Summary

Candida albicans Biofilm utveckling på Medicinskt-relevanta främmande föremål i en mus Subkutan Model Följt av Bioluminescence Imaging

Published: January 27, 2015
doi:

Summary

We present an experimental procedure of Candida albicans biofilm development in a mouse subcutaneous model. Fungal biofilms were quantified by determining the number of colony forming units and by a non-invasive bioluminescence imaging, where the amount of light that is produced corresponds with the number of viable cells.

Abstract

Candida albicans biofilm utveckling biotiska och / eller abiotiska ytor utgör ett specifikt hot för inneliggande patienter. Hittills C. albicans biofilmer har studerats främst in vitro men det finns ett stort behov av bättre förståelse av denna dynamiska process under in vivo-förhållanden. Vi utvecklade en in vivo subkutan råttmodell för att studera C. albicans biofilm formation. I vår modell, multipel (upp till 9) Candida infekterade enheter implanteras i den bakre delen av djuret. Detta ger oss en stor fördel över central venkateter modellsystem eftersom det ger oss möjlighet att studera flera oberoende biofilmer i ett djur. Nyligen, vi anpassat denna modell för att studera C. albicans biofilm utveckling i BALB / c möss. I denna modell mogen C. albicans biofilmer utvecklas inom 48 timmar och demonstrera typiska tredimensionella biofilm arkitektur. Kvantifieringen av svamp biofilmär traditionellt analyseras efter slakt och kräver värd offer. Eftersom detta kräver användning av många djur att utföra kinetiska studier, tillämpade vi icke-invasiv mareld imaging (BLI) till längdled uppföljning in vivo mogna C. albicans Biofilmer utvecklas i vår subkutana modellen. C. albicans-celler utformas för att uttrycka den Gaussia princeps luciferasgenen (Gluc) fäst till cellväggen. Den bioluminescens-signal alstras genom luciferas som omvandlar den tillsatta substrat coelenterazin till ljus som kan mätas. Den BLI signalen liknade celltal erhållna från explanterade katetrar. Icke-invasiv avbildning för att kvantifiera in vivo biofilmbildning ger omedelbara tillämpningar för screening och validering av svampdödande läkemedel under in vivo förhållanden, samt för studier baserade på värd-patogen interaktioner, härmed bidra till en bättre förståelseing av patogenesen av kateterrelaterade infektioner.

Introduction

Candida albicans är en kommen organism, som finns på olika platser i friska individer, till exempel på huden eller som en del av mag och vaginalfloran. Men i sjukhus, och i synnerhet patienter med nedsatt immunförsvar, kan det orsaka ett brett spektrum av infektioner 1. I sådana individer, tillåter försvagat immunförsvar Candida celler att sprida i blodet och att invadera djupare vävnader orsakar livshotande infektioner. Dessutom närvaron av abiotiska substrat såsom centrala venösa och urinkatetrar, kan konstgjorda hjärtklaffar och leder ger en nisch för Candida fäste 2. Adhesion till sådana substrat är en förutsättning för fortsatt biofilm utveckling, vilket motsvarar ett lager av jäst och hyfernas celler inbäddade i extracellulärt polymermaterial, som huvudsakligen består av polysackarider 2. C. albicans kateter -associated infektionerär förknippade med hög dödlighet. En allmän egenskap hos biofilmer är deras minskad känslighet för kända antimykotika, såsom azoler 3,4. Endast nyare klasser av svampdödande läkemedel, såsom echinocandiner och liposomberedning av amfotericin B visade sig vara aktiva mot kateterrelaterade infektioner 5-7. På grund av biofilm motståndskraft mot svampmedel, är terapeutiska metoder väldigt begränsad, vilket ofta leder till kateterborttagning och dess senare ersättning som en enda lösning.

