We present an experimental procedure of Candida albicans biofilm development in a mouse subcutaneous model. Fungal biofilms were quantified by determining the number of colony forming units and by a non-invasive bioluminescence imaging, where the amount of light that is produced corresponds with the number of viable cells.
Candida albicans biofilm utvikling på biotiske og / eller abiotiske overflater utgjør en konkret trussel for innlagte pasienter. Hittil C. albicans biofilmer har blitt studert overveiende in vitro, men det er et viktig behov for en bedre forståelse av denne dynamiske prosess under in vivo-betingelser. Vi har utviklet en in vivo subkutan rottemodell for å studere C. albicans biofilmdannelse. I vår modell flere (opptil 9) Candida -infected enheter er implantert i den bakre delen av dyret. Dette gir oss en stor fordel i forhold til det sentrale venekateter modellsystem som gjør det mulig for oss å studere flere uavhengige biofilmer i ett dyr. Nylig har vi tilpasset denne modellen til å studere C. albicans biofilm-utviklingen i BALB / c-mus. I denne modellen, modne C. albicans biofilmer utvikle innen 48 timer og demonstrere typisk tredimensjonale biofilm arkitektur. Kvantifisering av sopp biofilmer tradisjonelt analysert post mortem og krever vert offer. Fordi dette krever bruk av mange dyr til å utføre kinetiske studier, søkte vi non-invasiv Bioluminescens imaging (BLI) til langs oppfølging in vivo modne C. albicans biofilm utvikling i vår subkutan modell. C. albicans-celler ble konstruert for å uttrykke Gaussia princeps luciferasegenet (Gluc) festet til celleveggen. Bioluminescens signal frembringes av luciferase som konverterer det tilsatte substrat coelenterazine til lys som kan måles. Den BLI signal lignet celletall hentet fra eksplanterte katetre. Non-invasiv bildediagnostikk for å kvantifisere in vivo biofilmdannelse gir umiddelbare programmer for screening og validering av soppdrepende medisiner under in vivo forhold, samt for studier basert på verts-patogen interaksjoner, herved bidra til en bedre forståelseing av patogenesen av kateterinfeksjoner.
Candida albicans er en kommensal organisme, som kan bli funnet på ulike steder av friske individer, for eksempel på huden eller som en del av mage og vaginal flora. Men i sykehus, og spesielt immunsupprimerte pasienter, kan det føre til et bredt spekter av infeksjoner 1. I slike individer, lar svekket immunsystem Candida celler til å spre ut i blodet og for å invadere dypere vev forårsaker livstruende infeksjoner. I tillegg er tilstedeværelsen av ikke-biologiske substrater så som sentralvene og innsetting av kateter, kan kunstige hjerteklaffer og ledd gi en nisje for Candida vedlegg 2. Adhesjon til slike substrater er en forutsetning for videre utvikling av biofilm, som representerer et lag av gjær og hyphal celler innleiret i ekstracellulært polymerisk materiale, vesentlig bestående av polysakkarider 2 C.. albicans kateter -associated infeksjonerer forbundet med høy dødelighet. En generell karakteristikk av biofilm er deres nedsatt følsomhet overfor kjente soppmidler, for eksempel azolene 3,4. Bare nyere klasser av soppdrepende stoffer, for eksempel echinokandiner og liposomformulering av amfotericin B viste seg å være aktiv mot kateterassosierte infeksjoner 5-7. På grunn av biofilm elastisitet til soppmidler, er terapeutiske tilnærminger svært begrenset, ofte fører til kateterfjerning og dens påfølgende erstatning som eneste løsning.
Mesteparten av vår nåværende forståelse av C. albicans biofilm-utviklingen stammer fra in vitro-studier på ikke-biologiske substrater, så som polystyren, eller plast som brukes for fremstilling av ovennevnte enheter, det vil si, silikon, polyuretan 2. Disse modellene er ganske avansert og prøver å etterligne in vivo situasjon så tett som mulig. Men disse systemer ikke involverer kontinuerlig blodstrøm og than immunsystem av verten. Dette førte til utviklingen av in vivo-modellsystemer, slik som det sentrale venekateter (CVC) modell 8-10, gebiss stomatitt modell av oral candidiasis 11 og en murin modell for kateter forbundet candiduria 12. I tillegg C. albicans biofilm-utviklingen ble studert in vivo på slimhinneoverflater, slik som de fra skjeden 13 og munnhulen 14. Vårt laboratorium bidratt med etablering av en subkutan C. albicans biofilm-modellen, som er basert på implantatet av infiserte kateterstykker på baksiden av Sprague Dawley-rotter 15. Denne modellen ble brukt i vårt laboratorium for å teste biofilm mottakelighet for flukonazol og echinokandin- narkotika 5,16, for å studere effekten av kombinatorisk behandling av diklofenak og caspofungin 17. Mer nylig har vi tilpasset dette system for bruk i BALB / c-mus 18,19. Isammenligning med andre in vivo-modeller, er den største fordelen med denne subkutan modellen mulighet til å studere flere biofilmer per dyr utviklet inne i lumen av implantert kateter stykker.
