We present an experimental procedure of Candida albicans biofilm development in a mouse subcutaneous model. Fungal biofilms were quantified by determining the number of colony forming units and by a non-invasive bioluminescence imaging, where the amount of light that is produced corresponds with the number of viable cells.
जैविक और / या अजैव सतहों पर कैंडिडा सफेद biofilm विकास अस्पताल में भर्ती रोगियों के लिए एक विशिष्ट खतरा प्रतिनिधित्व करता है। अब तक, सी श्वेत biofilms इन विट्रो में मुख्य रूप से अध्ययन किया गया है, लेकिन इन विवो शर्तों के तहत इस गतिशील प्रक्रिया की बेहतर समझ के लिए एक महत्वपूर्ण आवश्यकता है। हम सी अध्ययन करने के लिए एक Vivo में चमड़े के नीचे चूहे मॉडल विकसित श्वेत biofilm गठन। हमारे मॉडल में, (9 तक) के कई कैंडिडा -infected उपकरणों पशु के पीछे के भाग को प्रत्यारोपित कर रहे हैं। यह हमें एक जानवर में कई स्वतंत्र biofilms अध्ययन करने के लिए अनुमति देता है के रूप में यह केंद्रीय शिरापरक कैथेटर मॉडल प्रणाली पर अमेरिका के एक प्रमुख लाभ देता है। हाल ही में, हम सी अध्ययन करने के लिए इस मॉडल को अनुकूलित BALB / ग चूहों में श्वेत biofilm विकास। इस मॉडल में, सी परिपक्व श्वेत biofilms 48 घंटा के भीतर विकसित करने और ठेठ तीन आयामी biofilm वास्तुकला प्रदर्शित करता है। फंगल biofilm की मात्रा का ठहरावपरंपरागत रूप से विश्लेषण किया पोस्टमार्टम है और मेजबान बलिदान की आवश्यकता है। इस गतिज पढ़ाई प्रदर्शन करने के लिए कई जानवरों के उपयोग की आवश्यकता है, क्योंकि हम अनुलंबीय परिपक्व vivo में अनुवर्ती कार्रवाई सी के लिए गैर इनवेसिव bioluminescence इमेजिंग (BLI) लागू श्वेत हमारे चमड़े के नीचे मॉडल में विकासशील biofilms। सी श्वेत कोशिकाओं सेल दीवार से जुड़ी Gaussia princeps luciferase जीन (gLuc) को व्यक्त करने के लिए इंजीनियर थे। bioluminescence संकेत मापा जा सकता है कि प्रकाश में जोड़ा सब्सट्रेट coelenterazine कि धर्मान्तरित luciferase द्वारा निर्मित है। BLI संकेत explanted कैथेटर से प्राप्त कोशिकाओं की गिनती जैसे लगते थे। विवो biofilm गठन में बढ़ाता के लिए गैर इनवेसिव इमेजिंग के लिए एक बेहतर समझने के लिए, इसके द्वारा योगदान के साथ ही मेजबान रोगज़नक़ बातचीत पर आधारित अध्ययन के लिए इन विवो शर्तों के तहत स्क्रीनिंग और रोधी दवाओं के सत्यापन के लिए तत्काल आवेदन पत्र प्रदान करता है,कैथेटर जुड़े संक्रमण के रोगजनन की आईएनजी।
कैंडिडा सफेद त्वचा पर या जठरांत्र और योनि वनस्पति के एक भाग के रूप में, उदाहरण के लिए, स्वस्थ व्यक्तियों के विभिन्न स्थलों पर पाया जा सकता है जो एक खानेवाला जीव है। हालांकि, में अस्पताल में भर्ती है, और विशेष रूप से रोगियों immunocompromised, यह संक्रमण एक की एक विस्तृत श्रृंखला का कारण बन सकता है। ऐसे व्यक्तियों में, कमजोर प्रतिरक्षा प्रणाली कैंडिडा कोशिकाओं खून में प्रसार करने के लिए और जीवन के लिए खतरा संक्रमण के कारण गहरे ऊतकों पर आक्रमण करने की अनुमति देता है। इसके अलावा, इस तरह के केंद्रीय शिरापरक और मूत्र कैथेटर के रूप में अजैव substrates की उपस्थिति, कृत्रिम हृदय वाल्व और जोड़ों कैंडिडा लगाव 2 के लिए एक आला प्रदान कर सकता है। ऐसे substrates के लिए आसंजन मुख्य रूप से polysaccharides दो से मिलकर, कोशिकी polymeric सामग्री में एम्बेडेड खमीर और hyphal कोशिकाओं की एक परत का प्रतिनिधित्व करता है जो आगे biofilm विकास के लिए एक शर्त है। सी श्वेत कैथेटर -associated संक्रमणउच्च मृत्यु दर के साथ जुड़े रहे हैं। Biofilms के एक सामान्य लक्षण ऐसे azoles 3,4 के रूप में जाना antifungals, को उनकी कमी हुई संवेदनशीलता है। ऐसे echinocandins और Amphotericin बी के लिपोसोमल तैयार करने के रूप में रोधी दवाओं का केवल नए वर्गों, कैथेटर जुड़े संक्रमण 5-7 के खिलाफ सक्रिय साबित हुई। क्योंकि antifungals को biofilm लचीलापन की, चिकित्सकीय दृष्टिकोण बहुत बार कैथेटर को हटाने और एक एकमात्र समाधान के रूप में इसके बाद के प्रतिस्थापन के लिए अग्रणी सीमित हैं।
