We present an experimental procedure of Candida albicans biofilm development in a mouse subcutaneous model. Fungal biofilms were quantified by determining the number of colony forming units and by a non-invasive bioluminescence imaging, where the amount of light that is produced corresponds with the number of viable cells.
Candida albicans biofilm utveckling biotiska och / eller abiotiska ytor utgör ett specifikt hot för inneliggande patienter. Hittills C. albicans biofilmer har studerats främst in vitro men det finns ett stort behov av bättre förståelse av denna dynamiska process under in vivo-förhållanden. Vi utvecklade en in vivo subkutan råttmodell för att studera C. albicans biofilm formation. I vår modell, multipel (upp till 9) Candida infekterade enheter implanteras i den bakre delen av djuret. Detta ger oss en stor fördel över central venkateter modellsystem eftersom det ger oss möjlighet att studera flera oberoende biofilmer i ett djur. Nyligen, vi anpassat denna modell för att studera C. albicans biofilm utveckling i BALB / c möss. I denna modell mogen C. albicans biofilmer utvecklas inom 48 timmar och demonstrera typiska tredimensionella biofilm arkitektur. Kvantifieringen av svamp biofilmär traditionellt analyseras efter slakt och kräver värd offer. Eftersom detta kräver användning av många djur att utföra kinetiska studier, tillämpade vi icke-invasiv mareld imaging (BLI) till längdled uppföljning in vivo mogna C. albicans Biofilmer utvecklas i vår subkutana modellen. C. albicans-celler utformas för att uttrycka den Gaussia princeps luciferasgenen (Gluc) fäst till cellväggen. Den bioluminescens-signal alstras genom luciferas som omvandlar den tillsatta substrat coelenterazin till ljus som kan mätas. Den BLI signalen liknade celltal erhållna från explanterade katetrar. Icke-invasiv avbildning för att kvantifiera in vivo biofilmbildning ger omedelbara tillämpningar för screening och validering av svampdödande läkemedel under in vivo förhållanden, samt för studier baserade på värd-patogen interaktioner, härmed bidra till en bättre förståelseing av patogenesen av kateterrelaterade infektioner.
Candida albicans är en kommen organism, som finns på olika platser i friska individer, till exempel på huden eller som en del av mag och vaginalfloran. Men i sjukhus, och i synnerhet patienter med nedsatt immunförsvar, kan det orsaka ett brett spektrum av infektioner 1. I sådana individer, tillåter försvagat immunförsvar Candida celler att sprida i blodet och att invadera djupare vävnader orsakar livshotande infektioner. Dessutom närvaron av abiotiska substrat såsom centrala venösa och urinkatetrar, kan konstgjorda hjärtklaffar och leder ger en nisch för Candida fäste 2. Adhesion till sådana substrat är en förutsättning för fortsatt biofilm utveckling, vilket motsvarar ett lager av jäst och hyfernas celler inbäddade i extracellulärt polymermaterial, som huvudsakligen består av polysackarider 2. C. albicans kateter -associated infektionerär förknippade med hög dödlighet. En allmän egenskap hos biofilmer är deras minskad känslighet för kända antimykotika, såsom azoler 3,4. Endast nyare klasser av svampdödande läkemedel, såsom echinocandiner och liposomberedning av amfotericin B visade sig vara aktiva mot kateterrelaterade infektioner 5-7. På grund av biofilm motståndskraft mot svampmedel, är terapeutiska metoder väldigt begränsad, vilket ofta leder till kateterborttagning och dess senare ersättning som en enda lösning.
De flesta av våra nuvarande förståelse av C. albicans biofilm utveckling härstammar från in vitro-studier på abiotiska substrat såsom polystyren, eller plast som används för tillverkning av ovan nämnda enheter, det vill säga, silikon, polyuretan 2. Dessa modeller är ganska avancerad och försöka efterlikna in vivo-situationen så nära som möjligt. Men dessa system inte innebära kontinuerliga blodflödet och tHan immunsystemet hos värden. Detta resulterade i utvecklingen av in vivo modellsystem, såsom central venkateter (CVC) modell 8-10, den stomatit modell av oral candidiasis 11 protes och en musmodell för kateterassocierade candiduri 12. Dessutom C. albicans biofilm utveckling studerades in vivo på slemhinnor, såsom de från slidan 13 och munhålan 14. Vårt laboratorium bidrog med inrättandet av en subkutan C. albicans biofilm modell, som bygger på implantatet av infekterade kateter bitar på baksidan av Sprague Dawley 15. Denna modell med framgång använts i vårt laboratorium för att testa biofilms känslighet för flukonazol och echinocandin droger 5,16, för att studera effekten av kombiterapi av diklofenak och caspofungin 17. På senare tid, anpassade vi detta system för användning i BALB / c möss 18,19. Ijämförelse med andra in vivo-modeller, är den största fördelen med denna subkutan modellen möjlighet att studera flera biofilmer per djur utvecklats inuti lumen implanterade kateterstycken.
