Summary

Candida albicans Biofilm Development på medisinsk-relevante Fremmedlegemer i en mus Subkutan Model Etterfulgt av Bioluminesens Imaging

Published: January 27, 2015
doi:

Summary

We present an experimental procedure of Candida albicans biofilm development in a mouse subcutaneous model. Fungal biofilms were quantified by determining the number of colony forming units and by a non-invasive bioluminescence imaging, where the amount of light that is produced corresponds with the number of viable cells.

Abstract

Candida albicans biofilm utvikling på biotiske og / eller abiotiske overflater utgjør en konkret trussel for innlagte pasienter. Hittil C. albicans biofilmer har blitt studert overveiende in vitro, men det er et viktig behov for en bedre forståelse av denne dynamiske prosess under in vivo-betingelser. Vi har utviklet en in vivo subkutan rottemodell for å studere C. albicans biofilmdannelse. I vår modell flere (opptil 9) Candida -infected enheter er implantert i den bakre delen av dyret. Dette gir oss en stor fordel i forhold til det sentrale venekateter modellsystem som gjør det mulig for oss å studere flere uavhengige biofilmer i ett dyr. Nylig har vi tilpasset denne modellen til å studere C. albicans biofilm-utviklingen i BALB / c-mus. I denne modellen, modne C. albicans biofilmer utvikle innen 48 timer og demonstrere typisk tredimensjonale biofilm arkitektur. Kvantifisering av sopp biofilmer tradisjonelt analysert post mortem og krever vert offer. Fordi dette krever bruk av mange dyr til å utføre kinetiske studier, søkte vi non-invasiv Bioluminescens imaging (BLI) til langs oppfølging in vivo modne C. albicans biofilm utvikling i vår subkutan modell. C. albicans-celler ble konstruert for å uttrykke Gaussia princeps luciferasegenet (Gluc) festet til celleveggen. Bioluminescens signal frembringes av luciferase som konverterer det tilsatte substrat coelenterazine til lys som kan måles. Den BLI signal lignet celletall hentet fra eksplanterte katetre. Non-invasiv bildediagnostikk for å kvantifisere in vivo biofilmdannelse gir umiddelbare programmer for screening og validering av soppdrepende medisiner under in vivo forhold, samt for studier basert på verts-patogen interaksjoner, herved bidra til en bedre forståelseing av patogenesen av kateterinfeksjoner.

Introduction

Candida albicans er en kommensal organisme, som kan bli funnet på ulike steder av friske individer, for eksempel på huden eller som en del av mage og vaginal flora. Men i sykehus, og spesielt immunsupprimerte pasienter, kan det føre til et bredt spekter av infeksjoner 1. I slike individer, lar svekket immunsystem Candida celler til å spre ut i blodet og for å invadere dypere vev forårsaker livstruende infeksjoner. I tillegg er tilstedeværelsen av ikke-biologiske substrater så som sentralvene og innsetting av kateter, kan kunstige hjerteklaffer og ledd gi en nisje for Candida vedlegg 2. Adhesjon til slike substrater er en forutsetning for videre utvikling av biofilm, som representerer et lag av gjær og hyphal celler innleiret i ekstracellulært polymerisk materiale, vesentlig bestående av polysakkarider 2 C.. albicans kateter -associated infeksjonerer forbundet med høy dødelighet. En generell karakteristikk av biofilm er deres nedsatt følsomhet overfor kjente soppmidler, for eksempel azolene 3,4. Bare nyere klasser av soppdrepende stoffer, for eksempel echinokandiner og liposomformulering av amfotericin B viste seg å være aktiv mot kateterassosierte infeksjoner 5-7. På grunn av biofilm elastisitet til soppmidler, er terapeutiske tilnærminger svært begrenset, ofte fører til kateterfjerning og dens påfølgende erstatning som eneste løsning.

