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Biology

आधार जोड़ी संकल्प पर डीएनए मेथिलिकरण के आकलन के लिए प्रतिनिधित्व Bisulfite अनुक्रमण कम बढ़ाया

Published: February 24, 2015 doi: 10.3791/52246
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1,2, 1, 3, 4, 1
1Department of Medicine, Weill Cornell Medical College, 2Institute for Computational Biomedicine, Weill Cornell Medical College, 3Department of Physiology and Biophysics, Weill Cornell Medical College, 4Department of Pathology, University of Michigan
* These authors contributed equally

Abstract

डीएनए मेथिलिकरण पैटर्न मानचित्रण भारी सामान्य और रोगग्रस्त ऊतकों में अध्ययन किया है। तरीकों की एक किस्म की कोशिकाओं में साइटोसिन मिथाइलेशन पैटर्न से पूछताछ करने के लिए स्थापित किया गया है। पूरे जीनोम bisulfite अनुक्रमण के कम प्रतिनिधित्व जीसी अमीर जीनोमिक loci में मात्रात्मक आधार जोड़ी संकल्प साइटोसिन मिथाइलेशन पैटर्न का पता लगाने के लिए विकसित किया गया था। इस bisulfite रूपांतरण के बाद प्रतिबंध एंजाइम के उपयोग के संयोजन से पूरा होता है। बढ़ी कम प्रतिनिधित्व Bisulfite अनुक्रमण (ERRBS) कवर जैविक रूप से प्रासंगिक जीनोमिक loci बढ़ जाती है और मानव, माउस और अन्य जीवों से डीएनए में साइटोसिन मेथिलिकरण प्रोफ़ाइल करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। ERRBS पुस्तकालय तैयारी के लिए उपयोग में कम आणविक भार टुकड़े उत्पन्न करने के लिए डीएनए के प्रतिबंध एंजाइम पाचन के साथ शुरू की। इन टुकड़ों को अगली पीढ़ी के अनुक्रमण के लिए मानक पुस्तकालय निर्माण के अधीन हैं। अंतिम amplificati करने से पहले unmethylated cytosines के bisulfite रूपांतरणकदम पर कवर जीनोमिक loci में साइटोसिन मिथाइलेशन के स्तर के मात्रात्मक आधार संकल्प के लिए अनुमति देता है। प्रोटोकॉल चार दिनों के भीतर पूरा किया जा सकता है। एक नामित अनुक्रमण नियंत्रण लेन का उपयोग करते समय अनुक्रम पहले तीन ठिकानों में कम जटिलता के बावजूद, ERRBS पुस्तकालयों उच्च गुणवत्ता वाले डेटा उपज। मानचित्रण और जैव सूचना विज्ञान विश्लेषण तो किया जाता है और पैदावार डेटा आसानी से जीनोम चौड़ा प्लेटफार्मों की एक किस्म के साथ एकीकृत किया जा सकता है। ERRBS यह संभव अनुसंधान आवेदनों की एक रेंज में मानव नैदानिक ​​नमूने और लागू संसाधित करने के लिए कर रही है छोटे इनपुट सामग्री मात्रा में उपयोग कर सकते हैं। उत्पादित वीडियो ERRBS प्रोटोकॉल का महत्वपूर्ण कदम को दर्शाता है।

