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Medicine

生物発光イメージングが続くマウス皮下モデルにおける医学関連の異物にカンジダ·アルビカンスバイオフィルム発展

doi: 10.3791/52239 Published: January 27, 2015

Abstract

生物的および/ ​​または非生物表面上のカンジダ·アルビカンスのバイオフィルムの開発は、入院患者のための具体的な脅威を表します。これまでのところ、C.アルビカンスのバイオフィルムは、 インビトロで 、主に研究されてきたが、 インビボ条件下 、この動的なプロセスをよりよく理解するための重要な必要性がある。私たちは、Cを勉強するin vivoでの皮下ラットモデルを開発しましたalbicansのバイオフィルム形成 。我々のモデルで、(9までの)多数のカンジダ感染したデバイスは、動物の背中部分に注入される。それは私たちが一匹で複数の独立したバイオフィルムを研究することができますように、これは中心静脈カテーテルのモデルシステムを介して私たちに大きな利点を提供します。最近、我々はC.を研究するこのモデルを適応BALB / cマウスにおけるアルビカンスバイオフィルムの発達。本モデルで、C成熟アルビカンスバイオフィルムは48時間以内に発症し、典型的な3次元バイオフィルムのアーキテクチャを示しています。真菌のバイオフィルムの定量化伝統的に死後に分析し、ホスト犠牲を必要としている。これは速度論的研究を行うために多くの動物を使用する必要があるため、我々は、長手方向に成熟で、生体内フォローアップまでの非侵襲的生物発光イメージング(BLI)を適用私たちの皮下モデルで開発アルビカンスバイオフィルム。C. albicansの細胞は細胞壁に付着ガウヨモギルシフェラーゼ遺伝子(Glucを発現するように操作した。生物発光シグナルを測定することができる光に加え、基質セレンテラジン変換ルシフェラーゼによって生成される。 BLI信号が外植カテーテルから得られた細胞数に似ていた。 in vivoでのバイオフィルム形成定量化するための非侵襲的イメージングは、より良い理解するために、ここに貢献だけでなく、宿主-病原体相互作用に基づいて、研究のためのインビボ条件下スクリーニングし、抗真菌薬の検証のための即時のアプリケーションを提供し、カテーテル関連感染症の病因のる。

Introduction

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カンジダは皮膚や消化管及び膣内フローラの一部として、たとえば、健康な個体の異なるサイトで見ることができるの共生生物、ある。しかし、入院、および特に患者の免疫無防備状態は、感染1の広い範囲を引き起こす可能性がある。そのような個体では、免疫力が低下し、 カンジダ細胞が血流に普及し、生命を脅かす感染を引き起こすより深い組織に侵入することができます。また、中心静脈および尿道カテーテルなどの非生物基質の存在は、人工心臓弁、関節、 カンジダアタッチメント 2のためのニッチを提供することができる。そのような基材への密着性は、主に多糖類2からなる、細胞外の高分子材料に埋め込 ​​まれた酵母と菌糸細胞の層を表し、さらにバイオフィルム開発のための前提条件である。C.アルビカンスカテーテル -関連の感染症高い死亡率と関連している。バイオフィルムの一般的な特徴は、そのようなアゾール3,4-として知られている抗真菌剤、に彼らの減少した感受性である。このようなエキノカンジンおよびアンホテリシンBのリポソーム製剤などの抗真菌薬の唯一の新しいクラスは、カテーテル関連感染症5-7に対して活性であることが判明した。そのため抗真菌薬にバイオフィルムの回復力のため、治療的アプローチは、非常に多くの場合、カテーテルの除去およびソールソリューションとして、その後の交換につながる、制限されています。

Cの私たちの現在の理解の大半albicansのバイオフィルムの発達は、上述したデバイス、 すなわち、シリコーン、ポリウレタン2の製造に用い、非生物ポリスチレン等の基板、またはプラスチック上のin vitro研究に由来する。これらのモデルは非常に進んでいるし、可能な限り生体内での状況を模倣しようとする。しかしながら、これらのシステムは、連続的な血流及びtを含まない彼のホスト、免疫系。これは、中心静脈カテーテル(CVC)モデル8-10、口腔カンジダ11の義歯の口内炎モデルおよびカテーテル関連カンジダ12用のマウスモデルとしてのin vivoモデル系の開発をもたらした。さらに、C. albicansのバイオフィルムの開発は、膣13と口腔14からのものとして粘膜表面上の生体内で検討した。私たちの研究室では、皮下C.の設立で貢献Sprague Dawleyラット15の背面に感染したカテーテル片の移植物に基づいているアルビカンスバイオフィルムモデル。このモデルは、成功したフルコナゾールにバイオフィルムの感受性をテストし、薬5,16をエキノカンジン、ジクロフェナク及びカスポファンギン17の組合せ療法の効果を研究するために我々の研究室で使用された。より最近では、我々は、BALB / cマウス18,19で使用するためにこのシステムを適合される。でin vivoモデル他との比較が、この皮下モデルの主な利点は、埋め込 ​​まれたカテーテル片を内腔の内側に開発動物ごとに複数のバイオフィルムを研究する可能性がある。

