Summary
Устойчивый государственный уровень специфических мРНК определяется скоростью синтеза и распада мРНК. По всему геному темпы деградации мРНК или нормы распада специфических мРНК может быть измерена путем определения мРНК полураспада. Этот протокол фокусируется на измерении скорости распада мРНК в Saccharomyces CEREVISIAE.
Abstract
мРНК уровни стационарные варьируются в зависимости от условий окружающей среды. Регулирование устойчивых уровней накопления государство мРНК гарантирует, что нужное количество белка синтезируется для конкретных условий роста клетки. Один из подходов для измерения скорости распада мРНК ингибирования транскрипции и затем мониторинг исчезновение уже присутствующего мРНК. Скорость распада мРНК может быть количественно и точное время полужизни может быть определено с использованием нескольких методов. В S. Cerevisiae, протоколы, которые измеряют мРНК полураспада были разработаны и включают в себя ингибирования транскрипции мРНК с использованием штаммов, которые укрывают чувствительный к температуре аллель РНК-полимеразы II, rpb1-1. Другие методы измерения мРНК наполовину жизни включают ингибирующие транскрипцию с транскрипционными ингибиторов, таких как thiolutin или 1,10-фенантролина, или альтернативно, используя мРНК, которые находятся под контролем регулируемого промоторатаких, как галактоза индуцируемого промотора и-офф ТЕТ системы. Здесь мы описываем измерение S. скорость распада CEREVISIAE мРНК с использованием чувствительный к температуре аллель РНК-полимеразы II. Этот метод может быть использован для измерения мРНК скорости распада отдельных мРНК или генома.
Introduction
Транскрипции и распад мРНК специфическими являются важными детерминантами генной экспрессии. Скорость синтеза и распада специфических мРНК определяет стационарный уровень этой конкретной мРНК. Стационарное состояние уровни мРНК регулируют изобилие мРНК и определить, сколько каждого мРНК доступна для синтеза белка. Измерения мРНК полураспада широко используются для определения скорости распада мРНК. Удельный распада мРНК с различной скоростью, которые связаны с особенностями мРНК, в зависимости от белка, кодируемого мРНК и от условий окружающей среды. В зависимости от техники, используемой для определения скорости распада мРНК, измерения скорость распада может быть определена глобально или для отдельных транскриптов. В дрожжах S. Cerevisiae, методы, которые наиболее часто используются для измерения скорости распада глобальной мРНК включать в себя использование штамм дрожжей, несущих чувствительный к температуре аллель РНК-полимеразы II и химической Закавкriptional ингибиторы, такие как thiolutin и 1,10-фенантролина 1-5. Эти методы также могут быть использованы для измерения скорости распада мРНК отдельные 4. Другие способы также могут быть использованы для измерения скорости распада мРНК. Эти методы включают в себя подход к стационарного маркировки или использования молекул мРНК, которые выражаются с регулируемой промотором, который выражается только в некоторых условиях. Каждый из этих методов имеет свои преимущества и недостатки. Методика описана здесь использует чувствительный к температуре аллель РНК-полимеразы II. Этот метод использует S. CEREVISIAE в качестве модели, но может были изменены и использованы в других системах с использованием специфических методик транскрипции ингибирования 6.
мРНК измерения периода полураспада, использующие чувствительный к температуре аллель РНК-полимеразы II широко используются для обоих генома и физических измерений мРНК распада 4-5. Этот метод требует использование specifIC штамм дрожжей, которые таит в себе чувствительный к температуре аллель РНК-полимеразы II, rpb1-1 1. Основанием для этого метода является то, что воздействие на чувствительный к температуре штамма дрожжей к непермиссивной температуры ингибирует синтез мРНК. Впоследствии, распад мРНК существовавшие ранее контролируется в различные моменты времени после транскрипции был запрещено. Исчезновение существовавшие ранее мРНК контролируется путем экстракции РНК из дрожжевых клеток в различные моменты времени после транскрипции был выключен. Моменты времени, в котором дрожжевые клетки собирают предопределены пилотного эксперимента, и зависят от стенограммы и системы ведется расследование. Быстрее моменты времени используются для короткоживущих транскриптов, в то время как более длинные временные точки используются для более долгоживущими транскриптов. После распада мРНК контролируется либо северной блот анализа, количественной ПЦР или RNAseq.