Introduction

साइटोसिन (5 मिथाइलसिटोसाइन) में डीएनए मेथिलिकरण, जैविक प्रक्रियाओं की एक किस्म के लिए स्तनधारी कोशिकाओं में महत्वपूर्ण सहित, लेकिन Imprinting, एक्स गुणसूत्र निष्क्रियता, विकास, और जीन अभिव्यक्ति 1-8 के नियमन के लिए सीमित नहीं है और एक epigenetic निशान है। घातक और अन्य विकारों में डीएनए मेथिलिकरण पैटर्न के अध्ययन के रोग विशिष्ट पैटर्न निर्धारित और रोग रोगजनन और संभावित बायोमार्कर खोजों 17/09 की समझ के लिए योगदान दिया है। डीएनए मेथिलिकरण स्थिति के लिए epigenome पूछताछ कि कई प्रोटोकॉल रहे हैं। ये समानता के आधार पर बांटा जा सकता है, प्रतिबंध एंजाइम आधारित है, और नीचे की ओर माइक्रोएरे या अनुक्रमण प्लेटफार्मों का उपयोग कि bisulfite रूपांतरण आधारित assays। इसके अलावा, इन सामान्य श्रेणियों सहित, लेकिन, संयुक्त Bisulfite प्रतिबंध विश्लेषण 18 तक ही सीमित और प्रतिनिधित्व Bisulfite अनुक्रमण (आरआरबी 19) से कम नहीं है कि पुल कुछ प्रोटोकॉल रहे हैं। क्षेत्रीय ग्रामीण बैंकों मूल Meissner एट अल। 19,20 द्वारा बताया गया था। प्रोटोकॉल लागत 21,22 प्रभावी है कि मात्रात्मक आधार जोड़ी संकल्प डेटा के परिणामस्वरूप जो bisulfite अनुक्रमण द्वारा पीछा जीसी अमीर जीनोमिक क्षेत्रों को समृद्ध करने के लिए एक कदम की शुरुआत की। जीसी अमीर क्षेत्रों MspI (सी ^ CGG) के प्रतिबंध एंजाइम द्वारा लक्षित कर रहे हैं, और साइटोसिन मेथिलिकरण पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) प्रवर्धन द्वारा पीछा cytosines के bisulfite रूपांतरण (uracil को असंशोधित cytosines के deamination) द्वारा हल हो गई है। क्षेत्रीय ग्रामीण बैंकों जीन प्रमोटरों और एक पूरे जीनोम के लिए आवश्यक अनुक्रमण के एक अंश में CPG द्वीपों के बहुमत को कवर किया; हालांकि क्षेत्रीय ग्रामीण बैंकों CPG तटों और जैविक प्रासंगिकता के अन्य intergenic क्षेत्रों के सीमित कवरेज किया था। कई समूहों इन जीनोमिक क्षेत्रों 23-25 ​​की कार्यप्रणाली और उसके एवज में कवरेज पर सुधार है कि मूल रिपोर्ट के बाद से क्षेत्रीय ग्रामीण बैंकों प्रोटोकॉल अद्यतन प्रकाशित किया है। बढ़ी कम प्रतिनिधित्व Bisulfite Sequencing (ERRBS) क्षेत्रीय ग्रामीण बैंकों की तुलना में जब पुस्तकालय तैयारी संशोधनों और एक वैकल्पिक डेटा संरेखण दृष्टिकोण 26 में शामिल हैं। ERRBS उत्पन्न डेटा में प्रतिनिधित्व CpGs के एक उच्च संख्या में हुई है और सभी जीनोमिक क्षेत्रों के कवरेज 26 से पूछताछ की वृद्धि हुई है। इस विधि मानव रोगी और अन्य पशु नमूनों 26-30 में डीएनए मेथिलिकरण पैटर्न को हल करने के लिए इस्तेमाल किया गया है।

ERRBS प्रोटोकॉल पूरा होने और प्रतिनिधि मानव डीएनए का उपयोग कर उत्पन्न किया गया डेटा के लिए आवश्यक सभी कदम पर ऑफर के विवरण में वर्णित (नमूने जैसा कि पहले बताया, डे-पहचान रोगी के नमूने 31 से प्राप्त की है, और एक सामान्य मानव दाता से एक CD34 + अस्थि मज्जा नमूना गया)। प्रोटोकॉल नमूना प्रति प्रसंस्करण समय कम कर देता है और पुस्तकालय आकार चयन में वृद्धि की सटीकता के लिए अनुमति देता है जो एक स्वचालित आकार के चयन की प्रक्रिया भी शामिल है। प्रोटोकॉल की स्थापना की आणविक जीव विज्ञान और तकनीक की एक श्रृंखला को जोड़ती है। उच्च आणविक भार डीएनए डब्ल्यू पच जाता हैअंत मरम्मत, ए-पीछा, और methylated एडेप्टर के बंधाव के बाद मेथिलिकरण-असंवेदनशील प्रतिबंध एंजाइम (MspI) रबर। जीसी अमीर टुकड़े का आकार चयन bisulfite रूपांतरण और अनुक्रमण के लिए पहले पीसीआर प्रवर्धन द्वारा पीछा किया जाता है। Bisulfite रूपांतरण पहले किया गया 32 में वर्णित है और डेटा विश्लेषण और आवेदनों की विस्तृत समीक्षा की सिफारिशों और संदर्भ 'पाठकों के उपयोग के लिए शामिल किए गए हैं हालांकि इस पत्र के दायरे से परे है। प्रोटोकॉल चार दिनों में प्रदर्शन किया और छोटे इनपुट (50 एनजी या कम) सामग्री मात्रा में करने के लिए उत्तरदायी है किया जा सकता है। अंतर मेथिलिकरण साइट और क्षेत्र निर्धारण के लिए बल्कि epigenetic बहुरूपता का पता लगाने के लिए न केवल पर्याप्त CPG साइट प्रति उच्च कवरेज के साथ वर्णित पैदावार डेटा के रूप में प्रोटोकॉल, एट अल। 33 Landan द्वारा वर्णित के रूप में।