実験動物の数を減らすために、我々は、Cの開発を研究するためにこのモデルを適応しているアルビカンスバイオフィルム非侵襲的に生物発光イメージング(BLI)18,19を使用します。この方法は、動物の犠牲を回避する、(我々の場合に移植カテーテルの面積)は、関心のある領域における特定のBLIシグナルを測定することによって、バイオフィルムを定量するために用いることができる強力な技術であることが判明した。 C.などにより、特定のluxオペロン20の導入遺伝子および生物発光反応に必要な基質の両方を発現することができる細菌の比較では、ほとんどの真核生物、 アルビカンスは、と結合し、ルシフェラーゼ遺伝子の異種発現に依存している例えば、D-ルシフェリンまたはセレンテラジン21などの特定の基質、の外用投与。おそらく、真菌細胞壁およびCの存在に起因しアルビカンスの形態形成、ルシフェラーゼ酵素の基質の細胞内送達は、主な課題21でした。この問題を解決するために、Enjalbert 22は、合成C.株を設計し自然分泌型ガウヨモギルシフェラーゼ遺伝子(GLUC)アルビカンスコドン最適化バージョン 、C。に融合させたアルビカンスPGA59遺伝子は、GPI-は、細胞壁アンカータンパク質。なぜなら、細胞壁でのルシフェラーゼの存在、基質の細胞内アベイラビリティに関する問題を回避することができる。この特定のシステムはC.によって引き起こされる表面的な感染症を研究するために使用したアルビカンス 22。ごく最近、BLIは、また、口腔咽​​頭カンジダ症およびそのpossiblの進行を追跡するために使用された、電子処理23。このような所見は、自由生活細胞だけでなく、デバイス関連感染によって引き起こされる感染症を研究するための有望な技術としてBLIの使用をサポート。

本研究では、Cを記述するBLIを使用したポリウレタンカテーテルBALB / cマウスでピースとその定量化にalbicansのバイオフィルムの開発。私たちは、生きた動物のマウスに移植すると、その後のバイオフィルムの開発に続く接着の期間中にポリウレタンカテーテルのin vitroでの植民地化の詳細なプロトコルを提供する。別にC.によって放出されるBLI信号を測定するからアルビカンス細胞は、我々はまた、バイオフィルムの真菌負荷の定量化のための標準的な手法との比較のためにコロニー形成単位を決定する。

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Protocol

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注:全ての動物実験は、KUルーベン(プロジェクト番号090/2013)の倫理委員会によって承認された。 KU Leuvenの動物保護ガイドラインに従って動物を維持します。

1. C.アルビカンスの成長

  1. 二十四時間、動物実験開始前に、酵母抽出物の造粒物10g、細菌学的ペプトン20g及び造粒寒天を15g添加することにより、YPDプレートを準備する。 Milli-Q水とオートクレーブと900ミリリットルのボリュームを構成する。
  2. 無菌の40%のグルコースの50ミリリットルを追加します。完全に混合し、ペトリ皿に注ぐ。冷却して凝固さ寒天プレートにしておきます。
    注:本研究では、二つの株、すなわち野生型C.を使用アルビカンス SC5314 - GLUCネガティブ(WTと呼ぶ)歪みとC.野生型Cである。 アルビカンス SKCA23株、 SKCA23- Aという名前のこの株(.IN Clp10 :: Act1p-gLUC59プラスミド22で形質転換アルビカンス SC5314CTgLuc)Glucを(このプロモーターは、真菌の成長ならびに菌糸段階、酵母中で活性である)ACT1(アクチン)プロモーターの制御下にある内因PGA59遺伝子に融合した。この株は、教授のパトリック·ヴァンDijck、ルーヴェンカトリック大学、ルーヴェン、ベルギーの研究室から要求することができる。プラスミドClp10 :: Act1p-gLUC59プラスミド22は親切に教授C. D'Enfert、パスツール研究所、パリ、フランスから寄贈されました。
  3. 、-80℃でグリセロールストックと店舗の両方での株の維持。
  4. YPDプレート上の任意の実験ストリーク株に先立ち。 37℃で一晩プレートをインキュベート。