För att minska antalet försöksdjur, har vi anpassat denna modell för att studera utvecklingen av C. albicans Biofilmer icke-invasivt med hjälp bioluminiscens imaging (BLI) 18,19. Denna metod visade sig vara en kraftfull teknik, som kan användas för att kvantifiera biofilmer genom att mäta den specifika BLI signalen vid regionen av intresse (i vårt fall området implanterade katetrar), undviker djuroffer. I jämförelse med bakterier, vilket kan uttrycka både genen och substratet krävs för mareld reaktion på grund av införandet av en särskild lux operon 20, de flesta av de eukaryota organismer, inklusive C. albicans, är beroende av det heterologa uttrycket av en luciferasgen kopplad medextern administration av ett specifikt substrat, såsom D-luciferin eller coelenterazine 21. Förmodligen på grund av närvaron av svampens cellvägg och C. albicans morfogenes, den intracellulär tillförsel av substratet för luciferasenzymet var en största utmaningen 21. För att lösa detta problem, Enjalbert et al. 22 engineered en stam där en syntetisk C. albicans kodon-optimerad version av genen för den naturligt utsöndras Gaussia princeps luciferas (Gluc) fuserades till till C. albicans PGA59 gen, en GPI- förankrade cellväggsprotein. På grund av närvaron av luciferas vid cellväggen, kunde problemen med den intracellulära tillgängligheten av substratet undvikas. Just detta system användes för att studera ytliga infektioner orsakade av C. albicans 22. Helt nyligen, BLI användes också för att följa framskridandet av orofaryngeal candidiasis och dess possible behandling 23. Sådana fynd stödjer användningen av BLI som en lovande teknik för att studera infektioner orsakade av fritt levande celler utan också enhetsrelaterade infektioner.
I denna studie beskriver vi C. albicans biofilm utveckling på polyuretan kateter bitar i BALB / c möss och dess kvantifiering med hjälp BLI. Vi tillhandahåller ett detaljerat protokoll av in vitro kolonisering av polyuretankatetrar under perioden av vidhäftning följt av implantation hos möss och efterföljande biofilm utveckling med levande djur. Förutom mätning BLI-signalen emitterad av C. albicans celler, också bestämma att vi kolonibildande enheter för jämförelse med standardteknik för biofilm svamp last kvantifiering.
Användningen av djurmodeller, och särskilt gnagarmodeller, för studier tillägnade mikrobiella biofilmer är mycket viktigt eftersom värdimmunsystemet är en viktig faktor i biofilm formation som in vitro-modeller inte kan stå för. I denna studie beskriver vi en relativt enkel subkutan C. albicans biofilm musmodell, som lätt kan antas i ett forskningslaboratorium och inte kräver stark teknisk kompetens. Denna modell utvecklades ursprungligen för att studera Staphylococcus epidermidis …
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by the KU Leuven PF ‘IMIR’, the FWO Research community on biology and ecology of bacterial and fungal biofilms (FWO: WO.026.11N) and by the FWO project G.0804.11. SK gratefully acknowledges KU Leuven for the PDMK 11/089 fellowship and FWO for the postdoctoral fellowship. We are grateful to Nico Vangoethem for his assistance with preparation of the figures. We would like to acknowledge Celia Lobo Romero for technical assistance during in vivo experimental procedures.
Name of Reagent | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Yeast extract granulated | Merck | MERC1.03753.0500 | |
Bacteriological peptone | Oxoid | LP037B | |
Agar granulated | Difco | 214530 | |
D-(+)-glucose | Fluka | 49159-5KG | |
Phosphate buffered saline | Prepared in the laboratory | for 1L of 10x PBS: 80 g NaCl, 2 g KCl, 14.4 g Na2HPO4, 2.4 g KH2PO4 | |
RPMI1640 with L-glutamine and without sodium carbonate | Sigma | R6504-1L | Prepare according the protocol for Candida albicans drug susceptibility testing |
3-(N-Morpholino)propanesulfonic acid (MOPS) | Sigma | M1254 | MOPS is used to adjust the pH of RPMI medium (pH 7.0) |
fetal bovine serum (FBS) | Sigma | F7524 | |
Polyurethane tripe-lumen intravenous catheter piece (2.4 mm diameter, Certofix Trio S730) | BBraun | CV-15703 | Polyurethane part cut into 1 cm pieces |
Dexamethasone | Fagron SAS, France | 611139 | Immunosuppressant (stock solution 10 mg/ml) |
Ampicillin | Duchefa Biochemie, The Netherlands | A0104 | Antibacterial prophylaxis |
Ketamine 1000 | Pfizer | 804 119 | Anesthetic |
Domitor | Pfizer | 134737-1 | Anesthetic |
Antisedan | Pfizer | 134783-2 | Reversal of anesthesia |
Xylocaine gel (2%) – this is Linisol | AstraZeneca | 352 1206 | Local anesthetic for the skin |
Terramycin/ polymyxin-b ophthalmic ointment | To prevent drying and infection of eyes | ||
Coelenterazine | Prolume (Nanolight) | NF-CTZ-FB | Light sensitive agent (must be kept in the dark) |
Iodine isopropanol (1%) | 3M™ DuraPrep™ | Disinfectant for the skin | |
0.5 % chlorhexidine in 70 % alcohol. | Cedium | Disinfectant for the skin | |
Equipment | |||
Cell counting chamber | |||
Insulin syringes (0.3 ml) | Terumo Myjector 29G | 324826 | For injection of coelenterazine |
Electric razor | For small animals | ||
Sterile surgical tools | Scissors, 2 pairs of tweezers, scalpel | ||
Heating pad | Leica | 14042321474 | |
Skin suture | Johnson&Johnson | K890H | Surgical thread, needle |
Water bath sonicator | Branson 2210 | ||
BLI camera (IVIS Spectrum) | Perkin Elmer, Alameda | IVISSPE | |
Living Image software | Perkin Elmer, Alameda | (version 4.2) |