Измерение мРНК полураспада, используя TEmperature чувствительны аллель РНК-полимеразы II имеет свои преимущества. Во-первых, эта техника легко и прямо вперед. Во-вторых, после того, как штамм дрожжей приобретается или генерируется в лаборатории измерения периода полураспада мРНК может быть определена в различных условиях роста; позволяет определить влияния окружающей среды на мРНК распада. В-третьих, скорость распада мРНК может контролироваться генома. Использование других методов ингибирования транскрипции также имеет свои преимущества и недостатки. Например, использование индуцируемого промотора требуется субклонирования, чтобы генерировать мРНК, которое под контролем регулируемого промотора. Thiolutin не легко доступны и дорого если таковые имеются. Кроме того, режим thiolutin по действию не полностью понимали, и было сообщено, чтобы влиять на другие клеточные процессы, включая ингибирования мРНК распада 7. В качестве альтернативы, 1,10-фенантролина, более легко доступны. Кроме того, все методы, используемые для ингибирования транскрипции может ПертУРБ клеточную функцию и может влиять на различные мРНК в различных направлениях. Следователь должен определить наиболее подходящий метод для использования в своих экспериментальных условиях для достижения наиболее надежные результаты. Чтобы определить, какой метод является наиболее подходящим для их применения, исследователь должен определить стенограммы и функции белков, кодируемых транскриптов ведется расследование. Наиболее надежные измерения скорости мРНК распада являются те, которые определяются с помощью нескольких методов и показать такую же скорость распада. Ни один метод не всегда лучше, и наиболее подходящий метод зависит от конкретной ситуации.
Многочисленные исследования, проведенные в S. Cerevisiae измерили скорость распада мРНК в различных условиях и генетического происхождения. Условия что ставки мРНК распада, измеряемые в зависимости от конкретных эксперимент ведется расследование. Измерение скорости распада мРНК в различных клеточных средах определяет, являются ли условия бытияобследованных преимущественно влияют на скорость распада конкретных мРНК. Скорости распада мРНК может также варьировать в зависимости от штамма дрожжей используется. Например, скорость распада мРНК может быть определена в дрожжевых клетках дикого типа и клеток дрожжей с нефункциональной бред-опосредованной деградации мРНК (NMD) пути. Эта мРНК путь деградации встречается во всех эукариотических организмов, которые были изучены до сих пор и это вызывает деградацию мРНК, которые досрочно прекратить перевод 8. ПРО изначально определен как путь, который ухудшает мРНК с преждевременным кодонов терминации или бессмысленных кодонов, но в настоящее время признается в качестве пути, который также регулирует экспрессию не-глупости, содержащих природные мРНК. мРНК, которые стали целями пути быстро деградируют в дрожжевых клетках с функциональным ПРО пути и стабилизируется в дрожжевых клетках с нефункциональном ПРО пути. Таким образом, период полураспада мРНК, которые являются прямыми целями этого пути короче в дикого типа дрожжей челLs по сравнению с дрожжевых клеток с нефункциональной ПРО пути.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Рост клеток дрожжей
- Выберите соответствующие штаммы дрожжей, которые будут использоваться для измерения скорость распада мРНК. Для подавления транскрипции с помощью чувствительный к температуре аллель РНК-полимеразы II, использовать дрожжевые штаммы, несущие rpb1-1 мутацию 1. Получить этот штамм дрожжей из лаборатории, который уже имеет один или генерировать его в лаборатории с помощью стандартных методов, если конкретный генетический фон требуется 9.