De flesta av våra nuvarande förståelse av C. albicans biofilm utveckling härstammar från in vitro-studier på abiotiska substrat såsom polystyren, eller plast som används för tillverkning av ovan nämnda enheter, det vill säga, silikon, polyuretan 2. Dessa modeller är ganska avancerad och försöka efterlikna in vivo-situationen så nära som möjligt. Men dessa system inte innebära kontinuerliga blodflödet och tHan immunsystemet hos värden. Detta resulterade i utvecklingen av in vivo modellsystem, såsom central venkateter (CVC) modell 8-10, den stomatit modell av oral candidiasis 11 protes och en musmodell för kateterassocierade candiduri 12. Dessutom C. albicans biofilm utveckling studerades in vivo på slemhinnor, såsom de från slidan 13 och munhålan 14. Vårt laboratorium bidrog med inrättandet av en subkutan C. albicans biofilm modell, som bygger på implantatet av infekterade kateter bitar på baksidan av Sprague Dawley 15. Denna modell med framgång använts i vårt laboratorium för att testa biofilms känslighet för flukonazol och echinocandin droger 5,16, för att studera effekten av kombiterapi av diklofenak och caspofungin 17. På senare tid, anpassade vi detta system för användning i BALB / c möss 18,19. Ijämförelse med andra in vivo-modeller, är den största fördelen med denna subkutan modellen möjlighet att studera flera biofilmer per djur utvecklats inuti lumen implanterade kateterstycken.

För att minska antalet försöksdjur, har vi anpassat denna modell för att studera utvecklingen av C. albicans Biofilmer icke-invasivt med hjälp bioluminiscens imaging (BLI) 18,19. Denna metod visade sig vara en kraftfull teknik, som kan användas för att kvantifiera biofilmer genom att mäta den specifika BLI signalen vid regionen av intresse (i vårt fall området implanterade katetrar), undviker djuroffer. I jämförelse med bakterier, vilket kan uttrycka både genen och substratet krävs för mareld reaktion på grund av införandet av en särskild lux operon 20, de flesta av de eukaryota organismer, inklusive C. albicans, är beroende av det heterologa uttrycket av en luciferasgen kopplad medextern administration av ett specifikt substrat, såsom D-luciferin eller coelenterazine 21. Förmodligen på grund av närvaron av svampens cellvägg och C. albicans morfogenes, den intracellulär tillförsel av substratet för luciferasenzymet var en största utmaningen 21. För att lösa detta problem, Enjalbert et al. 22 engineered en stam där en syntetisk C. albicans kodon-optimerad version av genen för den naturligt utsöndras Gaussia princeps luciferas (Gluc) fuserades till till C. albicans PGA59 gen, en GPI- förankrade cellväggsprotein. På grund av närvaron av luciferas vid cellväggen, kunde problemen med den intracellulära tillgängligheten av substratet undvikas. Just detta system användes för att studera ytliga infektioner orsakade av C. albicans 22. Helt nyligen, BLI användes också för att följa framskridandet av orofaryngeal candidiasis och dess possible behandling 23. Sådana fynd stödjer användningen av BLI som en lovande teknik för att studera infektioner orsakade av fritt levande celler utan också enhetsrelaterade infektioner.

I denna studie beskriver vi C. albicans biofilm utveckling på polyuretan kateter bitar i BALB / c möss och dess kvantifiering med hjälp BLI. Vi tillhandahåller ett detaljerat protokoll av in vitro kolonisering av polyuretankatetrar under perioden av vidhäftning följt av implantation hos möss och efterföljande biofilm utveckling med levande djur. Förutom mätning BLI-signalen emitterad av C. albicans celler, också bestämma att vi kolonibildande enheter för jämförelse med standardteknik för biofilm svamp last kvantifiering.

Protocol

OBS: Alla djurförsök godkändes av etiska kommittén i KU Leuven (projektnummer 090/2013). Behåll djur i enlighet med riktlinjerna för KU ​​Leuven djurskötsel. 1. C. albicans Tillväxt Tjugofyra timmar innan initieringen av djurförsök, förbereda YPD-plattor genom att tillsätta 10 g jästextrakt granulerad, 20 g bakteriologisk pepton och 15 g granulerat agar. Späd volymen till 900 ml med Milli-Q-vatten och autoklav. Tillsätt 50 ml av steril 40% glu…

Representative Results

I denna studie visar vi den kirurgiska proceduren av kateter implantatet och explantatet under in vivo-C. albicans biofilmutveckling i en mus. Dessutom visar vi kvantifieringen av mogna biofilmer inte bara av klassisk CFU uppräkning utan även av BLI. Som visas i figur 1A, var icke-fosforescerande polyuretankateterstycken skurna i 1 cm-enheter och därefter belagd med serum. Detta steg är mycket viktigt eftersom det tillåter Candida celler att fästa på…

Discussion

Användningen av djurmodeller, och särskilt gnagarmodeller, för studier tillägnade mikrobiella biofilmer är mycket viktigt eftersom värdimmunsystemet är en viktig faktor i biofilm formation som in vitro-modeller inte kan stå för. I denna studie beskriver vi en relativt enkel subkutan C. albicans biofilm musmodell, som lätt kan antas i ett forskningslaboratorium och inte kräver stark teknisk kompetens. Denna modell utvecklades ursprungligen för att studera Staphylococcus epidermidis

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by the KU Leuven PF ‘IMIR’, the FWO Research community on biology and ecology of bacterial and fungal biofilms (FWO: WO.026.11N) and by the FWO project G.0804.11. SK gratefully acknowledges KU Leuven for the PDMK 11/089 fellowship and FWO for the postdoctoral fellowship. We are grateful to Nico Vangoethem for his assistance with preparation of the figures. We would like to acknowledge Celia Lobo Romero for technical assistance during in vivo experimental procedures.