Mesteparten av vår nåværende forståelse av C. albicans biofilm-utviklingen stammer fra in vitro-studier på ikke-biologiske substrater, så som polystyren, eller plast som brukes for fremstilling av ovennevnte enheter, det vil si, silikon, polyuretan 2. Disse modellene er ganske avansert og prøver å etterligne in vivo situasjon så tett som mulig. Men disse systemer ikke involverer kontinuerlig blodstrøm og than immunsystem av verten. Dette førte til utviklingen av in vivo-modellsystemer, slik som det sentrale venekateter (CVC) modell 8-10, gebiss stomatitt modell av oral candidiasis 11 og en murin modell for kateter forbundet candiduria 12. I tillegg C. albicans biofilm-utviklingen ble studert in vivo på slimhinneoverflater, slik som de fra skjeden 13 og munnhulen 14. Vårt laboratorium bidratt med etablering av en subkutan C. albicans biofilm-modellen, som er basert på implantatet av infiserte kateterstykker på baksiden av Sprague Dawley-rotter 15. Denne modellen ble brukt i vårt laboratorium for å teste biofilm mottakelighet for flukonazol og echinokandin- narkotika 5,16, for å studere effekten av kombinatorisk behandling av diklofenak og caspofungin 17. Mer nylig har vi tilpasset dette system for bruk i BALB / c-mus 18,19. Isammenligning med andre in vivo-modeller, er den største fordelen med denne subkutan modellen mulighet til å studere flere biofilmer per dyr utviklet inne i lumen av implantert kateter stykker.

For å redusere antall forsøksdyr, har vi tilpasset denne modell for å studere utviklingen av C. albicans biofilmer non-invasiv ved hjelp Bioluminescens imaging (BLI) 18,19. Denne fremgangsmåte viste seg å være en kraftig teknikk, som kan brukes til å kvantifisere biofilmer ved å måle den spesifikke BLI signal ved området av interesse (i vårt tilfelle området implantert kateter), unngå dyreoffer. I forhold til bakterier, som kan uttrykke både genet og substratet som er nødvendig for Bioluminescens reaksjon på grunn av innføring av et bestemt lux operon 20, de fleste av de eukaryote organismer, inklusive C. albicans, er avhengig av heterolog ekspresjon av et luciferase-gen sammen med denekstern administrasjon av et bestemt underlag, for eksempel D-luciferin eller coelenterazine 21. Sannsynligvis på grunn av tilstedeværelsen av soppcelleveggen og C. albicans morfogenese, den intracellulære leveringen av substratet for luciferase-enzymet var en hovedutfordring 21. For å løse dette problemet, Enjalbert et al., 22 konstruert for en belastning, hvor en syntetisk C. albicans kodon-optimalisert versjon av genet for den naturlig utskilt Gaussia princeps luciferase (Gluc) ble fusjonert til til C. albicans PGA59 gen, et GPI- forankret celleveggprotein. På grunn av tilstedeværelsen av luciferase på celleveggen, kan problemer vedrørende den intracellulære tilgjengelighet av substratet unngås. Dette spesielle systemet ble benyttet for å studere overflate infeksjoner forårsaket av C. albicans 22. Ganske nylig, BLI ble også brukt til å følge utviklingen av orofaryngeal candidiasis og dens possible behandling 23. Slike funn støtter bruk av BLI som en lovende teknikk for å studere infeksjoner forårsaket av frittlevende celler, men også enhetsassosierte infeksjoner.

I denne studien, beskriver vi C. albicans biofilm utvikling på polyuretan kateter stykker i BALB / c mus og dens kvantifisering ved hjelp BLI. Vi gir en detaljert protokoll for in vitro-kolonisering av polyuretan katetre i løpet av adhesjon, fulgt av implantering i mus og påfølgende biofilm-utviklingen i levende dyr. Bortsett fra å måle BLI signal som sendes ut av C. albicans celler, vi også bestemme kolonidannende enheter for sammenligning med standard teknikk for biofilm sopplast kvantifisering.

Protocol

MERK: Alle dyreforsøk ble godkjent av etisk komité av KU Leuven (prosjektnummer 090/2013). Opprettholde dyr i henhold til KU Leuven retningslinjer dyr omsorg. 1. C. albicans Vekst Tjuefire timer før initiering av dyreforsøk, forberede YPD platene ved tilsetning av 10 g gjærekstrakt granulert, 20 g bakteriologisk pepton og 15 g granulert agar. Gjøre opp volumet til 900 ml med Milli-Q vann og autoklav. Tilsett 50 ml steril 40% glukose. Bland godt og hell i p…

Representative Results

I denne studien viser at det kirurgiske inngrepet av kateter implantatet og eksplantasjon under in vivo C. albicans biofilm-utviklingen i en mus. Videre viser vi kvantifisering av modne biofilmer ikke bare av klassisk CFU oppregning, men også ved å BLI. Som vist i Figur 1A, ble det ikke-fosfor polyuretan kateter stykker skåret i 1 cm enheter, og deretter belagt med serum. Dette trinnet er svært viktig fordi det gir Candida celler til å feste til underl…