- Использование метода стерилизации, подготовки дрожжей СМИ, используя стандартные процедуры 10. Если выбор не требуется, подготовить мультимедийные такие как YPD. С другой стороны, подготовка селективной среде, если дрожжевые клетки, трансформированные плазмидами, и выбор не требуется. Автоклав СМИ.
- Выращивают дрожжевых клеток при 28 ° С, которая является разрешающей температуре для этого штамма дрожжей. Сделайте это в два этапа:
- Для первого O / N, растут дрожжевых клеток в 5 мл питательной среды на насыщение.
- Настройка второго O / N в конце второго дня. Для второго O / N, инокуляции различные количества дрожжевых клеток от первого O / N в от 100 до 150 мл питательной среды (в пределах от 100 мкл до 1 мл, 2 мл или более, в зависимости от того, когда дрожжевые клетки должны быть собирают на следующий день). Этот шаг, чтобы гарантировать, что один из культур при правильном OD 600 на следующий день.
2. Урожай дрожжевых клеток
- Приготовьтесь к тому, урожай дрожжевых клеток. Время для этого шага является критическим; маркировать все необходимые трубы и собрать все необходимое оборудование и материалы в одном месте. Предварительный нагрев на водяной бане до 39 ° С и предварительного нагрева два 15 мл пробирках с питательной среды при 28 ° С и при 60 ° С.
Примечание: объем 15 мл питательной среды может изменяться в зависимости от количества временных точках клетки должны быть собраны. - Урожай дрожжевых клеток, когда они достигают ОР 600 от 0,4 до 0,7. Transfэ клетки до 4 - 6 стерильных 50 мл с винтовой крышкой бутылки. Центрифуга при 7500 х г в высокоскоростной центрифуге в течение 5 мин при комнатной температуре.
- Жидкость над осадком сливают и вновь суспендируют гранул в питательной среде 15 мл, что было в равновесие при 28 ° С. Бассейн дрожжевых клеток в одном стерильную колбу объемом 250 мл и уравновешивают их в течение ~ 5 мин при температуре роста 28 ° C.
- После того, как дрожжевые клетки уравновешивали при температуре роста, сразу же добавить 15 мл питательной среды, уравновешенную при 60 ° С, чтобы повысить температуру до 39 ° C (температура) запрещающих и сразу же колбу помещают на водяную баню на 39 ° , Убедитесь, что питательная среда остается в ванне C воды 39 ° в течение оставшихся шагов сбора клеток для того, чтобы транскрипция выключен.
- Урожай клетки в разное время после помещения колбы в водяной бане 39 °. Для первой точки времени, сбора клеток сразу же после помещения колбы в 39 и #176; С. Урожай 3 мл аликвоты и распространять 3 мл на две части, 1,5 мл микроцентрифужных пробирок. Осаждения клеток в течение 10 сек в мини центрифуги или picofuge с быстрым замедлением и вылейте супернатанта.
- Сразу заморозить осадок в сухой лед / этанол бане или в жидком азоте. Назначают первый момент времени клетки собирали в качестве нулевой момент времени.
- Экспериментально определить временные точки клетки собирают в дальнейшем с помощью пилотного эксперимента, в зависимости от мРНК, представляющих интерес. Как правило, урожай дрожжевые клетки в следующих временных точках: 0, 3, 6, 9, 12, 18, 25 и 35 мин (рис 2b). Если мРНК полураспада не может быть определена с помощью вышеуказанных точек времени, регулировать эти временные точки. Например, для мРНК с ожидаемым коротким периодом полураспада, использовать более короткие времена точек (то есть, 0, 1, 2, 3, 4, 6, 9, 12 и 18 мин) и мРНК с ожидаемым длинным периодом полураспада, расширить моменты времени.
- После клеток гаrvested, храните их в -80 ° C морозильнике до экстракции РНК осуществляется.
