Måling af mRNA henfaldskurver i<em> Saccharomyces cerevisiae</em> Brug<em> Rpb1-1</em> Stammer
Summary
Steady state-niveau af specifikke mRNA'er er bestemt af hastigheden af syntese og nedbrydning af mRNA. Genom-dækkende mRNA nedbrydning satser eller henfaldet specifikke mRNA'er kan måles ved at bestemme mRNA halveringstider. Denne protokol fokuserer på måling af mRNA henfald satser i Saccharomyces cerevisiae.
Abstract
mRNA steady state-niveauerne varierer afhængigt af miljømæssige forhold. Regulering af steady state akkumulerende niveauer af et mRNA sikrer, at den korrekte mængde af protein syntetiseret til cellens specifikke vækstbetingelser. En metode til måling af mRNA henfaldskurverne er hæmmende transkription og efterfølgende overvåge forsvinden allerede er til stede mRNA. Hastigheden af mRNA henfald kan derefter kvantificeres, og en nøjagtig halveringstid kan bestemmes udnytte adskillige teknikker. I S. cerevisiae, protokoller, der måler mRNA halveringstider er blevet udviklet og indbefatter inhibering transkription af mRNA under anvendelse af stammer, der huser en temperaturfølsom allel af RNA-polymerase II, rpb1-1. Andre teknikker til måling af mRNA halveringstider omfatter hæmning transskription med transkriptionelle inhibitorer som thiolutin eller 1,10-phenanthrolin, eller alternativt ved at udnytte mRNA'er, der er under kontrol af en regulerbar promotorsåsom galactose inducerbare promotor og tet-off system. Her beskriver vi måling af S. cerevisiae mRNA henfaldskurverne hjælp af temperaturfølsomme allel af RNA-polymerase II. Denne teknik kan bruges til at måle mRNA henfaldskurverne enkelte mRNA'er eller hele genomet.
Introduction
Transkription og henfald af specifikke mRNA er afgørende determinanter for genekspression. Satsen for syntese og nedbrydning af specifikke mRNA'er bestemmer steady-state niveau af denne særlige mRNA. Steady state niveauer af mRNA'er regulerer overflod af mRNA'er og bestemme hvor meget af hver mRNA er tilgængelig for proteinsyntese. Målinger af mRNA halveringstider anvendes i udstrakt grad til at bestemme henfaldshastigheden af mRNA'er. Specifikke mRNA'er henfald ved forskellige hastigheder, der er relateret til funktioner af mRNA, funktionen af proteinet kodet af mRNA'en og miljøforhold. Afhængig af teknikken anvendes til at bestemme mRNA henfaldskurverne kan henfaldshastighed målinger bestemmes enten globalt eller for individuelle udskrifter. I gæren S. cerevisiae, de teknikker, der mest almindeligt anvendes til at måle den globale mRNA henfaldskurverne omfatter anvendelse af en gær stamme, der huser den temperaturfølsomme allel af RNA-polymerase II og kemisk transcriptional hæmmere såsom thiolutin og 1,10-phenanthrolin 1-5. Disse metoder kan også anvendes til at måle individuelle mRNA henfaldskurverne 4. Andre fremgangsmåder kan også anvendes til at måle mRNA henfaldskurverne. Disse metoder omfatter tilgang til steady state mærkning eller anvendelse af mRNA-molekyler, der er udtrykt fra en reguleret promotor, som kun udtrykkes i udvalgte forhold. Hver af disse teknikker har visse fordele og begrænsninger. Den her beskrevne teknik anvender den temperaturfølsomme allel af RNA-polymerase II. Denne metode bruger S. cerevisiae som den model, kan men blevet ændret og anvendt i andre systemer ved hjælp af specifikke transkriptionelle hæmning teknikker 6.