2.カテーテルの小品準備

  1. 実験の前に、必要とされているどのように多くのカテーテルを決定します。これは、マウス当たり6カテーテル片(左3カテーテルおよび動物( 図2Aの右側の3カテーテル)まで注入することが可能である。
  2. 二十四時間後、動物の手術の前に、パックを開く生物学的安全キャビネットの下トリプルルーメンカテーテルを含む年齢。無菌のピンセットを持つすべての不要な部分を削除し、滅菌メスでカテーテルに取り付け部分をカット。プラスチックパッケージの下に定規を置き、定規の目盛り(図1)によると、正確に1cmのポリウレタンカテーテル片をカット。
    注:これは、カテーテル片のこのタイプの燐光とBLI 18,19に適していないことを言及することが重要である。
  3. 2ミリリットルのマイクロチューブに15カットカテーテル片(ステップ2.2)の最大を置きます。常に密着性の期間の後、デバイスに取り付けカンジダ細胞の量を列挙するために使用されている余分3枚を準備。
  4. 100パーセントウシ胎児血清(FBS)の約1.8ミリリットルと補足カテーテル。
  5. 激しくボルテックスし、100%のFBSの追加の100〜200μlを添加する。完全に血清を持つすべてのカテーテルの部分をカバーしています。
  6. 37℃で一晩インキュベートする。

    3.動物および免疫系の抑制

    1. 標準の食料と水を自由に自由にアクセスできる個別に換気フィルタートップケージにメスのBALB / cマウス(生後約8週間)してください。
    2. 動物の飲料水にデキサメタゾン(0.4ミリグラム/ L)を添加することにより、動物の手術の前に、免疫系の24時間の抑制を開始する。ホストの任意の細菌汚染を避けるために、抗生物質、例えば 、アンピシリンナトリウム粉末(0.5グラム/ L)を飲料水を補う。
    3. (最大6日間まで)全体の実験中の動物の免疫抑制してください。

    4.上のエクスビボC.アルビカンスの接着FBSでコーティングされたポリウレタン基質

    1. 新鮮な1.5ミリリットルのマイクロチューブに各血清でコーティングされたカテーテルピースを転送します。
    2. いくつかのC.は削り取るアルビカンス細胞をYPDプレート(ステップ1)上で増殖させ、1mlのPBSでそれらを中断する。
    3. 缶を希釈する別々のマイクロ遠心チューブ内:ジダ細胞(100 1)。希釈されたサンプルの10μlのを取り、細胞計数室でそれを適用する。少なくとも16小さな正方形を数える。
    4. 5×10 4細胞/ mlの最終濃度になるようにRPMI 1640培地中のカンジダ·セル(個別株)を準備する。
    5. 各血清でコーティングされたカテーテル片に細胞懸濁液1mlを加える。
    6. 激しくボルテックスし、カテーテルが培地中に沈め、トップ上に浮いていないことを確認。
    7. 90分間37℃(接着の期間)にカテーテルをインキュベートする。
    8. 無菌のピンセットでカテーテルを取り出し、1mlのPBSで二回洗っ。このステップの間に洗浄流体は非常に優しくカテーテルのフラッシュ中に垂直位置にカテーテルを保つことによって内腔を通って行くことを確認してください。重要なことは、付着した細胞の除去につながる可能性が強い流れを使用しないでください。
    9. TUごとに1枚(きれいな微量遠心チューブにそれぞれ洗浄したカテーテルを転送)である。
    10. 氷の上に置き、手術までそこに保つ。

    5.麻酔

    1. メデトミジンの100μL(1mg / ml)をし、無菌生理食塩水の825μlのケタミンの75μlの(100ミリグラム/ ml)を混合することによって麻酔を準備します。 45〜60 mg / kgをケタミンおよび0.6〜0.8 mg / kgをメデトミジンの用量で、その結果、10グラムの体重あたりの麻酔薬カクテルの、腹腔内(IP)60〜80μLを管理します。
    2. 麻酔の逆転のために、を0.5mg / kgの用量で、その結果、解毒剤として、腹腔投与、4.95ミリリットルの生理食塩水に10g体重あたり100μlを50μlのアチパメゾール(5 mg / mlの)で希釈する。
    3. 麻酔の注射後、別々のケージに動物を配置し、それが完全に眠っているのを待ちます。
    4. 光肌のピンチとつま先のピンチすることによって、動物の適切な麻酔を確認して、皮膚への損傷を引き起こさない。いずれの観察運動は、動物が十分に手術を行うために麻酔をかけていないことを示します。このような場合は、COUを待つ長い動物までの分のPLEは、皮膚や足指のピンチの際に動きの兆候を示していない。