3. Выписка РНК из дрожжевых клеток
- Для извлечения части РНК протокола, используйте РНКазы методы для предотвращения деградации РНК РНКазы. Подготовка РНКазы решения, посуда и пластиковая посуда для использования в экстракции РНК.
- Извлечение РНК из дрожжевых клеток в соответствии со стандартными протоколами. Как правило, используется метод горячего фенола 12. В качестве альтернативы, использовать наборы, которые могут быть использованы для извлечения РНК из клеток дрожжей.
- Определить количество и чистоту РНК, как правило, путем измерения оптической плотности при 260 и 280 из 2 мкл РНК с помощью NanoDrop. Определить концентрацию РНК от A 260. На основе концентрации, разбавить РНК до 1 мкг / мкл с использованием DEPC обрабатывают водой.
ПРИМЕЧАНИЕ: отношение A 260/280 предоставляет информацию о тон чистота РНК. Образец РНК чистым, если соотношение 260/280 2.0 ± 0.1.
4. Северная блот анализ
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте северные помарки количественно уровни мРНК и получить информацию о размере транскриптов. Кроме того, использование нозерн-блоттинга для обнаружения мРНК получения нескольких изоформ одного и того же мРНК.
- Приготовьте 1,0% агарозном геле с формальдегидом. Запуск равные количества РНК образца на агарозном геле формальдегида с помощью электрофореза в соответствии со стандартными протоколами 12. Запуск РНК лестнице рядом образцов РНК и использовать его для определения размеров РНК, которые обнаружены на севере пятно. Перед передачей РНК, разделенных на агарозном геле формальдегида к мембране, разрезать полосу с РНК лестницы из геля и визуализации с использованием бромистый этидий.
Примечание: В качестве альтернативы, если весь гель может быть окрашивали бромистым этидием перед передачей РНК. - Образцы осле РНК мигрировали в надлежащем расстоянии от геля, трансфер РНК на мембрану с помощью РНКазы методы. Используйте один из нескольких имеющихся протоколов для передачи РНК мембран 12-13. Для передачи РНК на мембрану, сократить мембраны примерно того же размера, что и гель. Передача РНК в соответствии со стандартными протоколами 12.
- УФ кросс-Link РНК с мембраной с помощью УФ-сшивающий агент, следуя инструкциям изготовителя. Кроме того, печь мембраны в печь, установленную на 80 ° C в течение 1 часа. Хранить мембрану при -20 ° С в пластиковом пакете бесконечности, пока он не образует гибрид с специфических зондов.
ПРИМЕЧАНИЕ: сухая мембрана также может храниться при комнатной температуре между фильтровальной бумаги.
5. гибридизующиеся Зонды В дополнение к РНК интересов с мембраной
Примечание: Один из способов выявления мРНК на мембраны для гибридизации 32 P меченых ДНК-зондов. ВНИМАНИЕ: исследовrchers, работающие с 32 P необходимо использовать защитные процедуры для предотвращения загрязнения. Следуйте институциональные рекомендации по использованию радиоактивных материалов.
- Подготовка ДНК-зонда путем маркировки 25 - 50 нг ДНК, подлежащей гибридизации с мембраной в соответствии со стандартными протоколами 12. Генерирование фрагмент ДНК с помощью ПЦР или плазмиды пищеварения. Определить удельную активность ДНК-зонда путем подсчета 1 мкл меченого ДНК-зонда после некорпоративные нуклеотиды удал 12.
- Разогреть буфер предгибридизацию / гибридизация при 42 ° C. Использование ~ 10 мл буфера предгибридизацию / гибридизации на 100 см 2 мембраны 12.
- Гибридизоваться 1 - 5 × 10 6 СРМ радиоактивно меченного зонда ДНК на мл буфера гибридизации с мембраной O / N в гибридизации печи для обнаружения мРНК интерес 12. Убедитесь, что во время гибридизации вращение гибридизации печь в направлении,вызывает весь мембраны подвергаться растворе для гибридизации, чтобы обеспечить надлежащее гибридизации.
