Summary

Måling af mRNA henfaldskurver i<em> Saccharomyces cerevisiae</em> Brug<em> Rpb1-1</em> Stammer

Published: December 13, 2014
doi:

Summary

Steady state-niveau af specifikke mRNA'er er bestemt af hastigheden af ​​syntese og nedbrydning af mRNA. Genom-dækkende mRNA nedbrydning satser eller henfaldet specifikke mRNA'er kan måles ved at bestemme mRNA halveringstider. Denne protokol fokuserer på måling af mRNA henfald satser i Saccharomyces cerevisiae.

Abstract

mRNA steady state-niveauerne varierer afhængigt af miljømæssige forhold. Regulering af steady state akkumulerende niveauer af et mRNA sikrer, at den korrekte mængde af protein syntetiseret til cellens specifikke vækstbetingelser. En metode til måling af mRNA henfaldskurverne er hæmmende transkription og efterfølgende overvåge forsvinden allerede er til stede mRNA. Hastigheden af ​​mRNA henfald kan derefter kvantificeres, og en nøjagtig halveringstid kan bestemmes udnytte adskillige teknikker. I S. cerevisiae, protokoller, der måler mRNA halveringstider er blevet udviklet og indbefatter inhibering transkription af mRNA under anvendelse af stammer, der huser en temperaturfølsom allel af RNA-polymerase II, rpb1-1. Andre teknikker til måling af mRNA halveringstider omfatter hæmning transskription med transkriptionelle inhibitorer som thiolutin eller 1,10-phenanthrolin, eller alternativt ved at udnytte mRNA'er, der er under kontrol af en regulerbar promotorsåsom galactose inducerbare promotor og tet-off system. Her beskriver vi måling af S. cerevisiae mRNA henfaldskurverne hjælp af temperaturfølsomme allel af RNA-polymerase II. Denne teknik kan bruges til at måle mRNA henfaldskurverne enkelte mRNA'er eller hele genomet.

Introduction

Transkription og henfald af specifikke mRNA er afgørende determinanter for genekspression. Satsen for syntese og nedbrydning af specifikke mRNA'er bestemmer steady-state niveau af denne særlige mRNA. Steady state niveauer af mRNA'er regulerer overflod af mRNA'er og bestemme hvor meget af hver mRNA er tilgængelig for proteinsyntese. Målinger af mRNA halveringstider anvendes i udstrakt grad til at bestemme henfaldshastigheden af ​​mRNA'er. Specifikke mRNA'er henfald ved forskellige hastigheder, der er relateret til funktioner af mRNA, funktionen af ​​proteinet kodet af mRNA'en og miljøforhold. Afhængig af teknikken anvendes til at bestemme mRNA henfaldskurverne kan henfaldshastighed målinger bestemmes enten globalt eller for individuelle udskrifter. I gæren S. cerevisiae, de teknikker, der mest almindeligt anvendes til at måle den globale mRNA henfaldskurverne omfatter anvendelse af en gær stamme, der huser den temperaturfølsomme allel af RNA-polymerase II og kemisk transcriptional hæmmere såsom thiolutin og 1,10-phenanthrolin 1-5. Disse metoder kan også anvendes til at måle individuelle mRNA henfaldskurverne 4. Andre fremgangsmåder kan også anvendes til at måle mRNA henfaldskurverne. Disse metoder omfatter tilgang til steady state mærkning eller anvendelse af mRNA-molekyler, der er udtrykt fra en reguleret promotor, som kun udtrykkes i udvalgte forhold. Hver af disse teknikker har visse fordele og begrænsninger. Den her beskrevne teknik anvender den temperaturfølsomme allel af RNA-polymerase II. Denne metode bruger S. cerevisiae som den model, kan men blevet ændret og anvendt i andre systemer ved hjælp af specifikke transkriptionelle hæmning teknikker 6.

mRNA halveringstid målinger ved hjælp af temperaturfølsomme allel af RNA-polymerase II er flittigt brugt til både genom-dækkende og individuelle målinger af mRNA forfald 4-5. Denne teknik kræver anvendelse af et specific gær stamme, der huser et temperaturfølsomt allel af RNA-polymerase II, rpb1-1 1. Begrundelsen for denne teknik er, at eksponeringen af ​​det temperaturfølsomme gærstamme til den ikke-permissive temperatur inhiberer mRNA-syntese. Efterfølgende henfald af forudeksisterende mRNA overvåges på forskellige tidspunkter efter transkription er blevet hæmmet. Forsvinden af ​​forudeksisterende mRNA overvåges ved ekstraktion af RNA fra gærcellerne ved forskellige tidspunkter efter transkription er blevet slukket. De tidspunkter, hvor gærcellerne høstes er forudbestemt af et pilotforsøg, og afhænger af udskrifter og system, der undersøges. Hurtigere tidspunkter bruges til kortvarige udskrifter, mens længere tidspunkter bruges til længere levede udskrifter. Bagefter henfald af mRNA overvåges af enten Northern blot-analyse, kvantitativ PCR eller RNAseq.