Protocol

निष्पादित सभी प्रक्रियाओं चिकित्सा संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति के इंडियाना विश्वविद्यालय के स्कूल ने मंजूरी दे दी है और स्वास्थ्य के दिशा निर्देशों के राष्ट्रीय संस्थान का पालन कर रहे हैं।

1. सर्जिकल तकनीक

  1. बाँझ दस्ताने, उपकरण, और एनआईएच दिशा निर्देशों के 25 के अनुसार एक बाँझ शल्य चिकित्सा क्षेत्र का उपयोग करके इस प्रक्रिया के दौरान सड़न रोकनेवाला तकनीक बनाए रखें। उन्हें autoclaving द्वारा सर्जरी की शुरुआत से पहले उपकरण जीवाणुरहित (पूरी सूची के लिए विशिष्ट अभिकर्मकों / उपकरण की तालिका देखें)। आपरेशन के दौरान उपकरण जीवाणुरहित करने के लिए एक गिलास मनका अजीवाणु का प्रयोग करें।

2. संज्ञाहरण और तैयारी

  1. एक पशु चिकित्सा isoflurane vaporizer प्रणाली का उपयोग करते हुए 0.9 एल / मिनट ऑक्सीजन और 2.5% isoflurane के एक मिश्रण के साथ एक संज्ञाहरण बॉक्स में माउस anesthetize। माउस बॉक्स से इसे हटाने से पहले शरीर की स्थिति में परिवर्तन करने के लिए जवाब नहीं है कि सुनिश्चित करें।
  2. समझौता ज्ञापन के नेत्र मरहम लागू करेंएसई की आँखें बाहर सुखाने से उन्हें बचाने के लिए।
  3. नाक शंकु के लिए बॉक्स से गैस का प्रवाह स्विच करें। शंकु के अंदर अपनी नाक और मुंह के साथ एक शल्य चिकित्सा पैड और शोषक बेंच कागज के साथ कवर एक गर्म पैड पर अपनी बाईं ओर पर squarely माउस रखें। लगातार माउस की सांस लेने ताल और दर पर नजर रखने और जरूरत के रूप में isoflurane के स्तर को समायोजित - संज्ञाहरण की एक पर्याप्त स्तर बनाए रखने के लिए (2.5 के बीच 3 isoflurane%), और कुल बेहोश करने की पुष्टि करने के लिए पैर की अंगुली चुटकी पलटा उपयोग करें।