- Промыть мембраны в два раза при комнатной температуре в течение 15 мин с 50 мл 2 раза ПСПЭ и один раз при 65 ° С с 50 мл 2х ГНПП / 2% SDS в течение 15 мин 12. Оберните мембраны в полиэтиленовую пленку, чтобы убедиться, что он не высохнет и не загрязнять, люминесцентный экран.
- Используя счетчик Гейгера, оценить интенсивность радиоактивности на мембране.
Примечание: Эта оценка гарантирует, что мембрана подвергается люминесцентным экраном для соответствующего периода времени. Используйте более длительного времени воздействия для мембран с низким содержанием радиоактивности. - Для северных пятна, используйте контроль загрузки, чтобы подтвердить, что равные количества РНК установлен на каждом месте. Чтобы сделать это, лишить мембрану и reprobe его с РНК, которая не влияет на процесс изучается. Полоса мембрану, поместив его в стеклянную лоток, содержащий 200 мл кипящей зачистки раствора (0,1% SDS / 0,01 XSСК) в течение 2 мин. Вылейте зачистки решение и повторите процедуру пять раз 12.
Примечание:. Пример РНК использовали в качестве контроля нагрузки является SCR1 SCR1 является РНК-полимераза III транскрипт, что является стабильным и в изобилии SCR1 РНК изобилие не должно существенно меняться в течение коротких периодов РНК-полимеразы II, ингибирование..
6. Количественная РНК, которая связывается с мембраной
Примечание: Для определения количества радиоактивности на мембране, подвергнуть мембрану к люминесцентным экраном. После соответствующей времени экспозиции, сканирование, люминесцентный экран, используя Phosphorimager.
- Сканирование, люминесцентный экран, используя инструкции, предоставленные производителем Phosphorimager.
- Количественная мРНК в каждый момент времени. Количественного определения уровней мРНК с использованием ImageQuant программное обеспечение или программное обеспечение. Нормализация мРНК в каждый момент времени на контроль нагрузки. Если SCR1 был использован в качестве загрузкиконтроль, нормализовать Half-Life северян к SCR1.
- Период полураспада мРНК рассчитывается путем деления количества мРНК оставшееся в каждый момент времени на величину мРНК настоящее в момент времени 0 (начальная точка времени). Графе процентов мРНК оставшееся от времени в полулогарифмическом участка (рис 2С). Рассчитать мРНК полураспада по следующему уравнению:
т 1/2 = -0,693 / к (отрицательный 0.693) - К наклон наиболее соответствующей линии и т 1/2 мРНК Half-Life.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Способность этого протокола для точного измерения скорости распада мРНК зависит от ингибирования транскрипции, уборки дрожжевых клеток в соответствующих временных точках и использования РНКазы методов при извлечении РНК и нозерн-блоттинга. Исследование в течение двух мРНК управления известно, является нестабильным и стабильным, соответственно, обеспечивает уверенность в том, эксперимент удался. Например, это может быть достигнуто путем зондирования с зондом, который обнаруживает как CYH2 пре-мРНК и мРНК. 2В показывает исчезновение CYH2 пре-мРНК в дикого типа и NMD мутантных штаммов дрожжей в различные моменты времени после ингибирования транскрипции , CYH2 пре-мРНК деградирует быстрее в дрожжевых клетках с функциональным ПРО путь (UPF1) по отношению к дрожжевых клеток с нефункциональном ПРО пути (UPF1).