mRNA halveringstid målinger ved hjælp af temperaturfølsomme allel af RNA-polymerase II er flittigt brugt til både genom-dækkende og individuelle målinger af mRNA forfald 4-5. Denne teknik kræver anvendelse af et specific gær stamme, der huser et temperaturfølsomt allel af RNA-polymerase II, rpb1-1 1. Begrundelsen for denne teknik er, at eksponeringen af det temperaturfølsomme gærstamme til den ikke-permissive temperatur inhiberer mRNA-syntese. Efterfølgende henfald af forudeksisterende mRNA overvåges på forskellige tidspunkter efter transkription er blevet hæmmet. Forsvinden af forudeksisterende mRNA overvåges ved ekstraktion af RNA fra gærcellerne ved forskellige tidspunkter efter transkription er blevet slukket. De tidspunkter, hvor gærcellerne høstes er forudbestemt af et pilotforsøg, og afhænger af udskrifter og system, der undersøges. Hurtigere tidspunkter bruges til kortvarige udskrifter, mens længere tidspunkter bruges til længere levede udskrifter. Bagefter henfald af mRNA overvåges af enten Northern blot-analyse, kvantitativ PCR eller RNAseq.
Måling af mRNA halveringstider ved hjælp af en temperature følsomme allel af RNA-polymerase II har sine fordele. Først denne teknik er nem og ligetil. For det andet, når gærstammen erhverves eller frembringes i laboratoriet mRNA halveringstid målinger kan bestemmes i forskellige vækstbetingelser; muliggør bestemmelse af miljømæssig indflydelse på mRNA forfald. For det tredje kan mRNA henfaldskurverne overvåges genom-dækkende. Anvendelse af andre transskription hæmning teknikker har også fordele og begrænsninger. For eksempel er brugen af en inducerbar promotor kræver subkloning at generere et mRNA, der er under kontrol af den regulerede promotor. Thiolutin er ikke umiddelbart tilgængelig, og er dyrt, når de foreligger. Desuden er thiolutin virkningsmekanisme ikke fuldstændigt forstået, og det er blevet rapporteret at påvirke andre cellulære processer, herunder inhibering mRNA henfald 7. Alternativt 1,10-phenanthrolin, er mere let tilgængelige. Desuden er alle de teknikker, der anvendes til at inhibere transkription kan PertUrb cellulær funktion og kan påvirke forskellige mRNA'er i forskellige måder. En investigator har brug for at bestemme den mest hensigtsmæssige metode til at bruge i deres eksperimentelle betingelser for at opnå de mest pålidelige resultater. At afgøre, hvilken metode der er mest egnet til deres ansøgning, en forsker har brug for at identificere de udskrifter og funktion af proteiner kodet af udskrifter, der undersøges. De mest pålidelige mRNA henfaldshastighed målinger er dem, der bestemmes ved hjælp af flere teknikker og viser samme henfaldshastighed. Ingen enkelt teknik er altid bedst, og den mest hensigtsmæssige teknik afhænger af den specifikke situation.
Talrige undersøgelser i S. cerevisiae har målt mRNA henfald satser under forskellige forhold og genetiske baggrunde. De betingelser, mRNA henfaldet er målt i afhænger af den specifikke eksperiment, der undersøges. Måling mRNA henfald satser i forskellige cellulære miljøer, om forudsætningerne erundersøgte fortrinsvis påvirke henfaldet specifikke mRNA'er. Henfaldet af mRNA'er kan også variere afhængigt af gærstammen, der anvendes. For eksempel kan mRNA henfaldskurverne bestemmes i vildtype-gærceller og gærceller med et nonfunktionelt nonsens-medieret mRNA nedbrydning (NMD) pathway. Dette mRNA nedbrydningsvej findes i alle eukaryote organismer, der hidtil er blevet undersøgt, og det udløser nedbrydning af mRNA, der tidligt afslutter translation 8. NMD blev oprindeligt identificeret som en vej, der nedbryder mRNA med præmature termineringskodoner eller nonsens-kodoner, men er nu anerkendt som en vej, der også regulerer ekspressionen af ikke-nonsense med naturlige mRNA'er. mRNA'er, der er mål for forløbet hurtigt nedbrydes i gærceller med en funktionel NMD vej og stabiliseret i gærceller med en nonfunctional NMD vej. Således halveringstider på mRNA, der er direkte mål for denne vej er kortere i vildtype gær cells sammenlignet med gærceller med et nonfunktionelt NMD pathway.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hæmning af mRNA-syntese og overvågning mRNA omsætning i mangel af nye syntese er en metode, der ofte bruges til at måle mRNA henfald satser. I S. cerevisiae, måling af mRNA henfald ved at inhibere transkription ved hjælp af temperaturfølsomme allel af RNA-polymerase II er en af de hyppigst anvendte metoder. Denne metode specifikt inhiberer RNA-polymerase II. De mest kritiske trin til bestemmelse af mRNA henfald ved hjælp af denne teknik er: 1) inden høst gærcellerne sikre, at transskription er blevet …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Research in the author’s laboratory is supported by the Texas Higher Education Coordinating Board’s Norman Hackerman Advanced Research Program and start-up funds from Baylor University.
