Candida albicans Biofilm Udvikling om medicinsk relevante fremmedlegemer i en mus Subkutan Model Efterfulgt af Bioluminescens Imaging
Summary
We present an experimental procedure of Candida albicans biofilm development in a mouse subcutaneous model. Fungal biofilms were quantified by determining the number of colony forming units and by a non-invasive bioluminescence imaging, where the amount of light that is produced corresponds with the number of viable cells.
Abstract
Candida albicans biofilm udvikling på biotiske og / eller abiotiske overflader udgør en specifik trussel for indlagte patienter. Hidtil C. albicans biofilm er overvejende blevet undersøgt in vitro, men der er et afgørende behov for en bedre forståelse af denne dynamiske proces under in vivo betingelser. Vi udviklede en in vivo subkutan rottemodel at studere C. albicans biofilm formation. I vores model, flere (op til 9) Candida -inficerede indretninger implanteres til den bageste del af dyret. Det giver os en stor fordel i forhold til centralt venekateter model system, da det giver os mulighed for at studere flere uafhængige biofilm i et dyr. For nylig har vi tilpasset denne model til at studere C. albicans biofilm udvikling i BALB / c-mus. I denne model modne C. albicans biofilm udvikle sig inden 48 timer og demonstrere den typiske tredimensionale biofilm arkitektur. Kvantificeringen af fungal biofilmer traditionelt analyseret post mortem og kræver vært offer. Da dette kræver brug af mange dyr til at udføre kinetiske undersøgelser, ansøgte vi non-invasiv bioluminescens imaging (BLI) til længderetningen opfølgning in vivo modne C. albicans biofilm udvikling i vores subkutan model. C. albicans celler blev manipuleret til at udtrykke Gaussia princeps luciferase genet (gluc) fastgjort til cellevæggen. Den bioluminescens frembringes ved luciferase, der konverterer den tilsatte substrat coelenterazin i lys, der kan måles. Den BLI signal lignede celletal opnået fra eksplanterede katetre. Ikke-invasiv billeddannelse til kvantificering in vivo biofilmdannelse giver umiddelbare applikationer til screening og validering af svampemidler under in vivo betingelser, og for undersøgelser baseret på vært-patogen interaktioner, herved bidrage til en bedre forståelseing af patogenesen af kateter infektioner.
Introduction
Candida albicans er en kommensal organisme, som kan findes på forskellige steder i raske individer, for eksempel på huden eller som en del af mave og vaginale flora. Men i indlagt, og især immunkompromitterede patienter, kan det forårsage en lang række infektioner 1. I sådanne personer, den svækket immunsystem gør Candida celler til at formidle ind i blodbanen og at invadere dybere væv forårsager livstruende infektioner. Desuden er tilstedeværelsen af abiotiske substrater, såsom centrale venøse og urinkatetre, kunstige hjerteklapper og led kan give en niche for Candida bilag 2. Adhæsion til sådanne substrater er en forudsætning for yderligere udvikling biofilm, som udgør et lag af gær og svampetrådenes celler indlejret i ekstracellulær polymermateriale, hovedsageligt bestående af polysaccharider 2. C. albicans kateter -associerede infektionerer forbundet med høj dødelighed. En generel karakteristik af biofilm er deres nedsat følsomhed over for kendte lægemidler, såsom azoler 3,4. Kun nyere klasser af antifungale lægemidler, såsom echinocandiner og liposomal formulering af amphotericin B vist sig at være aktive mod kateter infektioner 5-7. På grund af biofilm modstandsdygtighed over for svampemidler, er terapeutiske metoder meget begrænsede, hvilket ofte fører til kateter fjernelse og efterfølgende erstatning som eneste løsning.
