का प्रदर्शन कोशिकाओं है कि छोटे थे और उच्च GFP तीव्रता के साथ कोशिकाओं जबकि कम बारीक बड़ा और अधिक बारीक थे। इस अवलोकन छोटे ISCs GFP तीव्रता के आधार पर FACS का उपयोग करने और उपयुक्त आगे तितर बितर (FSC) और पक्ष तितर बितर (एसएससी) सेटिंग्स चुनने बड़ा ईबीएस से प्रतिष्ठित किया जा सकता है कि सुझाव दिया। दिलचस्प, दो चोटियों साफ़ उम्र बढ़ने के दौरान अलग रहे। इसके अलावा, दो चोटियों के अनुपात उम्र बढ़ने midguts के aforementioned पहचान को दर्शाता है कि एक तरह से बदल दिया है: बड़े की संख्या, समय के साथ ईबीएस बढ़ जाती है misdifferentiated अर्थात् है। इन निष्कर्षों से हम उपयुक्त FACS के पैरामीटर सेटिंग्स का उपयोग GFP पॉजिटिव कोशिकाओं के लिए छँटाई द्वारा हम किसी भी समय बिंदु घ पर ISCs और ईबीएस के लिए समृद्ध कर सकते हैं निष्कर्ष है किuring उम्र बढ़ने।
सारांश में, हम किसी भी उम्र के ड्रोसोफिला midguts से, दो अलग अलग सेल आबादी, ISCs और ईबीएस के लिए समृद्ध और इस तरह के अगली पीढ़ी के अनुक्रमण के रूप में आगे के विश्लेषण के लिए इन कोशिकाओं को अलग करने के लिए सक्षम बनाता है शोधकर्ताओं कि एक FACS रणनीति परिचय। इस शक्तिशाली विधि स्टेम या पूर्वज कोशिकाओं के एक समृद्ध आबादी में उम्र बढ़ने के लिए निहित हैं कि अंतर्जात आणविक तंत्र के अध्ययन के लिए अनुमति देता है। इन अध्ययनों से प्राप्त आंकड़ों निस्संदेह प्रजातियों भर में उम्र बढ़ने में महत्वपूर्ण हैं कि संरक्षित अणुओं की पहचान की सुविधा होगी।
प्रस्तुत प्रोटोकॉल बाद में इस तरह के अगली पीढ़ी के अनुक्रमण के रूप में आगे आणविक विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, जो जवान और बूढ़े वयस्क ड्रोसोफिला midguts से ISCs अलग करने के लिए एक विधि का वर्णन है। ESG -Gal4 से GFP पॉजिटिव सेल की आबादी का एफ ए सी छँटाई, यूएएस GFP के उड़ लाइन पहले से ही कई समूहों 21,22 से हासिल किया गया है। हालांकि, अब तक GFP पॉजिटिव कोशिकाओं की दो अलग चोटियों की उपस्थिति या तो अनदेखी की या इसका सही मूल्यांकन नहीं किया गया है। हम इस जुदाई न केवल लेकिन यह भी GFP पॉजिटिव कोशिकाओं की दो चोटियों उम्र बढ़ने के दौरान अलग अलग रहते हैं, सेल प्रकार (ISCs और ईबीएस) की दो अलग अलग आबादी का प्रतिनिधित्व करता है कि पता चलता है। इस अवलोकन अत्यधिक प्रासंगिक और उम्र बढ़ने के दौरान स्टेम या पूर्वज कोशिकाओं का अध्ययन करने में रुचि शोधकर्ताओं के लिए मूल्यवान है। पुराने midguts से ISCs के अलगाव एक वृद्ध आद्यमध्यांत्र में ISCs की पहचान करने के लिए कोई आणविक मार्कर संयोजन तथ्य है कि वहाँ के द्वारा बाधा उत्पन्न की गई है। केवल मार्कर कि यूISCs आद्यमध्यांत्र 12,13 में केवल कोशिकाओं को विभाजित कर रहे हैं के बाद से nambiguously एक पुराने आद्यमध्यांत्र में ISCs पहचानती है phospho-histone3 (PH3), है। हालांकि, PH3 किसी भी समय बिंदु पर स्टेम कोशिकाओं को विभाजित करने की संख्या के बाद के विश्लेषण के लिए ISCs की एक सभ्य राशि प्राप्त करने के लिए बहुत कम है क्योंकि ISCs अलग करने के लिए एक अनुपयुक्त मार्कर है। मक्खी लाइन ESG -Gal4, यूएएस GFP के आईएससी समारोह, रखरखाव और भेदभाव जो अध्ययन शोधकर्ताओं द्वारा इस्तेमाल सबसे आम उड़ लाइन है। ISCs homeostasis के आणविक विनियमन पर हमारे वर्तमान