सी की हमारी वर्तमान समझ के अधिकांश श्वेत biofilm विकास उपर्युक्त उपकरणों, यानी, सिलिकॉन, polyurethane 2 के निर्माण के लिए इस्तेमाल किया अजैव ऐसे polystyrene के रूप में substrates, या प्लास्टिक पर इन विट्रो अध्ययन में से निकलती है। इन मॉडलों को काफी उन्नत कर रहे हैं और संभव के रूप में बारीकी से विवो में स्थिति की नकल करने की कोशिश करते हैं। हालांकि, इन प्रणालियों निरंतर रक्त प्रवाह और टी शामिल नहीं हैवह मेजबान की प्रतिरक्षा प्रणाली। यह एक ऐसी केंद्रीय शिरापरक कैथेटर (सीवीसी) मॉडल 8-10, मौखिक कैंडिडिआसिस 11 के कृत्रिम दांतों मुखशोथ मॉडल और कैथेटर जुड़े candiduria 12 के लिए एक murine मॉडल के रूप में vivo मॉडल प्रणाली के विकास में हुई। इसके अतिरिक्त, सी श्वेत biofilm विकास ऐसी योनि 13 और मौखिक गुहा 14 से उन लोगों के रूप mucosal सतहों, पर विवो में अध्ययन किया गया। हमारी प्रयोगशाला में एक चमड़े के नीचे सी की स्थापना के साथ योगदान Sprague Dawley चूहों 15 की पीठ पर संक्रमित कैथेटर टुकड़े के प्रत्यारोपण पर आधारित है जो श्वेत biofilm मॉडल। इस मॉडल को सफलतापूर्वक डाईक्लोफेनाक और caspofungin 17 के मिश्रित चिकित्सा के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए, दवाओं 5,16 fluconazole के लिए biofilm संवेदनशीलता का परीक्षण और echinocandin करने के लिए हमारी प्रयोगशाला में इस्तेमाल किया गया था। हाल ही में, हम BALB / ग चूहों 18,19 में इस्तेमाल के लिए इस प्रणाली को रूपांतरित किया। मेंविवो मॉडल में एक दूसरे के साथ तुलना में, इस चमड़े के नीचे मॉडल का मुख्य लाभ प्रत्यारोपित कैथेटर टुकड़े के लुमेन अंदर विकसित पशु प्रति एकाधिक biofilms अध्ययन करने की संभावना है।
प्रयोगशाला पशुओं की संख्या को कम करने के लिए, हम सी के विकास का अध्ययन करने के लिए इस मॉडल को ढाल लिया है श्वेत bioluminescence इमेजिंग (BLI) 18,19 का उपयोग करके गैर invasively biofilms। इस विधि पशु बलि से परहेज (हमारे मामले में प्रत्यारोपित कैथेटर का क्षेत्र) ब्याज के क्षेत्र में विशिष्ट BLI संकेत को मापने के द्वारा biofilms यों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, जो एक शक्तिशाली तकनीक, साबित हुई। सी सहित वजह से एक विशिष्ट लक्स ओपेरोन 20 की शुरुआत करने के लिए जीन और bioluminescence प्रतिक्रिया के लिए आवश्यक सब्सट्रेट दोनों व्यक्त कर सकते हैं, जो बैक्टीरिया की तुलना में, के सबसे यूकेरियोटिक जीवों, श्वेत, के साथ मिलकर luciferase जीन की heterologous अभिव्यक्ति पर निर्भर कर रहे हैंऐसे डी luciferin या coelenterazine 21 के रूप में एक विशिष्ट सब्सट्रेट, के बाहरी प्रशासन। शायद की वजह से फंगल सेल की दीवार और सी की उपस्थिति के लिए श्वेत morphogenesis, luciferase एंजाइम के लिए सब्सट्रेट के intracellular वितरण एक मुख्य चुनौती 21 थी। इस समस्या को हल करने के लिए, Enjalbert एट अल। 22 एक तनाव इंजीनियर जहां एक सिंथेटिक सी स्वाभाविक रूप से स्रावित Gaussia princeps luciferase के लिए जीन (gLuc) की श्वेत कोडोन अनुकूलित संस्करण सी करने के लिए जुड़े हुए किया गया था श्वेत PGA59 जीन, एक GPI- कोशिका दीवार प्रोटीन लंगर डाले। क्योंकि कोशिका दीवार पर luciferase की मौजूदगी की वजह से, सब्सट्रेट के intracellular उपलब्धता के विषय में समस्याओं से बचा जा सकता है। यह विशेष रूप से प्रणाली सी की वजह से सतही संक्रमण का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया था श्वेत 22। हाल ही में, BLI भी मुखग्रसनीय कैंडिडिआसिस और उसके संभव की प्रगति का पालन करने के लिए इस्तेमाल किया गया थाई उपचार 23। इस तरह के निष्कर्ष मुक्त जीवित कोशिकाओं लेकिन यह भी डिवाइस से जुड़े संक्रमण की वजह से संक्रमण का अध्ययन करने के लिए एक आशाजनक तकनीक के रूप में BLI के उपयोग का समर्थन।