De fleste af vores nuværende forståelse af C. albicans biofilm udvikling stammer fra in vitro undersøgelser af abiotiske substrater såsom polystyren, eller plast, der anvendes til fremstilling af ovennævnte enheder, dvs, silikone, polyurethan 2. Disse modeller er ganske avanceret og forsøge at efterligne situationen in vivo så tæt som muligt. Men disse systemer ikke involverer kontinuerlig blodgennemstrømning og than immunsystem værten. Dette resulterede i udviklingen af in vivo-model, såsom den centrale venekateter (CVC) model 8-10 protesen stomatitis model af oral candidiasis 11 og en murin model for kateter-associeret candiduria 12. Derudover C. albicans biofilm udvikling blev undersøgt in vivo på slimhindeoverflader, såsom dem fra skeden 13 og mundhulen 14. Vores laboratorium bidrog med etableringen af en subkutan C. albicans biofilm model, der er baseret på implantatet af inficerede kateter stykker på bagsiden af Sprague Dawley-rotter 15. Denne model blev med held anvendt i vores laboratorium for at teste biofilm modtagelighed for fluconazol og Echinocandin lægemidler 5,16, for at studere virkningen af kombinatorisk terapi af diclofenac og caspofungin 17. Mere for nylig, vi tilpasset dette system til brug i BALB / c-mus 18,19. Isammenligning med andre in vivo-modeller, den vigtigste fordel ved denne subkutan model er muligheden for at studere flere biofilm per dyr udviklet inde i lumen af implanterede kateter stykker.
For at reducere antallet af forsøgsdyr, har vi tilpasset denne model til at studere udviklingen af C. albicans biofilm ikke-invasivt ved hjælp af bioluminescens imaging (BLI) 18,19. Denne metode viste sig at være en kraftfuld teknik, som kan anvendes til at kvantificere biofilm ved at måle den specifikke BLI signal på regionen af interesse (i vores tilfælde området implanterede katetre), undgå dyr offer. I sammenligning med bakterier, som kan udtrykke både genet og substratet kræves til bioluminescensreaktion som følge af indførelsen af en specifik lux operon 20 fleste af de eukaryote organismer, herunder C. albicans, er afhængige af den heterologe ekspression af et luciferasegen kombineret medekstern administration af et specifikt substrat, såsom D-luciferin eller coelenterazin 21. Sandsynligvis på grund af tilstedeværelsen af svampens cellevæg og C. albicans morfogenese, intracellulære levering af substratet for luciferaseenzymet var en vigtig udfordring 21. For at løse dette problem, Enjalbert et al. 22 manipuleret en stamme, hvor en syntetisk C. albicans codon-optimeret version af genet for den naturligt secerneret Gaussia princeps luciferase (gluc) blev fusioneret til den C albicans PGA59 gen, et GPI- forankret cellevæg protein. På grund af tilstedeværelsen af luciferase på cellevæggen, kan problemer med intracellulære tilgængelighed af substratet undgås. Dette særlige system blev anvendt til at undersøge overfladiske infektioner forårsaget af C. albicans 22. For ganske nylig blev BLI også bruges til at følge udviklingen af trøske og dens possible behandling 23. Sådanne fund støtter brugen af BLI som en lovende teknik til at studere infektioner forårsaget af fritlevende celler, men også enhed infektioner.
I denne undersøgelse, beskriver vi C. albicans biofilm udvikling på polyurethan kateter stykker i BALB / c-mus og dens kvantificering ved hjælp BLI. Vi giver en detaljeret protokol af in vitro kolonisering af polyurethan katetre løbet af adhæsion efterfulgt af implantation i mus og efterfølgende biofilm udvikling i levende dyr. Bortset fra at måle BLI udsendt med C. albicans celler, vi også bestemme kolonidannende enheder til sammenligning med standard teknik til biofilm svampe belastning kvantificering.
Protocol
Representative Results
Discussion
Brugen af dyremodeller, og især gnaver modeller, til undersøgelser dedikeret til mikrobielle biofilm er meget vigtigt, da værtens immunsystem er en væsentlig faktor i biofilmdannelse at in vitro-modeller ikke kan gøre rede for. I denne undersøgelse, beskriver vi en forholdsvis enkel subkutan C. albicans biofilm musemodel, som let kan vedtages i et forskningslaboratorium og ikke kræver stærke tekniske færdigheder. Denne model blev oprindeligt udviklet for at studere Staphylococcus epidermid…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the KU Leuven PF ‘IMIR’, the FWO Research community on biology and ecology of bacterial and fungal biofilms (FWO: WO.026.11N) and by the FWO project G.0804.11. SK gratefully acknowledges KU Leuven for the PDMK 11/089 fellowship and FWO for the postdoctoral fellowship. We are grateful to Nico Vangoethem for his assistance with preparation of the figures. We would like to acknowledge Celia Lobo Romero for technical assistance during in vivo experimental procedures.