ज्ञान विशिष्ट अणुओं और संकेत रास्ते चालाकी से किया गया है, जिसमें अध्ययन के आधार पर किया जाता है (7 में समीक्षा)। इसलिए, हम अभी भी उम्र बढ़ने के दौरान होती है कि अंतर्जात आणविक परिवर्तन के बारे में ज्ञान की कमी है। इस के साथ साथ वर्णित विधि इस अंतर को बंद कर देता है और ISCs उम्र बढ़ने के दौरान किसी भी समय बिंदु पर वयस्क midguts से उनके आकार, विघटन और GFP तीव्रता के आधार पर अलग किया जा सकता है कि इस तथ्य पर आधारित है।
जबकिस्थापित करने और हम निम्नलिखित कदम एक विश्वसनीय परिणाम के लिए महत्वपूर्ण हो पाया है कि इस विधि के अनुकूलन। लगभग 200 हिम्मत एफ ए सी छँटाई के लिए ISCs का एक अच्छा राशि प्राप्त करने के क्रम में विच्छेदित किए जाने की जरूरत है। विच्छेदन की गति महत्वपूर्ण है और व्यक्ति के व्यवहार पर निर्भर करता है। एक प्रशिक्षित व्यक्ति 20-30 मिनट के भीतर 40 हिम्मत काटना कर सकते हैं। GFP के भी ESG -Gal4 में Malpighian नलिकाओं में व्यक्त किया जाता है, यूएएस GFP के उड़ लाइन, यह पूरी तरह से आद्यमध्यांत्र से Malpighian नलिकाओं को दूर करने के लिए आवश्यक है। विच्छेदित midguts ऊतक गिरावट से बचने और ऊतकों में RNase गतिविधि को कम करने के लिए एक शांत वातावरण में रखा जाना चाहिए। इसलिए, विच्छेदित midguts 20-30 मिनट की एक अधिकतम के बाद ठंड 1x पीबीएस / 1% BSA के समाधान युक्त microcentrifuge ट्यूबों में विदारक पकवान से स्थानांतरित और बर्फ पर रखा जाना चाहिए। हालांकि, विच्छेदित midguts trypsin के साथ ऊतक हदबंदी शुरू करने से पहले अधिक से अधिक 2 घंटे के लिए बर्फ पर नहीं छोड़ा जाना चाहिए। सबसे efficiईएनटी दृष्टिकोण तो, इन दो घंटा के भीतर संभव के रूप में मक्खियों के रूप में कई बैचों काटना ट्रिप्सिन इन बैचों के लिए पचाने में शुरू करने के लिए है। अधिक midguts की जरूरत है, वे ट्रिप्सिन डाइजेस्ट के ऊष्मायन समय के दौरान विच्छेदित किया जा सकता है।
ट्रिप्सिन एक बहुत शक्तिशाली एंजाइम है और कोशिकाओं पर हानिकारक प्रभाव हो सकता है, हम अभी भी पर्याप्त रहते हैं, बाद में एफ ए सी छँटाई के लिए स्वस्थ कोशिकाओं को प्राप्त किया। बरकरार कोशिकाओं के अलगाव के लिए अनुमति देता है कि हमारी प्रक्रिया का महत्वपूर्ण कदम अलग कोशिकाओं trypsin समाधान के लिए हर 30 मिनट से हटा दिया जाता है। विच्छेदित midguts कमरे के तापमान पर समाधान युक्त एक ट्रिप्सिन में 2 आधा घंटा के लिए incubated रहे हैं, हम मर चुका है, Sytox पॉजिटिव कोशिकाओं में एक 20-30% वृद्धि मनाया। यह उपयोग हम trypsin समाधान EDTA जिसमें बताया जाना चाहिए। EDTA के उपस्थिति शायद बाह्य मैट्रिक्स अणुओं के समुचित कार्य के लिए आवश्यक कैल्शियम और मैग्नीशियम आयनों chelating द्वारा ऊतक विघटन की सुविधा। </p>
जवान और बूढ़े हिम्मत से सबसे महत्वपूर्ण कदमों को सफलतापूर्वक क्रमबद्ध ISCs FACS और वर्णित नियंत्रण का उपयोग कर और एक विशिष्ट छँटाई पदानुक्रम निम्नलिखित gating के मापदंडों के उचित प्रारंभिक सेटिंग कर रहे हैं। हम एक ARIA द्वितीय फ्लो cytometer (FACSDiva सॉफ्टवेयर) पर छँटाई एफ ए सी प्रदर्शन किया। यह साधन पूर्व लेज़रों गर्म करने के लिए छँटाई करने के लिए कम से कम एक घंटा चालू है कि महत्वपूर्ण है। ISCs की एफ ए सी छँटाई पहली बार के लिए किया जाता है, जब ध्यान