    6.動物の手術

    1. 転送は、加熱パッド上に置いクリーン組織にケージから動物を麻酔し、37℃に予め加温した( 図2A(1))。
      注:安価な代替は、電気的に加熱毛布を使用することです。これは、動物の手術前に電子レンジで暖機しなければならない等温パッドを使用することも可能である。
    2. 目に眼軟膏を適用します。
    3. 電気かみそりで動物の腰を剃る。すべての動物の毛を削除して、クリーンな組織上の動物を転送する。 (1%のヨウ素イソプロパノール又は70%アルコール中の0.5%クロルヘキシジンを、 例えば )皮膚を消毒し、約1分間乾燥消毒領域を残す( 図2A(2))。
    4. 皮膚(左に1つ、動物の右側に1つ)の小さな切開する(約0.5– 1センチ)( 図2A(3))。
    5. 2回の皮下トンネルを作成するためにハサミで皮下組織を解剖。各トンネルは約1.5センチと1cm幅にする必要があります。
    6. 各トンネルで、以前にカンジダに感染して3カテーテル片を、挿入します。カテーテルは、水平配置で隣同士に嘘ことを確認し、彼らは全部で6カテーテルフラグメントの移植可能にするためにお互いをカバーしていないこと( 2a (4))。
    7. 縫合糸で切開を閉じます。また、傷口を閉じるためにDERMABONDを使用しています。
    8. 70%アルコール中で、ヨウ素イソプロパノール(1%)で0.5%クロルヘキシジンで非常に穏やかに創傷を消毒する。
    9. に直接傷に局所麻酔薬(キシロカインゲル、2%)を適用します。
    10. 10gの体重を腹腔内に100μl:麻酔の逆転(プロトコル5、ステップ2)を管理する。
    11. きれいなケージに移し動物は、以前に加熱板上に置いた。動物を維持動物が完全に目を覚ましになるまで別々と暖かい。一方、次の動物の動作やインプラントを続行。一旦全ての操作動物が完全に目を覚ましている。 1ケージに移す。定期的に動物を監視します。

    7.生物発光イメージング:セレンテラジン(CTZ)の調製G.、基板ヨモギルシフェラーゼ

    1. 酸性化したエタノールに5 mg / mlのCTZを溶解するか、製造元の指示に従ってにより新鮮なセレンテラジン(CTZ)ストック溶液を準備します。
    2. 滅菌PBSで原液を1:10に希釈して1.2 mMの作業溶液を準備します。
      注:カテーテルを囲む領域の皮下に100μlのCTZ作業溶液を注入。 CTZの皮下注射用のインスリンシリンジに使用します。
    3. 常に暗闇でCTZを保つ( 例えば 、アルミホイルでCTZを含むマイクロチューブをカバー)。実験の期間中、-80℃で保存溶液を保管してください。
    4. 8.生物発光イメージング

      1. BLIカメラを初期化します。
      2. インダクションボックスを使って動物を麻酔。 2から3パーセントで、酸素中のN 2 O / O 2、または空気をイソフルランの混合ガスを使用してください。
      3. 誘導後、インダクションボックス内および1.5から2パーセントでイメージングチャンバー内の麻酔の維持。
      4. イメージングセッションを開始する前に、10cmのFOVに対応する位置Aにイメージングプレートを置く。確認ボックスに眠っている動物を配置することによって麻酔コンセントや動物の右の位置という。
      5. 動物は、カメラの真下をFOVに、所望の撮影位置になるまで、いくつかの写真を撮る。
      6. 2のインスリン注射器CTZ作業溶液をそれぞれ含有する100μlのを準備します。
      7. ベンチに一匹を置き、ガス麻酔を提供するノーズコーンを介して眠ってそれを維持する。
      8. カテーテルは皮下に、周囲の所定の位置に注射器の針が持参し注入するCTZ同時にカテーテルの上に。
      9. 注射直後、カメラボックス内の暖かいプレートに動物を配置し、生物発光画像取得を開始します。
      10. 最大信号強度に到達するまで20〜60秒(信号強度に応じて)の範囲の取得時間との連続した​​スキャンを取得する。次のフレームの取得中に、このROIを通じて光子束を各カテーテルトリオの上にROIを配置し、測定することにより、先に取得したフレームのBLIの信号強度を測定する。
      11. 次の動物(S)について、ステップ7から繰り返します。
      12. イメージングの後、彼らのケージに動物を返す。バイオフィルム形成の長手方向の、非侵襲的フォローアップのために実験中BLIを繰り返す。
      13. リビングイメージのソフトウェアを使用してBLIデータを分析します。各カテーテルトリオの上に固定サイズの長方形のROIを配置し、各ROIを通じて光子束(輝き)を測定する。すべての動物のためにこれを繰り返します。
      14. レポート毎秒光子束として各カテーテルトリオのBLI信号強度。平均と各グループの毎秒の光子束のSDをプロットし、対数スケールでBLIデータを表す。ログに10変換されたデータを統計分析を実行します。