Måling af mRNA halveringstider ved hjælp af en temperature følsomme allel af RNA-polymerase II har sine fordele. Først denne teknik er nem og ligetil. For det andet, når gærstammen erhverves eller frembringes i laboratoriet mRNA halveringstid målinger kan bestemmes i forskellige vækstbetingelser; muliggør bestemmelse af miljømæssig indflydelse på mRNA forfald. For det tredje kan mRNA henfaldskurverne overvåges genom-dækkende. Anvendelse af andre transskription hæmning teknikker har også fordele og begrænsninger. For eksempel er brugen af ​​en inducerbar promotor kræver subkloning at generere et mRNA, der er under kontrol af den regulerede promotor. Thiolutin er ikke umiddelbart tilgængelig, og er dyrt, når de foreligger. Desuden er thiolutin virkningsmekanisme ikke fuldstændigt forstået, og det er blevet rapporteret at påvirke andre cellulære processer, herunder inhibering mRNA henfald 7. Alternativt 1,10-phenanthrolin, er mere let tilgængelige. Desuden er alle de teknikker, der anvendes til at inhibere transkription kan PertUrb cellulær funktion og kan påvirke forskellige mRNA'er i forskellige måder. En investigator har brug for at bestemme den mest hensigtsmæssige metode til at bruge i deres eksperimentelle betingelser for at opnå de mest pålidelige resultater. At afgøre, hvilken metode der er mest egnet til deres ansøgning, en forsker har brug for at identificere de udskrifter og funktion af proteiner kodet af udskrifter, der undersøges. De mest pålidelige mRNA henfaldshastighed målinger er dem, der bestemmes ved hjælp af flere teknikker og viser samme henfaldshastighed. Ingen enkelt teknik er altid bedst, og den mest hensigtsmæssige teknik afhænger af den specifikke situation.

Talrige undersøgelser i S. cerevisiae har målt mRNA henfald satser under forskellige forhold og genetiske baggrunde. De betingelser, mRNA henfaldet er målt i afhænger af den specifikke eksperiment, der undersøges. Måling mRNA henfald satser i forskellige cellulære miljøer, om forudsætningerne erundersøgte fortrinsvis påvirke henfaldet specifikke mRNA'er. Henfaldet af mRNA'er kan også variere afhængigt af gærstammen, der anvendes. For eksempel kan mRNA henfaldskurverne bestemmes i vildtype-gærceller og gærceller med et nonfunktionelt nonsens-medieret mRNA nedbrydning (NMD) pathway. Dette mRNA nedbrydningsvej findes i alle eukaryote organismer, der hidtil er blevet undersøgt, og det udløser nedbrydning af mRNA, der tidligt afslutter translation 8. NMD blev oprindeligt identificeret som en vej, der nedbryder mRNA med præmature termineringskodoner eller nonsens-kodoner, men er nu anerkendt som en vej, der også regulerer ekspressionen af ​​ikke-nonsense med naturlige mRNA'er. mRNA'er, der er mål for forløbet hurtigt nedbrydes i gærceller med en funktionel NMD vej og stabiliseret i gærceller med en nonfunctional NMD vej. Således halveringstider på mRNA, der er direkte mål for denne vej er kortere i vildtype gær cells sammenlignet med gærceller med et nonfunktionelt NMD pathway.

Protocol

1. Vækst af gærceller Vælg de relevante gærstammer, der skal udnyttes til mRNA henfaldshastighed målinger. At inhibere transkription ved hjælp af temperaturfølsomme allel af RNA-polymerase II, bruge gærstammer huser rpb1-1 mutation 1. Opnå dette gærstamme fra et laboratorium, der allerede har en, eller generere den i laboratoriet ved hjælp af standard teknikker, hvis en bestemt genetisk baggrund er påkrævet 9. Anvendelse af steril teknik forberede gær med…

Representative Results

Evnen af ​​denne protokol til nøjagtigt at måle mRNA henfaldskurverne afhænger hæmning af transskription, høst af gærceller på passende tidspunkter, og udnyttelse af RNase gratis teknikker, mens udvinding RNA og Northern blotting. Sondering for to kontrol mRNA kendt for at være ustabil og stabil, henholdsvis giver tillid til, at forsøget virkede. For eksempel kan dette opnås ved at probe med en probe, der detekterer både CYH2 præ-mRNA og mRNA. Figur 2B viser forsvinden af …

Discussion

Hæmning af mRNA-syntese og overvågning mRNA omsætning i mangel af nye syntese er en metode, der ofte bruges til at måle mRNA henfald satser. I S. cerevisiae, måling af mRNA henfald ved at inhibere transkription ved hjælp af temperaturfølsomme allel af RNA-polymerase II er en af de hyppigst anvendte metoder. Denne metode specifikt inhiberer RNA-polymerase II. De mest kritiske trin til bestemmelse af mRNA henfald ved hjælp af denne teknik er: 1) inden høst gærcellerne sikre, at transskription er blevet …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Research in the author’s laboratory is supported by the Texas Higher Education Coordinating Board’s Norman Hackerman Advanced Research Program and start-up funds from Baylor University.