Materials

Name of Reagent Company Catalog Number Comments/Description
Yeast extract granulated Merck MERC1.03753.0500
Bacteriological peptone Oxoid LP037B
Agar granulated Difco 214530
D-(+)-glucose Fluka 49159-5KG
Phosphate buffered saline  Prepared in the laboratory for 1L of 10x PBS: 80 g NaCl, 2 g KCl, 14.4 g Na2HPO4, 2.4 g KH2PO4
RPMI1640 with L-glutamine and without sodium carbonate  Sigma R6504-1L Prepare according the protocol for Candida albicans drug susceptibility testing 
3-(N-Morpholino)propanesulfonic acid (MOPS) Sigma M1254 MOPS is used to adjust the pH of RPMI medium (pH 7.0)
fetal bovine serum (FBS) Sigma F7524
Polyurethane tripe-lumen intravenous catheter piece (2.4 mm diameter, Certofix Trio S730)  BBraun CV-15703 Polyurethane part cut into 1 cm pieces
Dexamethasone Fagron SAS, France 611139 Immunosuppressant (stock solution 10 mg/ml)
Ampicillin  Duchefa Biochemie, The Netherlands A0104 Antibacterial prophylaxis
Ketamine 1000 Pfizer 804 119 Anesthetic
Domitor Pfizer 134737-1 Anesthetic
Antisedan Pfizer 134783-2 Reversal of anesthesia
Xylocaine gel (2%) – this is Linisol AstraZeneca 352 1206 Local anesthetic for the skin
Terramycin/ polymyxin-b ophthalmic ointment To prevent drying and infection of eyes
Coelenterazine  Prolume (Nanolight) NF-CTZ-FB Light sensitive agent (must be kept in the dark)
Iodine isopropanol (1%) 3M™ DuraPrep™  Disinfectant for the skin
0.5 % chlorhexidine in 70 % alcohol.   Cedium Disinfectant for the skin
Equipment
Cell counting chamber
Insulin syringes (0.3 ml) Terumo Myjector 29G 324826 For injection of coelenterazine
Electric razor For small animals
Sterile surgical tools Scissors, 2 pairs of tweezers, scalpel
Heating pad Leica 14042321474
Skin suture Johnson&Johnson K890H Surgical thread, needle
Water bath sonicator Branson 2210
BLI camera (IVIS Spectrum)  Perkin Elmer, Alameda IVISSPE
Living Image software  Perkin Elmer, Alameda (version 4.2) 