      9.カテーテル外植

      1. 1mlのPBS、各カテーテル装置のための1つを含むマイクロ遠心チューブを準備し、氷上でそれらを保つ。
      2. 頸椎脱臼により動物を安楽死させる( 図2(b)(1))。
      3. 70%アルコール中で、ヨウ素イソプロパノール(1%)で0.5%のクロルヘキシジンと背中の皮膚を消毒する。
      4. カテーテル上記切開(約3cm)を確認します。
      5. 皮下組織を切断し、カテーテル断片を、滅菌ピンセット( 図2B、(2))を用いて、皮下組織の下から1枚ずつを削除します。
      6. 垂直位置に優しくカテーテルを処理し、滅菌PBSの1ミリリットルで二回それを洗う。それぞれにカテーテルを置き(ステップ1で調製)を別々のマイクロ遠心チューブに一枚​​。

      コロニー形成単位数(CFUを)と結果の統計分析によって10の定量バイオフィルム関連細胞

      1. 超音波処理カテーテルは、以前に水浴超音波処理40,000 Hzで10分間PBSを1mlに入れ、氷の上に置きます。
      2. 超音波処理の後、精力的に氷上で再び30秒と場所ボルテックス。
      3. PBS900μlのを含む二つの追加マイクロ遠心チューブを準備します。
      4. あなたの元のサンプル(カテーテルが含まれている1)から100の希釈し、氷上ですべてのマイクロチューブを保つ:1:10 1を加えます。
      5. 元のサンプルのプレートを100μl、1:10〜1:重複でYPD寒天プレート上で100希釈液。
      6. 37℃で2日間プレートをインキュベートし、CFUをカウント。
      7. YPD寒天プレート上で生育したコロニー(コロニーの計数可能量、最大300個のコロニー/プレート)をカウントし、適切DILUでそれらを掛けるションファクター(1X-オリジナル、10倍または100倍希釈)。さらに、カテーテルを含む1mlチューブにコロニーの最終量に相当する、10倍、各カテーテル片を掛け。 10セル/標準偏差(SD)を有するカテーテルピースを記録するためにコロニーの最終量を持参してください。平均±SDとしてデータを発現する。
      8. 上記の計算と統計分析を実行するために、スプレッドシート、および/または統計プログラムに各カテーテルおよび特定のグループのすべての値を置きます。比較するために、特定のグループを示す、 すなわち WT 変異体または2日 。 6日バイオフィルム形成とLOG10変換されたデータにテューキー事後テストで対応のないt検定と分散分析を行う。
        1. p値によって有意水準を発現する。として表されるp値 <0.05は、以下の場合は、この研究では有意性を示す:* P <0.05、** P <0.005、*** P <0.0005。

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Representative Results

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この研究では、マウスにおけるin vivo C. albicansのバイオフィルム開発中にカテーテルインプラントと植片の外科的手順を示しています。さらに、我々は古典的なCFUの列挙ではなく、またBLIによってのみならず、成熟したバイオフィルムの定量化を表示します。