Discussion

Bruk av dyremodeller, og spesielt gnagermodeller, for studier dedikert til mikrobiell biofilm er svært viktig som vert immunsystemet er en viktig faktor i biofilmdannelse som in vitro modeller ikke kan gjøre rede for. I denne studien, beskriver vi en relativt enkel subkutan C. albicans biofilm musemodell, som lett kan vedtas i et forskningslaboratorium, og krever ikke sterke tekniske ferdigheter. Denne modellen ble opprinnelig utviklet for å studere Staphylococcus epidermidis biofilmdannels…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by the KU Leuven PF ‘IMIR’, the FWO Research community on biology and ecology of bacterial and fungal biofilms (FWO: WO.026.11N) and by the FWO project G.0804.11. SK gratefully acknowledges KU Leuven for the PDMK 11/089 fellowship and FWO for the postdoctoral fellowship. We are grateful to Nico Vangoethem for his assistance with preparation of the figures. We would like to acknowledge Celia Lobo Romero for technical assistance during in vivo experimental procedures.

Materials

Name of Reagent Company Catalog Number Comments/Description
Yeast extract granulated Merck MERC1.03753.0500
Bacteriological peptone Oxoid LP037B
Agar granulated Difco 214530
D-(+)-glucose Fluka 49159-5KG
Phosphate buffered saline  Prepared in the laboratory for 1L of 10x PBS: 80 g NaCl, 2 g KCl, 14.4 g Na2HPO4, 2.4 g KH2PO4
RPMI1640 with L-glutamine and without sodium carbonate  Sigma R6504-1L Prepare according the protocol for Candida albicans drug susceptibility testing 
3-(N-Morpholino)propanesulfonic acid (MOPS) Sigma M1254 MOPS is used to adjust the pH of RPMI medium (pH 7.0)
fetal bovine serum (FBS) Sigma F7524
Polyurethane tripe-lumen intravenous catheter piece (2.4 mm diameter, Certofix Trio S730)  BBraun CV-15703 Polyurethane part cut into 1 cm pieces
Dexamethasone Fagron SAS, France 611139 Immunosuppressant (stock solution 10 mg/ml)
Ampicillin  Duchefa Biochemie, The Netherlands A0104 Antibacterial prophylaxis
Ketamine 1000 Pfizer 804 119 Anesthetic
Domitor Pfizer 134737-1 Anesthetic
Antisedan Pfizer 134783-2 Reversal of anesthesia
Xylocaine gel (2%) – this is Linisol AstraZeneca 352 1206 Local anesthetic for the skin
Terramycin/ polymyxin-b ophthalmic ointment To prevent drying and infection of eyes
Coelenterazine  Prolume (Nanolight) NF-CTZ-FB Light sensitive agent (must be kept in the dark)
Iodine isopropanol (1%) 3M™ DuraPrep™  Disinfectant for the skin
0.5 % chlorhexidine in 70 % alcohol.   Cedium Disinfectant for the skin
Equipment
Cell counting chamber
Insulin syringes (0.3 ml) Terumo Myjector 29G 324826 For injection of coelenterazine
Electric razor For small animals
Sterile surgical tools Scissors, 2 pairs of tweezers, scalpel
Heating pad Leica 14042321474
Skin suture Johnson&Johnson K890H Surgical thread, needle
Water bath sonicator Branson 2210
BLI camera (IVIS Spectrum)  Perkin Elmer, Alameda IVISSPE
Living Image software  Perkin Elmer, Alameda (version 4.2) 

