mRNAの崩壊料金の測定で<em>サッカロマイセス·セレビシエ</em>使い方<em> rpb1-1</em>株
Summary
特定のmRNAの定常状態レベルは、mRNAの合成および減衰の速度によって決定される。ゲノムワイドなmRNAの分解速度または特定のmRNAの崩壊速度は、mRNAの半減期を決定することによって測定することができる。このプロトコルは、Saccharomyces cerevisiae中のmRNA減衰率の測定に焦点を当てています。
Abstract
mRNAの定常状態レベルは、環境条件に応じて変化する。 mRNAの定常状態の蓄積レベルの調節は、タンパク質の正確な量は、細胞の特定の増殖条件のために合成されることを保証する。 mRNA崩壊速度を測定するための一つのアプローチは、転写を阻害し、続いて、既に存在するmRNAの消失を監視している。 mRNA分解の速度を定量することができ、正確な半減期は、いくつかの技術を利用して決定することができる。 S.でセレビシエは 、mRNAの半減期を測定するためのプロトコルが開発され、RNAポリメラーゼII、rpb1-1の温度感受性対立遺伝子を保有する菌株を用いて、mRNAの転写を阻害することが含まれている。 mRNAの測定のための他の技術の半減期は、調節可能なプロモーターの制御下にあるmRNAを利用することにより、あるいはそのようなthiolutin又は1,10-フェナントロリンなどの転写阻害剤で転写を阻害する、または含むガラクトース誘導性プロモーター及びTETオフシステムとして。ここでは、Sの測定を説明RNAポリメラーゼIIの温度感受性対立遺伝子を使用した出芽酵母のmRNA減衰率。この技術は、個々のmRNAまたはゲノムワイドのmRNA崩壊速度を測定するために使用することができる。
Introduction
特定のmRNAの転写および減衰は、遺伝子発現の重要な決定因子である。特定のmRNAの合成及び減衰率は、その特定のmRNAの定常状態レベルを決定する。 mRNAの定常状態レベルは、mRNAの豊かさを支配し、タンパク質合成のために提供されてどのくらいの各mRNAの決定する。 mRNAの半減期の測定は、mRNAの減衰率を決定するために広く使用されている。 mRNAは、mRNAおよび環境条件によってコードされるタンパク質の機能の特徴に関連して異なる速度で特定のmRNAの崩壊。 mRNA崩壊速度を決定するために利用された技術に応じて、減衰率の測定は、グローバルに、または個々の転写物について決定することができる。酵母S.でセレビシエ 、最も一般的にグローバルなmRNA崩壊速度を測定するために使用される技法は、RNAポリメラーゼII及び化学transcの温度感受性対立遺伝子を保有する酵母菌株を利用含まそのようなthiolutin 1,10-フェナントロリン1-5としてriptional阻害。これらの方法は、個々のmRNA崩壊率4を測定するために利用することができる。他の方法もまた、mRNA崩壊速度を測定するために利用することができる。これらの方法は、定常状態の標識のみを選択条件において発現される調節されたプロモーターから発現されるmRNA分子の利用へのアプローチを含む。これらの技術は、それぞれ特定の利点と制限があります。ここに記載の技術は、RNAポリメラーゼIIの温度感受性対立遺伝子を利用する。この方法では、Sを使用してcerevisiaeのモデルとして、特定の転写阻害技法6を用いて、他のシステムに変更され、利用されことができるが。
RNAポリメラーゼIIの温度感受性対立遺伝子を用いたmRNAの半減期の測定は、広範囲のmRNA崩壊4-5の両方のゲノム全体および個々の測定のために使用される。この技術は、specifの使用を必要とするRNAポリメラーゼII、rpb1-1 1の温度感受性対立遺伝子を保有するでIC酵母株。この技術の原理は、非許容温度に温度感受性酵母株の曝露は、mRNA合成を阻害することである。転写が阻害された後に続いて、既存のmRNAの崩壊は、様々な時点で監視される。既存のmRNAの消失は、転写がオフにされた後の異なる時点での酵母細胞からRNAを抽出することによって監視される。酵母細胞が収穫される時点は、パイロット実験により所定の、および研究されて転写物およびシステムに依存している。より長い時点長く生き転写物のために使用されている間より速い時点は、短命の転写物のために使用される。その後、mRNAの崩壊は、ノーザンブロット分析、定量的PCRまたはRNAseqいずれかによって監視される。