40fig1highres.jpg "/>
Рисунок 1. Метод блок-схему. Измерение мРНК скорости распада блок-схемы
Рисунок 2. мРНК полураспада CYH2 -Pre-мРНК и мРНК. (A) Схематическое представление CYH2 пре-мРНК и мРНК CYH2. CYH2 пре-мРНК неэффективно сращивания и транспортируется в цитоплазму, где он деградирует на ПРО путь. CYH2 мРНК не ухудшается по ПРО пути, так как ему не хватает содержащий интрон досрочном прекращении кодон (PTC). (B) Half-Life северные пятна РНК, выделенные из дикого типа (UPF1) и противоракетной обороны мутантных штаммов (UPF1). Моменты времени после TRAnscription ингибирование перечислены выше северных пятна. Блоты были исследованы с радиоактивным изотопом CYH2 ДНК. (C) график% CYH2 пре-мРНК остальные в зависимости от времени в дикого типа (UPF1) и противоракетной обороны мутантных штаммов (UPF1). Этот график показывает, что CYH2 пре-мРНК деградирует более быстрыми темпами, в дикого типа (UPF1), чем в американской системы мутантных штаммов дрожжей (UPF1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ингибирование синтеза мРНК и мониторинга оборот мРНК в отсутствии нового синтеза является метод, который часто используется для измерения скорости распада мРНК. В S. CEREVISIAE, измерение скоростей мРНК распада путем ингибирования транскрипции с использованием чувствительный к температуре аллель РНК-полимеразы II является одним из наиболее часто используемых методов. Этот метод специфически ингибирует РНК-полимеразы II. Наиболее важные шаги для определения скорости распада мРНК с использованием такой технологии являются: 1) До сбора урожая дрожжевых клеток, убедитесь, что транскрипция была отключена, поддерживая культуру в 39 ° С; 2) при добыче РНК и РНК гель шагов электрофореза протокола убедитесь, что РНКазы методы используются; 3) Используйте управления РНК для нормализации, чтобы гарантировать, что равные количества РНК были загружены, и что экспериментальные процедуры, как ожидалось; 4) повторить измерения на скорости мРНК распада, по крайней мере три раза, чтобы обеспечить воспроизводимость А.Н.d точность измерений Half-Life.
rpb1-1 дрожжевые штаммы, как правило, передается до 37 ° С, чтобы ингибировать транскрипцию. Тем не менее, мы обнаружили, что при 37 ° C ингибирования транскрипции происходит ~ 3 мин после сдвига температуры. В 39 ° C ингибирование транскрипции немедленно 4, 11. Тем не менее, использование этого метода для определения скорости распада мРНК имеет некоторые ограничения. Основное ограничение в том, что особый штамм дрожжей не требуется. Как отмечалось ранее, это штамм дрожжей либо могут быть получены из других лабораторий или генерируется в лаборатории, если требуется специфический дрожжевой генетический фон. После того, как штамм дрожжей получают, этот метод прост и прямо вперед. Второе ограничение в том, что метод влечет за собой подвергая дрожжевых клеток на тепловой шок ингибировать транскрипцию. Тепловой стресс может повлиять на клеточные процессы, включая скорость распада отдельных мРНК. Например, скорость распада этих мРНК Thaт кодируют белки, которые участвуют в реакции на стресс могут быть затронуты. И, наконец, использование штамм дрожжей с мутацией в РНК-полимеразы II может привести к получению альтернативных транскриптов, которые ведут себя по-разному от нормальных транскриптов.
Как было сказано во введении, другие методы используются для измерения скорости распада мРНК в S. Cerevisiae. Это включает в себя ингибирование транскрипции с использованием химикатов, таких как thiolutin и 1-10-фенантролином. Эти методы имеют то преимущество, что они могут сделать с помощью любой штамм дрожжей и скорости распада мРНК может быть также определена генома или для отдельных эндогенных транскриптов. Кроме того, измерения скорости распада мРНК может быть сделано в различных физиологических условиях. Полезность этих препаратов ограничивается тем, что они также могут повлиять на клеточные процессы и влиять на скорость распада мРНК, дифференциально. Кроме того, thiolutin не легко доступны и при наличиидорого.