से, छँटाई के लिए और मुआवजे की जरूरत के लिए मानकों के aforementioned नियंत्रण का उपयोग कर स्थापित किया जाना है: (1) जंगली प्रकार से कोशिकाओं को अलग (उदाहरण के लिए 1118 डब्ल्यू) Sytox के अलावा बिना ड्रोसोफिला midguts – इस पैरामीटर (चरण 4.4.1) की स्थापना उनकी autofluorescence के आधार पर कोशिकाओं छँटाई रोकता है; (2) Sytox के साथ जंगली प्रकार से (उदाहरण के लिए 1118 डब्ल्यू) कोशिकाओं ड्रोसोफिला midguts अलग जोड़ – इस पैरामीटर सेटिंग(चरण 4.4.2) (मृत कोशिकाओं को एक उच्च autofluorescence है और हल GFP पॉजिटिव कोशिकाओं को दूषित कर सकते हैं) जीवित कोशिकाओं से मृत को अलग करने की अनुमति देता है; (3) ESG -Gal4 की midguts से कोशिकाओं को अलग, Sytox बिना यूएएस GFP के उड़ लाइन – इस पैरामीटर सेटिंग (चरण 4.4.3) सभी GFP पॉजिटिव कोशिकाओं तितर बितर साजिश के भीतर प्लॉट किए जाते हैं कि यह सुनिश्चित करता है। इन मापदंडों ठीक से स्थापित नहीं कर रहे हैं, हल सेल की आबादी सबसे अधिक संभावना मृत कोशिकाओं और मलबे (चित्रा 5 ब, सी), कई GFP पॉजिटिव कोशिकाओं (चित्रा 5D) याद किया जाएगा और के रूप में GFP पॉजिटिव कोशिकाओं के लिए दो अलग-अलग चोटियों में शामिल होंगे हिस्टोग्राम साजिश में देखा (चित्रा 2 ई और चित्रा 3E) का पता नहीं किया जाएगा। FACS और gating मानकों सेट किया गया है एक बार, उपकरण calibrated और ईएसजी -GAL4, यूएएस GFP के उड़ लाइन से कोशिकाओं को सॉर्ट करने के लिए तैयार कर रहा है। इन मानकों को बचाया जा सकता है, भविष्य की सभी ESG -GAL4, UAS- से ISCs और ईबीएस के लिए सत्रों छँटाईGFP के उड़ लाइन चरण में 4.5 से शुरू कर सकते हैं। "पवित्रता" मोड चुनने और एक दो तरह पवित्रता प्रदर्शन कर क्रमबद्ध सॉर्ट किया गया कोशिकाओं की संख्या कम हो जाती है, यह एक उच्च छँटाई तंगी (चरण 4.6 और 4B चित्रा, सी) के लिए अनुमति देता है। ध्यान से, मृत कोशिकाओं को लेबल करने के बजाय propidium आयोडाइड के Sytox उपयोग करने का लाभ केवल बाहर छलकते के लिए क्षतिपूर्ति करने के लिए यह आसान बनाता है जो FITC (GFP) के चैनल में एक कम बाहर छलकते है कि वहाँ है।
ISCs और ईबीएस के लिए समृद्ध बनाने का हमारा तरीका है, क्रमशः, अलग GFP अभिव्यक्ति के स्तर के अनुसार कोशिकाओं छँटाई पर आधारित है। यह misdifferentiated ईबीएस भी एक निचले स्तर पर व्यक्त GFP और ISCs के रूप में गलत हो सकता है उम्र बढ़ने के दौरान हो सकती है। छाँटे गए कोशिकाओं को भी आकार और विघटन में अलग हालांकि, बाद से, हम अपने छँटाई रणनीति ISCs और ईबीएस के लिए समृद्ध करने के लिए इस तिथि करने के लिए सबसे उपयुक्त है कि विश्वास करते हैं। इसके अलावा, यह आईएससी पहचान को बनाए रखना एक उम्र बढ़ने आद्यमध्यांत्र में कोशिकाओं के एक छोटे नाभिक है कि जाना जाता है 15। सॉर्ट किया गया कोशिकाओं की पहचान के बारे में अधिक स्पष्टता प्राप्त करने के लिए, एक -GAL4 ESG किया जाता है कि एक ट्रांसजेनिक उड़ लाइन, यूएएस GFP और एक पायदान संकेतन संवाददाता transgene से कोशिकाओं को सॉर्ट सकता है। पायदान केवल ईबीएस 12,13 में सक्रिय होने के लिए दिखाया गया है के बाद से, ISCs ईबीएस पायदान रिपोर्टर के लिए सकारात्मक होगा, जबकि पायदान रिपोर्टर के लिए नकारात्मक होगा एक युवा आद्यमध्यांत्र से अलग। हालांकि, के दौरान पायदान संकेतन उम्र बढ़ने आद्यमध्यांत्र ऊतक में न्यायपालिका हो जाता है। इसलिए, यह स्थापित किया है कि इस प्रयोगात्मक वास्तव में अधिक ISCs और ईबीएस के बीच भेद करने के लिए विश्वसनीय एक पुराने आद्यमध्यांत्र से अलग है कि क्या परीक्षण किया जाना चाहिए।