図1Aに示すように、非燐光ポリウレタンカテーテル片1cmのデバイスに切断し、その後血清でコーティングした。それはカンジダ細胞は非血清コーティングされたインプラント15と比較して、より迅速に基板に付着することを可能にするため、この手順は非常に重要です。これは、任意の温度に、その前には言及することは重要でアルビカンスの実験は、まず私たちのデバイス18のバックグラウンド発光を記録した。装置の高燐光gLuc-から特定 ​​の生物発光信号強度と信号動態の評価を妨害するため、この手順はすべてのBLIを実行する前に、非常に重要です発現細胞。次に、C.アルビカンス細胞を血清でコーティングされたカテーテル片と共にインキュベートする。カテーテルフラグメントはその後皮下切開( 図2A)の後動物の背中部分に注入される。このではセットアップ、生体内で 、2切開は、各切開内側皮下トンネルの形成に続いて(右とマウスの背中の左側に別の1に1つずつ)が実行される( 図2A(3))。その後、以前カンジダ細胞を感染させた3つのデバイスは、各事業所の内部に注入された( 図2A(3および4))されている。これはセットアップ私たちは動物当たり6バイオフィルムまで勉強することができます。これは、2つの事業所は、同じ動物において、例えば、野生型及び変異体について、目的の2つの異なる株によるバイオフィルム形成を研究する可能性を提供することに注目すべきである。 図2Bは、デバイスの外植片およびその後の洗浄工程の前にカテーテルを含む創傷を表示する。動物の背中部分の内側に開発バイオフィルムは、生物発光シグナルの測定のために評価した。関心領域(ROI)を特徴付ける矩形とともに生物発光信号を表示する代表的な動物の一つが図3に示されている。最後のBLI時点の後、カテーテルは、外植された超音波処理し、続いてボルテックスし、さらにバイオフィルム形成細胞について評価するCFUをすることによって定量化。バイオフィルムの発生および外植は、 図4Aに示された後、データは、各カテーテル片から得られたログ10のCFUを示す分析。次のように、CFUのは、BLIの信号強度と比較したこれらのデータは、 図4Bに示されている。そこに野生型株では、ほとんど光が生成されるのに対し、移植後の九十分では、明確なBLI信号がACTgLuc発現性バイオフィルムによって製造される。 ACTgLucの発現性から検出された光の強度生物膜は、同じマウス( 図4C)以下ここで、形成しているとして、バイオフィルムが大幅に増加している。光のこの増加は、バイオフィルム( 図4A)あたりのCFUの増大と同じ傾向に従う。実験では、我々はまた、(ないルシフェラーゼを発現するように遺伝子操作)正常な野生型株は、基板の添加の際に、光の生成をもたらすことを観察した。しかしながら、光子束は、操作された株について得られたものよりも有意に低かった。

総合すると、我々のデータは、BLIがC.に監視し、定量化するインビボの成熟するパワフル技術であることを示している皮下マウスモデルにおけるalbicansのバイオフィルム形成

図1
図1:ポリウレタンデバイスの製造 1cmの小片に切断し、カテーテルのポリウレタン部分プラスチック製のPOCカテーテルをパッケージから除去され除くKET含むカテーテルは、滅菌状態とすべての部品の下に開いている。第二に、プラスチック製のポケットの下に定規を置き、正確に1cmのポリウレタン片をカット。このような装置は、その後のマイクロ遠心チューブ(最大15個/チューブ)に分配し、37℃で終夜インキュベートした100%のウシ胎児血清に沈められる。

図2
図2:動物の手術中の主な手順。 (A)は、カテーテル、インプラントの手順。 (1)プレイスには、紙含有組織暖かいパッド上で動物に麻酔をかけ、眼に眼軟膏に適用します。 (2)背中や消毒の下部を剃る。 (3)左のと背中の右側に皮膚を介して2つの小さな(約0.5センチ)の切開を作成します。各切開の中に皮下トンネルを作成して、内側の3カテーテルを配置。 (4)woは閉じ暖かいパッド上の縫合糸および場所の動物とウントが。回復カテーテル抜去の(B)の手順と。 (1)場所はパッドの上に動物を犠牲にし、運営側含むカテーテルを消毒。右のカテーテルの上に傷をカット。 (2)静かに各カテーテルを取り出し、1mlのPBSで二回洗浄します。独立した微量遠心チューブに配置してください。

図3
図3:。生物発光信号測定 では、生体内のBLI画像1代表的なマウスからはバイオフィルムの開発の6日後に画像化した。シグナル強度の定量化は、各ROI介して、毎秒の光子束の計測に続いて、カテーテル周囲に(矩形)興味(関心領域)領域を置くことによって行われる。

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図4コロニー形成単位(CFUを)によるとBLIによる成熟カンジダ·アルビカンスバイオフィルムの定量。 (a) インビボで成熟アルビカンス SKCA23- ACTgLucとSC5314(WT)90分、2日間とバイオフィルムの開発の6日後にはLog10 CFUのによるバイオフィルムの定量化。(B)SKCA23- ACTgLucによってC.によって形成されたin vivoでのバイオフィルムからの生物発光信号強度の定量化アルビカンス WT。信号は、90分(接着の期間)、2日目およびバイオフィルムの発達の6日後に測定した。対照として、我々は、非保菌カテーテルを移植し、それが皮下CTZを注射したマウスを使用していました。これらのマウスで得られた光子束は、私たちの背景信号(BG)になる。データは、平均±標準偏差(SD)として表した。次のように統計的有意性は示されます。* P <0.05、** P <0.005、*** P <0.0005。 インビボにおける野生型C.を含むカテーテル断片を移植した一つの代表的なマウスの生物発光画像アルビカンス左側ACTgLucに細胞が右側に発現細胞。マウスは、3つの異なる期間、 すなわち 90分、2日目および6日カテーテル断片の移植後に画像化した。