TEを使用して、mRNAの半減期の測定RNAポリメラーゼIIのmperature敏感な対立遺伝子は、その利点を持っています。第一に、この技術は、簡単で単純である。酵母株は、実験室で取得又は生成されると、第二の、mRNAの半減期の測定は、異なる成長条件で測定することができる。 mRNA分解の環境影響の決定を可能にする。第三に、mRNA崩壊速度は、ゲノム全体を監視することができる。他の転写抑制技術の使用は、利点および限界を有する。例えば、誘導性プロモーターの使用は、調節されたプロモーターの制御下にあるmRNAを生成するためにサブクローニングを必要とする。 Thiolutinは容易に入手できないと利用可能な場合に高価である。また、アクションのthiolutinのモードは完全には理解されず、mRNA崩壊7の阻害を含む他の細胞プロセスに影響を与えることが報告されている。また、1,10-フェナントロリンは、より容易に利用可能である。さらに、転写を阻害するために使用される技術の全ては、PERTでき細胞機能をURBと異なる方法で異なるmRNAに影響を与えることができる。研究者は、最も信頼性の高い結果を得るために彼らの実験条件で使用する最も適切な方法を決定する必要がある。彼らのアプリケーションに最も適している方法を決定するために、研究者が研究されている転写産物によりコードされるタンパク質の転写物および機能を特定する必要があります。最も信頼性の高いmRNA崩壊速度測定は、複数の技術を使用して決定し、同一の減衰速度を示しているものである。単一の技術は常に最善ではない、と最も適切な手法は、特定の状況に依存します。
S.で多数の研究セレビシエは、様々な条件や遺伝的背景においてmRNA崩壊速度を測定した。 mRNA崩壊速度がで測定されている条件が検討され、特定の実験に依存しています。異なる細胞環境におけるmRNA崩壊速度を測定する条件があるか否かを判断する優先的に特定のmRNAの崩壊率に影響を調べた。 mRNAの減衰率も使用されている酵母株に依存して変化し得る。例えば、mRNA崩壊速度は、非機能的ナンセンス変異依存mRNA分解（NMD）経路と、野生型酵母細胞、酵母細胞で測定することができる。このmRNA分解経路は、これまでに検討されている全ての真核生物に見られ、それは早期翻訳8を終了し、mRNAの分解を誘発する。 NMDは当初早期終結コドンまたはナンセンスコドンとmRNAを分解する経路として同定されたが、今も自然なmRNAを含む非ナンセンスの発現を調節する経路として認識されている。経路の標的であるmRNAは急速に機能的なNMD経路を酵母細胞内で分解し、非機能的なNMD経路を酵母細胞中で安定化されている。したがって、この経路の直接の標的であるmRNAの半減期は、野生型酵母のセルが短い非機能的なNMD経路を有する酵母細胞と比較してのls。
Protocol
Representative Results
Discussion
mRNA合成の阻害は、新しい合成の非存在下でのmRNAの代謝回転を監視するには、しばしばmRNA崩壊速度を測定するために使用される方法である。 S.でセレビシエは、RNAポリメラーゼIIの温度感受性対立遺伝子を使用して転写を阻害することによってmRNA崩壊率の測定は、最も頻繁に使用される方法の一つである。この方法は、具体的にはRNAポリメラーゼIIを阻害する。この技術を用い?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Research in the author’s laboratory is supported by the Texas Higher Education Coordinating Board’s Norman Hackerman Advanced Research Program and start-up funds from Baylor University.
Materials
| Name of Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| High Speed Centrifuge | Eppendorf | 22628169 | |
| Mini Centrifuge | Fisher Scientific | 05-090-100 | |
| Genescreen Plus membrane | PerkinElmer | 50-905-0169 | |
| Hybridization Oven | Fisher Scientific | 95-0030-01 | |
| Nanodrop spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-8000 | |
| Phosphor screen | GE Healthcare Life Sciences | 28-9564-78 | |
| Typhoon phosphorimager | GE Healthcare Life Sciences | 29004080 | |
| UV cross-linker | GE Healthcare Life Sciences | 80-6222-31 | Alternatively the membrane can be baked in an oven set to 80° for 1 hour |
| NorthernMax prehybridization/hybridization buffer | Life Technologies | AM8677 | |
| Yeast strains harboring the rpb1-1 mutation | Yeast strains can be obtained from a laboratory or created with a specific background | ||
References
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