References

  1. Yapar, N. Epidemiology and risk factors for invasive candidiasis. Ther Clin Risk Manag. 10, 95-105 (2014).
  2. Tournu, H., Van Dijck, P. Candida biofims and the host: models and new concepts for eradication. Int J Microbiol. 2012, 845352 (2012).
  3. Taff, H. T., Mitchell, K. F., Edward, J. A., Andes, D. R. Mechanisms of Candida biofilm drug resistance. Future Microbiol. 8 (10), 1325-1337 (2013).
  4. Mathé, L., Van Dijck, P. Recent insights into Candida albicans biofilm resistance mechanisms. Curr Genet. 59 (4), 251-264 (2013).
  5. Kucharíková, S., et al. Activities of systematically administered echinocandins against in vivo mature Candida albicans. biofilms developed in a rat subcutaneous model. Antimicrob Agents Chemother. 57 (5), 2365-2368 (2013).
  6. Kuhn, D. M., George, T., Chandra, J., Mukherjee, P. K., Ghannoum, M. A. Antifungal susceptibility of Candida biofilms: Unique efficacy of amphotericin B lipid formulations and echinocandins. Antimicrob Agents Chemother. 46 (6), 1773-1780 (2002).
  7. Ramage, G., et al. Liposomal amphotericin B displays rapid dose-dependent activity against Candida albicans biofilms. Antimicrob Agents Chemother. 57 (5), 2369-2371 (2013).
  8. Andes, D., et al. Development and characterization of an in vivo central venous catheter Candida albicans biofilm model. Infect Immun. 72 (10), 6023-6031 (2004).
  9. Schinabeck, M. K., et al. Rabbit model of Candida albicans biofilm infection: liposomal amphotericin B antifungal lock therapy. Antimicrob Agents Chemother. 48 (5), 1727-1732 (2004).
  10. Lazzell, A. L., et al. Treatment and prevention of Candida albicans biofilms with caspofungin in a novel central venous catheter murine model of candidiasis. J Antimicrob Chemother. 64 (3), 567-570 (2009).
  11. Nett, J. E., Marchillo, K., Spiegel, C. A., Andes, D. R. Development and validation of an in vivo Candida albicans biofilm denture model. Infect Immun. 78 (9), 3650-3659 (2010).
  12. Wang, X., Fries, B. A murine model for catheter associated Candiduria. J Med Microbiol. 60 (10), 1523-1529 (2011).
  13. Harriott, M. M., Lilly, E. A., Rodriguez, T. E., Fidel, P. L. J., Noverr, M. C. Candida albicans forms biofilms on the vaginal mucosa. Microbiology. 156 (12), 3635-3644 (2010).
  14. Dongari-Bagtzoglou, A., Kashleva, H., Dwivedi, P., Diaz, P., Vasilakos, J. Characerterization of mucosal Candida albicans biofilms. PloS One. 4, e7976 (2009).
  15. Ricicová, M., Kucharíková, S., Tournu, H., Hendrix, J., Bujdáková, H., Van Eldere, J., Lagrou, K., Van Dijck, P. Candida albicans biofilm formation in a new in vivo rat model. Microbiol. 156, 909-919 (2010).
  16. Kucharíková, S., Tournu, H., Holtappels, M., Van Dijck, P., Lagrou, K. In vivo efficacy of anidulafungin against Candida albicans mature biofilms in a novel rat model of catheter-associated candidiasis. Antimicrob Agents Chemother. 54 (10), 4474-4478 (2010).
  17. Bink, A., et al. The nonsteroidal antiinflammatory drug diclofenac potentiates the in vivo activity of caspofungin against Candida albicans biofilms. J Infect Dis. 206 (11), 1790-1797 (2012).
  18. Van de Velde, G., Kucharíková, D., Schrevens, D., Himmelreich, U., Van Dijck, P. Towards non-invasive monitoring of pathogen-host interactions during Candida albicans biofilm formation using in vivo bioluminescence. Cell Microbiol. 16 (1), 115-130 (2014).
  19. Van de Velde, G., Kucharíková, S., Van Dijck, P., Himmelreich, U. Bioluminescence imaging of fungal biofilm development in live animals. Methods in Molecular Biology. 1098, 153-167 (2014).
  20. Gahan, C. G. The bacterial lux reporter system: applications in bacterial localisation studies. Curr Gene Ther. 12 (1), 12-19 (2012).
  21. Doyle, T. C., Nawotka, K. A., Kawahara, C. B., Francis, K. P., Contag, P. R. Visualizing fungal infections in living mice using bioluminescent pathogenic Candida albicans strains transformed with the firefly luciferase gene. Microb Pathog. 40 (2), 82-90 (2006).
  22. Enjalbert, B., et al. A multifunctional synthetic Gaussia princeps luciferase reporter for live imaging of Candida albicans infections. Infect Immun. 77 (11), 4847-4858 (2009).
  23. Mosci, P., et al. A novel bioluminescence mouse model for monitoring oropharyngeal candidiasis in mice. Virulence. 4 (3), 250-254 (2013).
  24. Van Wijngaerden, E., et al. Foreign body infection: a new rat model for prophylaxis and treatment. J. Antimicrob. Chemoth. 44 (5), 669-674 (1999).
  25. Nobile, C. J., Mitchell, A. P. Regulation of cell-surface genes and biofilm formation by the C. albicans transcription factor Bcr1p. Curr. Biol. 15 (12), 1150-1155 (2005).

Play Video

Cite This Article
Kucharíková, S., Vande Velde, G., Himmelreich, U., Van Dijck, P. Candida albicans Biofilm Development on Medically-relevant Foreign Bodies in a Mouse Subcutaneous Model Followed by Bioluminescence Imaging. J. Vis. Exp. (95), e52239, doi:10.3791/52239 (2015).

View Video