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Discussion

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宿主免疫系は、in vitroモデルで説明することはできないバイオフィルム形成に必須の因子であるので、微生物バイオフィルム専用の研究のための動物モデル、及び特に齧歯類モデルの使用は、非常に重要である。本研究では、比較的簡単な皮下C.を記述簡単に研究室に採用することが可能と強力な技術的なスキルを必要としないアルビカンスバイオフィルムマウスモデル、。このモデルは、もともとラット24表皮ブドウ球菌のバイオフィルム形成を研究するために開発されました。

提示されたモデルにおいて、無コーティングされたポリウレタンカテーテルは、接着の期間(90分、37℃)中にカンジダ細胞をex vivoでチャレンジした。この最初のインビトロのステップがあるため、バイオフィルム感染過程の非常に最初の段階で、免疫系の欠如の制限要因として考えられるかもしれない。粘着力の前に続いてカテーテルインプラントは、非デバイスに関連する細胞は洗浄により除去される。接着期間の後、洗浄工程を回避する装置に関連する細胞の制御不能な量を生成することができる。そのためこのような理由により、私たちは前にインプラントにカテーテルを洗浄するために提案するため、付着した細胞から、その開発を開始すること。この初期接着期間の後、カテーテルは、15ルーメンカテーテルと一緒に広がって約2.0〜2.5ログ10のCFU /デバイスが含まれている。この段階で、カンジダは、基板上に取り付けられている発芽管を形成する。

免疫系が頻繁に侵害された人の入院患者の状況に似ているために、私たちは私たちの皮下モデル系15でラットを免疫抑制さ。ラットの免疫系の部分的な障害は、デバイスのインプラントおよびバイオフィルムの発達の期間中の前から取得バイオフィルム形成細胞の増加した再現性が得られ同じホストにも、追加の動物から得られたデバイスから移植されたカテーテル。そのため、これらの知見に我々は、カテーテルインプラントの前に、また、バイオフィルム形成の期間中に、マウスを免疫抑制することをお勧め。しかし、我々の結果は、免疫適格マウスにおける変動はバイオフィルムに宿主免疫系の役割を研究するためのマウスモデル系も適していることになるれたラットで観察されるものに比べてはるかに少ないことを示している。当初のラットモデルにおいて、また、マウスに変換同じモデルにおいて、 成熟C.アルビカンスバイオフィルムは2と6日15,18,19間で同様CFUの量とバイオフィルムのアーキテクチャによって実証48時間以内に発症する。

皮下バイオフィルムモデルは正常にいくつかの変異体15によりバイオフィルムの発達を追跡するために使用した。これは、ノビレによって以前に示されている。25そのC.アルビカンスBCR1Δ/Δは失敗しましたBCR1中心静脈カテーテル(CVC)モデル内のフォームバイオフィルム。この株は、CVCモデルで見つかった表現型の変化は、皮下モデル15で再現することができているという事実に私達の皮下モデルポインティングに初歩的なバイオフィルムの特徴を示した。

他の既存のモデルと比較して、 すなわち 、CVCモデルまたは義歯口内炎モデル8,9,11は 、皮下モデルは、それによりバイオフィルムの研究に必要な動物の数を減少させる、一匹の動物から得られた多数のカテーテル片におけるバイオフィルム発達をたどることを可能にする。これらの利点にもかかわらず、欠点は、バイオフィルム中の栄養素の特定の欠乏につながる可能性の血流が不足することができる。そのため、栄養の供給と環境条件の期間中、皮下モデルは、静脈内カテーテル上に形成されたものよりも人工関節、音声人工器官とペースメーカーに開発したデバイス関連感染症への関連である。さらに重要なことさらに最も重要なことは、コストを削減し、BLI、必要な動物の数は、この動物モデル両立マウスへのラットの皮下バイオシステムを変換する。さらに、マウスへのラットモデルを変換することは、カテーテル関連感染の研究に関連する宿主因子を研究するためのトランスジェニックマウスモデルの使用を可能にする。