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Yeast extract granulated | Merck | MERC1.03753.0500 | |
| Bacteriological peptone | Oxoid | LP037B | |
| Agar granulated | Difco | 214530 | |
| D-(+)-glucose | Fluka | 49159-5KG | |
| Phosphate buffered saline | Prepared in the laboratory | for 1L of 10x PBS: 80 g NaCl, 2 g KCl, 14.4 g Na2HPO4, 2.4 g KH2PO4 | |
| RPMI1640 with L-glutamine and without sodium carbonate | Sigma | R6504-1L | Prepare according the protocol for Candida albicans drug susceptibility testing |
| 3-(N-Morpholino)propanesulfonic acid (MOPS) | Sigma | M1254 | MOPS is used to adjust the pH of RPMI medium (pH 7.0) |
| fetal bovine serum (FBS) | Sigma | F7524 | |
| Polyurethane tripe-lumen intravenous catheter piece (2.4 mm diameter, Certofix Trio S730) | BBraun | CV-15703 | Polyurethane part cut into 1 cm pieces |
| Dexamethasone | Fagron SAS, France | 611139 | Immunosuppressant (stock solution 10 mg/ml) |
| Ampicillin | Duchefa Biochemie, The Netherlands | A0104 | Antibacterial prophylaxis |
| Ketamine 1000 | Pfizer | 804 119 | Anesthetic |
| Domitor | Pfizer | 134737-1 | Anesthetic |
| Antisedan | Pfizer | 134783-2 | Reversal of anesthesia |
| Xylocaine gel (2%) – this is Linisol | AstraZeneca | 352 1206 | Local anesthetic for the skin |
| Terramycin/ polymyxin-b ophthalmic ointment | To prevent drying and infection of eyes | ||
| Coelenterazine | Prolume (Nanolight) | NF-CTZ-FB | Light sensitive agent (must be kept in the dark) |
| Iodine isopropanol (1%) | 3M™ DuraPrep™ | Disinfectant for the skin | |
| 0.5 % chlorhexidine in 70 % alcohol. | Cedium | Disinfectant for the skin | |
| Equipment | |||
| Cell counting chamber | |||
| Insulin syringes (0.3 ml) | Terumo Myjector 29G | 324826 | For injection of coelenterazine |
| Electric razor | For small animals | ||
| Sterile surgical tools | Scissors, 2 pairs of tweezers, scalpel | ||
| Heating pad | Leica | 14042321474 | |
| Skin suture | Johnson&Johnson | K890H | Surgical thread, needle |
| Water bath sonicator | Branson 2210 | ||
| BLI camera (IVIS Spectrum) | Perkin Elmer, Alameda | IVISSPE | |
| Living Image software | Perkin Elmer, Alameda | (version 4.2) |
References
- Yapar, N. Epidemiology and risk factors for invasive candidiasis. Ther Clin Risk Manag. 10, 95-105 (2014).
- Tournu, H., Van Dijck, P. Candida biofims and the host: models and new concepts for eradication. Int J Microbiol. 2012, 845352 (2012).
- Taff, H. T., Mitchell, K. F., Edward, J. A., Andes, D. R. Mechanisms of Candida biofilm drug resistance. Future Microbiol. 8 (10), 1325-1337 (2013).
- Mathé, L., Van Dijck, P. Recent insights into Candida albicans biofilm resistance mechanisms. Curr Genet. 59 (4), 251-264 (2013).
- Kucharíková, S., et al. Activities of systematically administered echinocandins against in vivo mature Candida albicans. biofilms developed in a rat subcutaneous model. Antimicrob Agents Chemother. 57 (5), 2365-2368 (2013).
- Kuhn, D. M., George, T., Chandra, J., Mukherjee, P. K., Ghannoum, M. A. Antifungal susceptibility of Candida biofilms: Unique efficacy of amphotericin B lipid formulations and echinocandins. Antimicrob Agents Chemother. 46 (6), 1773-1780 (2002).