For å redusere antall forsøksdyr, har vi tilpasset denne modell for å studere utviklingen av C. albicans biofilmer non-invasiv ved hjelp Bioluminescens imaging (BLI) 18,19. Denne fremgangsmåte viste seg å være en kraftig teknikk, som kan brukes til å kvantifisere biofilmer ved å måle den spesifikke BLI signal ved området av interesse (i vårt tilfelle området implantert kateter), unngå dyreoffer. I forhold til bakterier, som kan uttrykke både genet og substratet som er nødvendig for Bioluminescens reaksjon på grunn av innføring av et bestemt lux operon 20, de fleste av de eukaryote organismer, inklusive C. albicans, er avhengig av heterolog ekspresjon av et luciferase-gen sammen med denekstern administrasjon av et bestemt underlag, for eksempel D-luciferin eller coelenterazine 21. Sannsynligvis på grunn av tilstedeværelsen av soppcelleveggen og C. albicans morfogenese, den intracellulære leveringen av substratet for luciferase-enzymet var en hovedutfordring 21. For å løse dette problemet, Enjalbert et al., 22 konstruert for en belastning, hvor en syntetisk C. albicans kodon-optimalisert versjon av genet for den naturlig utskilt Gaussia princeps luciferase (Gluc) ble fusjonert til til C. albicans PGA59 gen, et GPI- forankret celleveggprotein. På grunn av tilstedeværelsen av luciferase på celleveggen, kan problemer vedrørende den intracellulære tilgjengelighet av substratet unngås. Dette spesielle systemet ble benyttet for å studere overflate infeksjoner forårsaket av C. albicans 22. Ganske nylig, BLI ble også brukt til å følge utviklingen av orofaryngeal candidiasis og dens possible behandling 23. Slike funn støtter bruk av BLI som en lovende teknikk for å studere infeksjoner forårsaket av frittlevende celler, men også enhetsassosierte infeksjoner.
I denne studien, beskriver vi C. albicans biofilm utvikling på polyuretan kateter stykker i BALB / c mus og dens kvantifisering ved hjelp BLI. Vi gir en detaljert protokoll for in vitro-kolonisering av polyuretan katetre i løpet av adhesjon, fulgt av implantering i mus og påfølgende biofilm-utviklingen i levende dyr. Bortsett fra å måle BLI signal som sendes ut av C. albicans celler, vi også bestemme kolonidannende enheter for sammenligning med standard teknikk for biofilm sopplast kvantifisering.
Bruk av dyremodeller, og spesielt gnagermodeller, for studier dedikert til mikrobiell biofilm er svært viktig som vert immunsystemet er en viktig faktor i biofilmdannelse som in vitro modeller ikke kan gjøre rede for. I denne studien, beskriver vi en relativt enkel subkutan C. albicans biofilm musemodell, som lett kan vedtas i et forskningslaboratorium, og krever ikke sterke tekniske ferdigheter. Denne modellen ble opprinnelig utviklet for å studere Staphylococcus epidermidis biofilmdannels…
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by the KU Leuven PF ‘IMIR’, the FWO Research community on biology and ecology of bacterial and fungal biofilms (FWO: WO.026.11N) and by the FWO project G.0804.11. SK gratefully acknowledges KU Leuven for the PDMK 11/089 fellowship and FWO for the postdoctoral fellowship. We are grateful to Nico Vangoethem for his assistance with preparation of the figures. We would like to acknowledge Celia Lobo Romero for technical assistance during in vivo experimental procedures.
Name of Reagent | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Yeast extract granulated | Merck | MERC1.03753.0500 | |
Bacteriological peptone | Oxoid | LP037B | |
Agar granulated | Difco | 214530 | |
D-(+)-glucose | Fluka | 49159-5KG | |
Phosphate buffered saline | Prepared in the laboratory | for 1L of 10x PBS: 80 g NaCl, 2 g KCl, 14.4 g Na2HPO4, 2.4 g KH2PO4 | |
RPMI1640 with L-glutamine and without sodium carbonate | Sigma | R6504-1L | Prepare according the protocol for Candida albicans drug susceptibility testing |
3-(N-Morpholino)propanesulfonic acid (MOPS) | Sigma | M1254 | MOPS is used to adjust the pH of RPMI medium (pH 7.0) |
fetal bovine serum (FBS) | Sigma | F7524 | |
Polyurethane tripe-lumen intravenous catheter piece (2.4 mm diameter, Certofix Trio S730) | BBraun | CV-15703 | Polyurethane part cut into 1 cm pieces |
Dexamethasone | Fagron SAS, France | 611139 | Immunosuppressant (stock solution 10 mg/ml) |
Ampicillin | Duchefa Biochemie, The Netherlands | A0104 | Antibacterial prophylaxis |
Ketamine 1000 | Pfizer | 804 119 | Anesthetic |
Domitor | Pfizer | 134737-1 | Anesthetic |
Antisedan | Pfizer | 134783-2 | Reversal of anesthesia |
Xylocaine gel (2%) – this is Linisol | AstraZeneca | 352 1206 | Local anesthetic for the skin |
Terramycin/ polymyxin-b ophthalmic ointment | To prevent drying and infection of eyes | ||
Coelenterazine | Prolume (Nanolight) | NF-CTZ-FB | Light sensitive agent (must be kept in the dark) |
Iodine isopropanol (1%) | 3M™ DuraPrep™ | Disinfectant for the skin | |
0.5 % chlorhexidine in 70 % alcohol. | Cedium | Disinfectant for the skin | |
Equipment | |||
Cell counting chamber | |||
Insulin syringes (0.3 ml) | Terumo Myjector 29G | 324826 | For injection of coelenterazine |
Electric razor | For small animals | ||
Sterile surgical tools | Scissors, 2 pairs of tweezers, scalpel | ||
Heating pad | Leica | 14042321474 | |
Skin suture | Johnson&Johnson | K890H | Surgical thread, needle |
Water bath sonicator | Branson 2210 | ||
BLI camera (IVIS Spectrum) | Perkin Elmer, Alameda | IVISSPE | |
Living Image software | Perkin Elmer, Alameda | (version 4.2) |