इस अध्ययन में, हम सी का वर्णन BLI का उपयोग कर पोल्यूरिथेन कैथेटर BALB / ग चूहों में टुकड़े और इसकी मात्रा का ठहराव पर श्वेत biofilm विकास। हम जीवित पशुओं में चूहों में आरोपण और बाद biofilm विकास के बाद आसंजन की अवधि के दौरान पोल्यूरिथेन कैथेटर की इन विट्रो में उपनिवेशवाद का एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं। इसके अलावा सी द्वारा उत्सर्जित BLI संकेत मापने से श्वेत कोशिकाओं, हम भी biofilm फंगल लोड मात्रा का ठहराव के लिए मानक तकनीक के साथ तुलना के लिए इकाइयों के गठन कॉलोनी निर्धारित करते हैं।
मेजबान प्रतिरक्षा प्रणाली के लिए इन विट्रो मॉडल के लिए खाते में नहीं कर सकते हैं कि biofilm गठन में एक आवश्यक कारक है के रूप में माइक्रोबियल biofilms के लिए समर्पित अध्ययन के लिए पशु मॉडल, और विशेष रूप से कृंतक…
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by the KU Leuven PF ‘IMIR’, the FWO Research community on biology and ecology of bacterial and fungal biofilms (FWO: WO.026.11N) and by the FWO project G.0804.11. SK gratefully acknowledges KU Leuven for the PDMK 11/089 fellowship and FWO for the postdoctoral fellowship. We are grateful to Nico Vangoethem for his assistance with preparation of the figures. We would like to acknowledge Celia Lobo Romero for technical assistance during in vivo experimental procedures.
Name of Reagent | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Yeast extract granulated | Merck | MERC1.03753.0500 | |
Bacteriological peptone | Oxoid | LP037B | |
Agar granulated | Difco | 214530 | |
D-(+)-glucose | Fluka | 49159-5KG | |
Phosphate buffered saline | Prepared in the laboratory | for 1L of 10x PBS: 80 g NaCl, 2 g KCl, 14.4 g Na2HPO4, 2.4 g KH2PO4 | |
RPMI1640 with L-glutamine and without sodium carbonate | Sigma | R6504-1L | Prepare according the protocol for Candida albicans drug susceptibility testing |
3-(N-Morpholino)propanesulfonic acid (MOPS) | Sigma | M1254 | MOPS is used to adjust the pH of RPMI medium (pH 7.0) |
fetal bovine serum (FBS) | Sigma | F7524 | |
Polyurethane tripe-lumen intravenous catheter piece (2.4 mm diameter, Certofix Trio S730) | BBraun | CV-15703 | Polyurethane part cut into 1 cm pieces |
Dexamethasone | Fagron SAS, France | 611139 | Immunosuppressant (stock solution 10 mg/ml) |
Ampicillin | Duchefa Biochemie, The Netherlands | A0104 | Antibacterial prophylaxis |
Ketamine 1000 | Pfizer | 804 119 | Anesthetic |
Domitor | Pfizer | 134737-1 | Anesthetic |
Antisedan | Pfizer | 134783-2 | Reversal of anesthesia |
Xylocaine gel (2%) – this is Linisol | AstraZeneca | 352 1206 | Local anesthetic for the skin |
Terramycin/ polymyxin-b ophthalmic ointment | To prevent drying and infection of eyes | ||
Coelenterazine | Prolume (Nanolight) | NF-CTZ-FB | Light sensitive agent (must be kept in the dark) |
Iodine isopropanol (1%) | 3M™ DuraPrep™ | Disinfectant for the skin | |
0.5 % chlorhexidine in 70 % alcohol. | Cedium | Disinfectant for the skin | |
Equipment | |||
Cell counting chamber | |||
Insulin syringes (0.3 ml) | Terumo Myjector 29G | 324826 | For injection of coelenterazine |
Electric razor | For small animals | ||
Sterile surgical tools | Scissors, 2 pairs of tweezers, scalpel | ||
Heating pad | Leica | 14042321474 | |
Skin suture | Johnson&Johnson | K890H | Surgical thread, needle |
Water bath sonicator | Branson 2210 | ||
BLI camera (IVIS Spectrum) | Perkin Elmer, Alameda | IVISSPE | |
Living Image software | Perkin Elmer, Alameda | (version 4.2) |