References

  1. Yapar, N. Epidemiology and risk factors for invasive candidiasis. Ther Clin Risk Manag. 10, 95-105 (2014).
  2. Tournu, H., Van Dijck, P. Candida biofims and the host: models and new concepts for eradication. Int J Microbiol. 2012, 845352 (2012).
  3. Taff, H. T., Mitchell, K. F., Edward, J. A., Andes, D. R. Mechanisms of Candida biofilm drug resistance. Future Microbiol. 8 (10), 1325-1337 (2013).
  4. Mathé, L., Van Dijck, P. Recent insights into Candida albicans biofilm resistance mechanisms. Curr Genet. 59 (4), 251-264 (2013).
  5. Kucharíková, S., et al. Activities of systematically administered echinocandins against in vivo mature Candida albicans. biofilms developed in a rat subcutaneous model. Antimicrob Agents Chemother. 57 (5), 2365-2368 (2013).
  6. Kuhn, D. M., George, T., Chandra, J., Mukherjee, P. K., Ghannoum, M. A. Antifungal susceptibility of Candida biofilms: Unique efficacy of amphotericin B lipid formulations and echinocandins. Antimicrob Agents Chemother. 46 (6), 1773-1780 (2002).
  7. Ramage, G., et al. Liposomal amphotericin B displays rapid dose-dependent activity against Candida albicans biofilms. Antimicrob Agents Chemother. 57 (5), 2369-2371 (2013).
  8. Andes, D., et al. Development and characterization of an in vivo central venous catheter Candida albicans biofilm model. Infect Immun. 72 (10), 6023-6031 (2004).
  9. Schinabeck, M. K., et al. Rabbit model of Candida albicans biofilm infection: liposomal amphotericin B antifungal lock therapy. Antimicrob Agents Chemother. 48 (5), 1727-1732 (2004).
  10. Lazzell, A. L., et al. Treatment and prevention of Candida albicans biofilms with caspofungin in a novel central venous catheter murine model of candidiasis. J Antimicrob Chemother. 64 (3), 567-570 (2009).
  11. Nett, J. E., Marchillo, K., Spiegel, C. A., Andes, D. R. Development and validation of an in vivo Candida albicans biofilm denture model. Infect Immun. 78 (9), 3650-3659 (2010).
  12. Wang, X., Fries, B. A murine model for catheter associated Candiduria. J Med Microbiol. 60 (10), 1523-1529 (2011).
  13. Harriott, M. M., Lilly, E. A., Rodriguez, T. E., Fidel, P. L. J., Noverr, M. C. Candida albicans forms biofilms on the vaginal mucosa. Microbiology. 156 (12), 3635-3644 (2010).
  14. Dongari-Bagtzoglou, A., Kashleva, H., Dwivedi, P., Diaz, P., Vasilakos, J. Characerterization of mucosal Candida albicans biofilms. PloS One. 4, e7976 (2009).
  15. Ricicová, M., Kucharíková, S., Tournu, H., Hendrix, J., Bujdáková, H., Van Eldere, J., Lagrou, K., Van Dijck, P. Candida albicans biofilm formation in a new in vivo rat model. Microbiol. 156, 909-919 (2010).
  16. Kucharíková, S., Tournu, H., Holtappels, M., Van Dijck, P., Lagrou, K. In vivo efficacy of anidulafungin against Candida albicans mature biofilms in a novel rat model of catheter-associated candidiasis. Antimicrob Agents Chemother. 54 (10), 4474-4478 (2010).
  17. Bink, A., et al. The nonsteroidal antiinflammatory drug diclofenac potentiates the in vivo activity of caspofungin against Candida albicans biofilms. J Infect Dis. 206 (11), 1790-1797 (2012).
  18. Van de Velde, G., Kucharíková, D., Schrevens, D., Himmelreich, U., Van Dijck, P. Towards non-invasive monitoring of pathogen-host interactions during Candida albicans biofilm formation using in vivo bioluminescence. Cell Microbiol. 16 (1), 115-130 (2014).
  19. Van de Velde, G., Kucharíková, S., Van Dijck, P., Himmelreich, U. Bioluminescence imaging of fungal biofilm development in live animals. Methods in Molecular Biology. 1098, 153-167 (2014).
  20. Gahan, C. G. The bacterial lux reporter system: applications in bacterial localisation studies. Curr Gene Ther. 12 (1), 12-19 (2012).
  21. Doyle, T. C., Nawotka, K. A., Kawahara, C. B., Francis, K. P., Contag, P. R. Visualizing fungal infections in living mice using bioluminescent pathogenic Candida albicans strains transformed with the firefly luciferase gene. Microb Pathog. 40 (2), 82-90 (2006).
  22. Enjalbert, B., et al. A multifunctional synthetic Gaussia princeps luciferase reporter for live imaging of Candida albicans infections. Infect Immun. 77 (11), 4847-4858 (2009).
  23. Mosci, P., et al. A novel bioluminescence mouse model for monitoring oropharyngeal candidiasis in mice. Virulence. 4 (3), 250-254 (2013).
  24. Van Wijngaerden, E., et al. Foreign body infection: a new rat model for prophylaxis and treatment. J. Antimicrob. Chemoth. 44 (5), 669-674 (1999).
  25. Nobile, C. J., Mitchell, A. P. Regulation of cell-surface genes and biofilm formation by the C. albicans transcription factor Bcr1p. Curr. Biol. 15 (12), 1150-1155 (2005).

Play Video

Cite This Article
Kucharíková, S., Vande Velde, G., Himmelreich, U., Van Dijck, P. Candida albicans Biofilm Development on Medically-relevant Foreign Bodies in a Mouse Subcutaneous Model Followed by Bioluminescence Imaging. J. Vis. Exp. (95), e52239, doi:10.3791/52239 (2015).

View Video