- Ramage, G., et al. Liposomal amphotericin B displays rapid dose-dependent activity against Candida albicans biofilms. Antimicrob Agents Chemother. 57 (5), 2369-2371 (2013).
- Andes, D., et al. Development and characterization of an in vivo central venous catheter Candida albicans biofilm model. Infect Immun. 72 (10), 6023-6031 (2004).
- Schinabeck, M. K., et al. Rabbit model of Candida albicans biofilm infection: liposomal amphotericin B antifungal lock therapy. Antimicrob Agents Chemother. 48 (5), 1727-1732 (2004).
- Lazzell, A. L., et al. Treatment and prevention of Candida albicans biofilms with caspofungin in a novel central venous catheter murine model of candidiasis. J Antimicrob Chemother. 64 (3), 567-570 (2009).
- Nett, J. E., Marchillo, K., Spiegel, C. A., Andes, D. R. Development and validation of an in vivo Candida albicans biofilm denture model. Infect Immun. 78 (9), 3650-3659 (2010).
- Wang, X., Fries, B. A murine model for catheter associated Candiduria. J Med Microbiol. 60 (10), 1523-1529 (2011).
- Harriott, M. M., Lilly, E. A., Rodriguez, T. E., Fidel, P. L. J., Noverr, M. C. Candida albicans forms biofilms on the vaginal mucosa. Microbiology. 156 (12), 3635-3644 (2010).
- Dongari-Bagtzoglou, A., Kashleva, H., Dwivedi, P., Diaz, P., Vasilakos, J. Characerterization of mucosal Candida albicans biofilms. PloS One. 4, e7976 (2009).
- Ricicová, M., Kucharíková, S., Tournu, H., Hendrix, J., Bujdáková, H., Van Eldere, J., Lagrou, K., Van Dijck, P. Candida albicans biofilm formation in a new in vivo rat model. Microbiol. 156, 909-919 (2010).
- Kucharíková, S., Tournu, H., Holtappels, M., Van Dijck, P., Lagrou, K. In vivo efficacy of anidulafungin against Candida albicans mature biofilms in a novel rat model of catheter-associated candidiasis. Antimicrob Agents Chemother. 54 (10), 4474-4478 (2010).
- Bink, A., et al. The nonsteroidal antiinflammatory drug diclofenac potentiates the in vivo activity of caspofungin against Candida albicans biofilms. J Infect Dis. 206 (11), 1790-1797 (2012).
- Van de Velde, G., Kucharíková, D., Schrevens, D., Himmelreich, U., Van Dijck, P. Towards non-invasive monitoring of pathogen-host interactions during Candida albicans biofilm formation using in vivo bioluminescence. Cell Microbiol. 16 (1), 115-130 (2014).
- Van de Velde, G., Kucharíková, S., Van Dijck, P., Himmelreich, U. Bioluminescence imaging of fungal biofilm development in live animals. Methods in Molecular Biology. 1098, 153-167 (2014).
- Gahan, C. G. The bacterial lux reporter system: applications in bacterial localisation studies. Curr Gene Ther. 12 (1), 12-19 (2012).
- Doyle, T. C., Nawotka, K. A., Kawahara, C. B., Francis, K. P., Contag, P. R. Visualizing fungal infections in living mice using bioluminescent pathogenic Candida albicans strains transformed with the firefly luciferase gene. Microb Pathog. 40 (2), 82-90 (2006).
- Enjalbert, B., et al. A multifunctional synthetic Gaussia princeps luciferase reporter for live imaging of Candida albicans infections. Infect Immun. 77 (11), 4847-4858 (2009).
- Mosci, P., et al. A novel bioluminescence mouse model for monitoring oropharyngeal candidiasis in mice. Virulence. 4 (3), 250-254 (2013).
- Van Wijngaerden, E., et al. Foreign body infection: a new rat model for prophylaxis and treatment. J. Antimicrob. Chemoth. 44 (5), 669-674 (1999).
- Nobile, C. J., Mitchell, A. P. Regulation of cell-surface genes and biofilm formation by the C. albicans transcription factor Bcr1p. Curr. Biol. 15 (12), 1150-1155 (2005).