生きた動物にバイオフィルムを定量化するためにBLIを使用することの主な利点は、この方法の非侵襲的な文字ではなく、感染症の発症に関する動的な情報を提供する能力だけではなくある。本研究では、GLUCはC.の細胞壁で発現アルビカンスは。生体内での生物発光シグナルの検出のために重要である基質セレンテラジン、とのより良いアクセシビリティと直接相互作用を許可されたヴァンデヴェルデ 18の研究では、Cから生物発光信号に追従することができましたフォーリンエクス上で開発アルビカンスバイオフィルムin vitroでの GN体。 BLIの信号強度が強く、追加のバイオフィルムの定量化技術、 すなわち、CFUを決定し、XTT還元アッセイから得られたデータと一致した。これらの結果の横に、我々は、in vivoでのバイオフィルムからの生物発光シグナルは、外植されたバイオフィルムから回収されたバイオフィルム関連細胞の量と一致したことを示した。さらに、ヴァンデヴェルデらは 18 BLIは、野生型によって、またCでのバイオフィルムの発達を追跡するために使用することができることを実証同時に同じ動物でアルビカンス bcr1Δ/bcr1Δ(バイオフィルム欠損株)。このような所見は強く、同じ動物においてバイオフィルムの発達と感染の時間経過の評価に専念研究中にBLIの使用をサポート。

これにより、我々は、その後のモニタリングOとカンジダ感染した機器のin vivoでの皮下移植のための実験手順を説明したBLIによるF in vivoでのバイオフィルムの開発。まとめると、BLIは、私たちは、データ分析の各時点での動物の犠牲を回避時間にわたって感染を追従させる信頼できる技術であることを示した。

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Disclosures

著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Yeast extract granulated Merck MERC1.03753.0500
Bacteriological peptone Oxoid LP037B
Agar granulated Difco 214530
D-(+)-glucose Fluka 49159-5KG
Phosphate buffered saline  Prepared in the laboratory for 1L of 10x PBS: 80 g NaCl, 2 g KCl, 14.4 g Na2HPO4, 2.4 g KH2PO4
RPMI1640 with L-glutamine and without sodium carbonate  Sigma R6504-1L Prepare according the protocol for Candida albicans drug susceptibility testing 
3-(N-Morpholino)propanesulfonic acid (MOPS) Sigma M1254 MOPS is used to adjust the pH of RPMI medium (pH 7.0)
fetal bovine serum (FBS) Sigma F7524
Polyurethane tripe-lumen intravenous catheter piece (2.4 mm diameter, Certofix Trio S730)  BBraun CV-15703 Polyurethane part cut into 1 cm pieces
Dexamethasone Fagron SAS, France 611139 Immunosuppressant (stock solution 10 mg/ml)
Ampicillin  Duchefa Biochemie, The Netherlands A0104 Antibacterial prophylaxis
Ketamine 1000 Pfizer 804 119 Anesthetic
Domitor Pfizer 134737-1 Anesthetic
Antisedan Pfizer 134783-2 Reversal of anesthesia
Xylocaine gel (2%) - this is Linisol AstraZeneca 352 1206 Local anesthetic for the skin
Terramycin/ polymyxin-b ophthalmic ointment To prevent drying and infection of eyes
Coelenterazine  Prolume (Nanolight) NF-CTZ-FB Light sensitive agent (must be kept in the dark)
Iodine isopropanol (1%) 3M™ DuraPrep™  Disinfectant for the skin
0.5 % chlorhexidine in 70 % alcohol.   Cedium Disinfectant for the skin
Equipment
Cell counting chamber
Insulin syringes (0.3 ml) Terumo Myjector 29G 324826 For injection of coelenterazine
Electric razor For small animals
Sterile surgical tools Scissors, 2 pairs of tweezers, scalpel
Heating pad Leica 14042321474
Skin suture Johnson&Johnson K890H Surgical thread, needle
Water bath sonicator Branson 2210
BLI camera (IVIS Spectrum)  Perkin Elmer, Alameda IVISSPE
Living Image software  Perkin Elmer, Alameda (version 4.2) 

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生物発光イメージングが続くマウス皮下モデルにおける医学関連の異物に<em>カンジダ·アルビカンス</em>バイオフィルム発展
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Kucharíková, S., Vande Velde, G., Himmelreich, U., Van Dijck, P. Candida albicans Biofilm Development on Medically-relevant Foreign Bodies in a Mouse Subcutaneous Model Followed by Bioluminescence Imaging. J. Vis. Exp. (95), e52239, doi:10.3791/52239 (2015).More

Kucharíková, S., Vande Velde, G., Himmelreich, U., Van Dijck, P. Candida albicans Biofilm Development on Medically-relevant Foreign Bodies in a Mouse Subcutaneous Model Followed by Bioluminescence Imaging. J. Vis. Exp. (95), e52239, doi:10.3791/52239 (2015).

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