हम पहले से ही जवान और बूढ़े midguts से ISCs के तुलनात्मक transcriptome विश्लेषण के लिए इस दृष्टिकोण कार्यरत हैं और उम्र बढ़ने के दौरान विभिन्न विनियमित रहे हैं कि कारकों में से एक नंबर की पहचान की है (unpub। Observ।)। साथ ही, इस विधि ISCs और ईबीएस के बीच जीन की अभिव्यक्ति में मतभेद का विश्लेषण करने के लिए अनुमति देता है। ऐसी जांचएक सेल भेदभाव प्रक्रिया में प्रवेश करती है के रूप में होती है कि प्रारंभिक आणविक परिवर्तन में अंतर्दृष्टि प्रदान करेगा। इसके अलावा, उम्र बढ़ने और बाद के विश्लेषण के दौरान ईबीएस के अलगाव उम्र प्रेरित misdifferentiation की आणविक परिवर्तन पर प्रकाश डाला जाएगा। इसके अलावा, इस विधि जीन समारोह का अध्ययन करने के लिए ड्रोसोफिला में इस्तेमाल अन्य आनुवंशिक उपकरणों के साथ जोड़ा जा सकता है। सारांश में, इस विधि उम्र बढ़ने के दौरान आणविक विशेषताओं और ISCs और ईबीएस के परिवर्तन की जांच के लिए एक निष्पक्ष दृष्टिकोण प्रदान करता है। इस वयस्क स्टेम और पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं में तंत्र उम्र बढ़ने के अन्वेषण की सुविधा होगी कि एक महत्वपूर्ण उपकरण है।
The authors have nothing to disclose.
We are grateful to Gabriele Allies for excellent technical assistance. We thank the University Ulm Medical Faculty for the use of the FACS Core Facility and the Institut für Molekulare und Zelluläre Anatomie for using the confocal microscope. We thank S. Hayashi for the esg-Gal4, UAS-GFP fly line. This project is funded by the Federal Ministry of Education and Research (BMBF, Forschungskern SyStaR). A.T. is supported by SFB 1074 (Project A2). A.T. and G.A. are supported by the Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, FE578/3-1). H.M.T. is a member of the International Graduate School in Molecular Medicine Ulm (GSC 270).
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Forceps: Dumont, Inox Biologie #5 | Fine Science Tools | 11252-20 | |
SefarNitex 03-150um/38 (35 µm nylon mesh) | Sefar | 3A03-0150-102-00 | |
Falcon 5ml Round Bottom Polystyrene Test Tube with Cell Strainer Snap Cap | Corning | 352235 | |
Polymax 1040 | Heidolph | 543-42210-00 | |
Albumin from bovine serum (BSA) | Sigma | A4503-50G | |
0.5% Trypsin-EDTA | Invitrogen | 15400-054 | Trypsin obtained from a different company most likely has a different activity and the duration of the trypsin digest has to be adjusted accordingly. |
SYTOX Blue Dead Cell Stain for flow cytometry | Life Technologies | S34857 | |
RNAlater Stabilization Solution | Life Technologies | AM7023 | other solutions, e.g. Trizol can be used for subsequent RNA isolation |
FACSAria II cell sorter | Becton Dickinson | Turn on one hour prior to sorting |