Materials

Name of Material/Equipment Company Catalog Number Comments/Description
High Speed Centrifuge Eppendorf 22628169
Mini Centrifuge Fisher Scientific 05-090-100
Genescreen Plus membrane PerkinElmer 50-905-0169
Hybridization Oven Fisher Scientific 95-0030-01
Nanodrop spectrophotometer Thermo Scientific ND-8000
Phosphor screen GE Healthcare Life Sciences 28-9564-78
Typhoon phosphorimager GE Healthcare Life Sciences 29004080
UV cross-linker GE Healthcare Life Sciences 80-6222-31 Alternatively the membrane can be baked in an oven set to 80° for 1 hour
NorthernMax prehybridization/hybridization buffer  Life Technologies AM8677
Yeast strains harboring the rpb1-1 mutation Yeast strains can be obtained from a laboratory or created with a specific background

References

  1. Nonet, M., Scafe, C., Sexton, J., Young, R. Eukaryotic RNA polymerase conditional mutant that rapidly ceases mRNA synthesis. Mol. Cell. Biol. 7, 1602-1616 (1987).
  2. Santiago, T. C., Purvis, I. J., Bethany, A. J., Brown, A. J. The relationship between mRNA stability and length in Saccharomyces cerevisiae. Nucleic Acids Res. 14 (21), 8347-8360 (1986).
  3. Jimenez, A., Tipper, D. J., Davies, J. Mode of action of thiolutin, an inhibitor of macromolecular synthesis in Saccharomyces cerevisiae. Antimicrob Agents Chemother. 3 (6), 729-738 .
  4. Herrick, D., Parker, R., Jacobson, A. Identification and Comparison of stable and unstable mRNAs in Saccharomyces cerevisiae. Mol Cell Biol. 10 (5), 2269-2284 .
  5. Grigull, J., Mnaimneh, S., Pootoolal, J., Robinson, M. D., Hughes, T. R. Genome-wide Analysis of mRNA Stability Using Transcription Inhibitors and Microarrays Reveals Postranscriptional Control of Ribosome Biogenesis Factors. Mol Cell Biol. 24 (12), 5534-5547 (2004).
  6. Tani, H., Akimitsu, N. Genome-wide technology for determining RNA stability in mammalian cells. RNA Biology. 9 (10), 1233-1238 (2012).
  7. Pelechano, V., Perez-Ortin, J. E. The transcriptional inhibitor thiolutin blocks mRNA degradation in yeast. Yeast. 25, 85-92 (2008).
  8. Kervestin, S., Jacobson, A. NMD: a multifaceted response to premature translational termination. Nat Rev Mol Cell Biol. 13, 700-712 (2012).
  9. Kolodziej, P. A., Woychik, N., Liao, S. M., Young, R. A. RNA Polymerase II subunit composition, stoichiometry and phosphorylation. Mol Cell Biol. 10 (5), 1270-1275 (1990).
  10. Ausubel, F. M., Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D. D., Seidman, J. G., Smith, J. A., Struhl, K. . Current Protocols in Molecular Biology. , (1998).
  11. Kebaara, B. W., Nazarenus, T., Taylor, R., Atkin, A. L. Genetic background affects relative nonsense mRNA accumulation in wild-type and upf mutant yeast strains Current Genetics). 43, 171-177 (2003).
  12. Kebaara, B. W., Baker, K. E., Patefield, K. D., Atkin, A. L. Analysis of Nonsense-Mediated mRNA Decay in Saccharomyces cerevisiae. Current Protocols in Cell Biology. 27 (27.3), 27.3.1-27.3.39 (2012).
  13. Hu, W., Coller, J. Methods for measuring mRNA Decay Rate in Saccharomycescerevisiae. Methods in Enzymology. 530, 137-155 (2013).

Play Video

Cite This Article
Peccarelli, M., Kebaara, B. W. Measurement of mRNA Decay Rates in Saccharomyces cerevisiae Using rpb1-1 Strains. J. Vis. Exp. (94), e52240, doi:10.3791/52240 (2014).

View Video