После освоения этой техники можно будет определить мРНК скорости распада отдельных мРНК или генома. Кроме того, скорость распада мРНК может быть измерена в различных физиологических условиях, чтобы изучить ли различные условия влияют скорость распада мРНК, дифференциально.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| High Speed Centrifuge | Eppendorf | 22628169 | |
| Mini Centrifuge | Fisher Scientific | 05-090-100 | |
| Genescreen Plus membrane | PerkinElmer | 50-905-0169 | |
| Hybridization Oven | Fisher Scientific | 95-0030-01 | |
| Nanodrop spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-8000 | |
| Phosphor screen | GE Healthcare Life Sciences | 28-9564-78 | |
| Typhoon phosphorimager | GE Healthcare Life Sciences | 29004080 | |
| UV cross-linker | GE Healthcare Life Sciences | 80-6222-31 | Alternatively the membrane can be baked in an oven set to 80° for 1 hour |
| NorthernMax prehybridization/hybridization buffer | Life Technologies | AM8677 | |
| Yeast strains harboring the rpb1-1 mutation | Yeast strains can be obtained from a laboratory or created with a specific background |
References
- Nonet, M., Scafe, C., Sexton, J., Young, R. Eukaryotic RNA polymerase conditional mutant that rapidly ceases mRNA synthesis. Mol. Cell. Biol. 7, 1602-1616 (1987).
- Santiago, T. C., Purvis, I. J., Bethany, A. J., Brown, A. J. The relationship between mRNA stability and length in Saccharomyces cerevisiae. Nucleic Acids Res. 14 (21), 8347-8360 (1986).
- Jimenez, A., Tipper, D. J., Davies, J. Mode of action of thiolutin, an inhibitor of macromolecular synthesis in Saccharomyces cerevisiae. Antimicrob Agents Chemother. 3 (6), 729-738 Forthcoming.
- Herrick, D., Parker, R., Jacobson, A. Identification and Comparison of stable and unstable mRNAs in Saccharomyces cerevisiae. Mol Cell Biol. 10 (5), 2269-2284 Forthcoming.
- Grigull, J., Mnaimneh, S., Pootoolal, J., Robinson, M. D., Hughes, T. R. Genome-wide Analysis of mRNA Stability Using Transcription Inhibitors and Microarrays Reveals Postranscriptional Control of Ribosome Biogenesis Factors. Mol Cell Biol. 24 (12), 5534-5547 (2004).
- Tani, H., Akimitsu, N. Genome-wide technology for determining RNA stability in mammalian cells. RNA Biology. 9 (10), 1233-1238 (2012).
- Pelechano, V., Perez-Ortin, J. E. The transcriptional inhibitor thiolutin blocks mRNA degradation in yeast. Yeast. 25, 85-92 (2008).
- Kervestin, S., Jacobson, A. NMD: a multifaceted response to premature translational termination. Nat Rev Mol Cell Biol. 13, 700-712 (2012).
- Kolodziej, P. A., Woychik, N., Liao, S. M., Young, R. A. RNA Polymerase II subunit composition, stoichiometry and phosphorylation. Mol Cell Biol. 10 (5), 1270-1275 (1990).
- Ausubel, F. M., Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D. D., Seidman, J. G., Smith, J. A., Struhl, K. Current Protocols in Molecular Biology. , John Wiley and Sons, Inc.. (1998).
- Kebaara, B. W., Nazarenus, T., Taylor, R., Atkin, A. L. Genetic background affects relative nonsense mRNA accumulation in wild-type and upf mutant yeast strains Current Genetics). 43, 171-177 (2003).
- Kebaara, B. W., Baker, K. E., Patefield, K. D., Atkin, A. L. Analysis of Nonsense-Mediated mRNA Decay in Saccharomyces cerevisiae. Current Protocols in Cell Biology. 27 (27.3), 27.3.1-27.3.39 (2012).
- Hu, W., Coller, J. Methods for measuring mRNA Decay Rate in Saccharomycescerevisiae. Methods in Enzymology. 530, 137-155 (2013).