Materials
| Name of Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| High Speed Centrifuge | Eppendorf | 22628169 | |
| Mini Centrifuge | Fisher Scientific | 05-090-100 | |
| Genescreen Plus membrane | PerkinElmer | 50-905-0169 | |
| Hybridization Oven | Fisher Scientific | 95-0030-01 | |
| Nanodrop spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-8000 | |
| Phosphor screen | GE Healthcare Life Sciences | 28-9564-78 | |
| Typhoon phosphorimager | GE Healthcare Life Sciences | 29004080 | |
| UV cross-linker | GE Healthcare Life Sciences | 80-6222-31 | Alternatively the membrane can be baked in an oven set to 80° for 1 hour |
| NorthernMax prehybridization/hybridization buffer | Life Technologies | AM8677 | |
| Yeast strains harboring the rpb1-1 mutation | Yeast strains can be obtained from a laboratory or created with a specific background | ||
References
- Nonet, M., Scafe, C., Sexton, J., Young, R. Eukaryotic RNA polymerase conditional mutant that rapidly ceases mRNA synthesis. Mol. Cell. Biol. 7, 1602-1616 (1987).
- Santiago, T. C., Purvis, I. J., Bethany, A. J., Brown, A. J. The relationship between mRNA stability and length in Saccharomyces cerevisiae. Nucleic Acids Res. 14 (21), 8347-8360 (1986).
- Jimenez, A., Tipper, D. J., Davies, J. Mode of action of thiolutin, an inhibitor of macromolecular synthesis in Saccharomyces cerevisiae. Antimicrob Agents Chemother. 3 (6), 729-738 .
- Herrick, D., Parker, R., Jacobson, A. Identification and Comparison of stable and unstable mRNAs in Saccharomyces cerevisiae. Mol Cell Biol. 10 (5), 2269-2284 .
- Grigull, J., Mnaimneh, S., Pootoolal, J., Robinson, M. D., Hughes, T. R. Genome-wide Analysis of mRNA Stability Using Transcription Inhibitors and Microarrays Reveals Postranscriptional Control of Ribosome Biogenesis Factors. Mol Cell Biol. 24 (12), 5534-5547 (2004).
- Tani, H., Akimitsu, N. Genome-wide technology for determining RNA stability in mammalian cells. RNA Biology. 9 (10), 1233-1238 (2012).
- Pelechano, V., Perez-Ortin, J. E. The transcriptional inhibitor thiolutin blocks mRNA degradation in yeast. Yeast. 25, 85-92 (2008).
- Kervestin, S., Jacobson, A. NMD: a multifaceted response to premature translational termination. Nat Rev Mol Cell Biol. 13, 700-712 (2012).
- Kolodziej, P. A., Woychik, N., Liao, S. M., Young, R. A. RNA Polymerase II subunit composition, stoichiometry and phosphorylation. Mol Cell Biol. 10 (5), 1270-1275 (1990).
- Ausubel, F. M., Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D. D., Seidman, J. G., Smith, J. A., Struhl, K. . Current Protocols in Molecular Biology. , (1998).
- Kebaara, B. W., Nazarenus, T., Taylor, R., Atkin, A. L. Genetic background affects relative nonsense mRNA accumulation in wild-type and upf mutant yeast strains Current Genetics). 43, 171-177 (2003).
- Kebaara, B. W., Baker, K. E., Patefield, K. D., Atkin, A. L. Analysis of Nonsense-Mediated mRNA Decay in Saccharomyces cerevisiae. Current Protocols in Cell Biology. 27 (27.3), 27.3.1-27.3.39 (2012).
- Hu, W., Coller, J. Methods for measuring mRNA Decay Rate in Saccharomycescerevisiae. Methods in Enzymology. 530, 137-155 (2013).