3. सर्जिकल दृष्टिकोण

  1. संरेखित करें और शल्य चिकित्सा क्षेत्र के साथ स्टिरियोस्कोप ध्यान केंद्रित। नाक शंकु समायोजित करें और यह दृश्य क्षेत्र की बढ़त के साथ तैनात किया गया है ताकि इसे नीचे टेप।
  2. माउस अपनी बाईं ओर झूठ बोल के साथ, चीरा बनाया जाएगा जहां कान के पीछे क्षेत्र को प्रकाश में लाने, नाक शंकु के लिए सही कान के किनारे टेप। पीछे चुपचाप कान मे कहा नस कान भर में क्षैतिज यात्रा करता है कि सुनिश्चित करें। ध्यान दें कि टी का सही स्थानवह पशु और कान के टेप जल्दी से चेहरे की नस को खोजने के लिए महत्वपूर्ण हैं।
  3. पर और 70% इथेनॉल के साथ कान के पीछे फर गीले और एक रेजर या स्केलपेल ब्लेड का उपयोग शल्य साइट दाढ़ी। प्री-गीला फर इस संरचनात्मक स्थान में आसान हजामत बनाता है।
  4. 70% इथेनॉल के द्वारा पीछा ऐसे Betadine शल्य साफ़ (7.5% povidone आयोडीन) के रूप में एक आयोडीन समाधान है, के साथ त्वचा को साफ करें। अच्छी तरह से क्षेत्र कीटाणुरहित करने के लिए इस सफाई दो बार दोहराएँ।
  5. , चीरा बनाने के कान उभार को क्षेत्र पीछे करने के लिए दुमदारी कान से पीछे चुपचाप कान मे कहा नस का पता लगाने के लिए स्थान का निर्धारण करने के लिए। उभार को 3 मिमी पीछे - वसंत कैंची का प्रयोग, एक 4 मिमी चीरा 2 बनाते हैं।
  6. कुंद विच्छेदन का उपयोग कर वसा और प्रावरणी के माध्यम से काटना। रक्त वाहिकाओं या मांसपेशियों के ऊतकों को आसानी से क्षतिग्रस्त हो सकता है क्योंकि कैंची के साथ सीधे काटने से बचें।
  7. खून बह रहा होता है, तो एक बाँझ कपास झाड़ू के साथ शल्य साइट के लिए दबाव लागूकम से कम 30 सेकंड के लिए। महत्वपूर्ण द्रव नुकसान होता है, तो एक 25 या 27 जी सुई का उपयोग बाँझ 0.9% खारा समाधान के मिलीलीटर 0.5 के साथ intraperitoneally माउस इंजेक्षन।
  8. चेहरे तंत्रिका पता लगाने के लिए, कई महत्वपूर्ण स्थलों, रीढ़ की हड्डी में गौण तंत्रिका, कान नहर का प्रयोग करें, और (नीचे वर्णित) द्वितुंदी मांसपेशी पूर्वकाल। चेहरे तंत्रिका की शाखाओं कल्पना कर रहे हैं जब तक इन स्थलों के आसपास काटना। यह पता चला है जब तंत्रिका एक महत्वपूर्ण ठोस सफेद संरचना के रूप में दिखाई देगा और प्रावरणी की एक परत अंतर्निहित संरचनाओं के लिए यह पालन करता है।
    1. वसा और प्रावरणी विच्छेदित किया गया है एक बार, trapezius मांसपेशी अंदर आना खोपड़ी की दुम भाग से यात्रा जो रीढ़ की हड्डी में गौण तंत्रिका, का पता लगाएं। चेहरे तंत्रिका रीढ़ की हड्डी में गौण तंत्रिका को गहरा है।
    2. मोती सफेद लग रहा है और चेहरे की हिम्मत करने के लिए व्याख्यान चबूतरे वाला देखा जा सकता है कि उपास्थि कान नहर का पता लगाएं।
    3. के शीर्ष और ग पर स्थित है कि पूर्वकाल द्वितुंदी मांसपेशियों की मांसपेशियों पेट का पता लगाएंचेहरे तंत्रिका को audal।
  9. चेहरे तंत्रिका की मुख्य शाखाओं में कल्पना कर रहे हैं, जब stylomastoid रंध्र से उनके मूल खोजने के लिए पीछे की ओर से उन्हें पता लगा। , खुले शल्य साइट पकड़ तंत्रिका के मार्ग का अनुसरण वसंत कैंची सुझावों अग्रिम, फिर खुला नव उन्नत क्षेत्र रखने के लिए पीछे की ओर संदंश स्थानांतरित करने के लिए ठीक इत्तला दे दी Dumont संदंश # 5/45 का उपयोग करना।
  10. इस बिंदु पर गाल की हड्डी, मुख के साथ चेहरे तंत्रिका के ट्रंक, और सीमांत जबड़े शाखाओं कल्पना।
    नोट: अस्थायी शाखा रंध्र के करीब मिल जाएगा। इसकी ऊपरी और निचले भागों में सीमांत जबड़े तंत्रिका शाखाओं के करीब जबड़े के लिए, इस प्रकार उन तंत्रिका शाखाओं इस स्तर पर नहीं दिखाई देंगे।
    1. एक तंत्रिका transection प्रदर्शन कर करते हैं, तो ठीक टिप संदंश के साथ धीरे तंत्रिका को स्थिर करने और वसंत कैंची से तंत्रिका काटा। Brainstem से तंत्रिका avulsing को रोकने के लिए संदंश के साथ तंत्रिका करने के लिए बहुत ज्यादा कर्षण लागू करने से बचें। धक्का देंदूर एक दूसरे को, या कटौती और बाहर का तंत्रिका के एक हिस्से को हटाने से स्टंप कोई कनेक्शन हो सकता है कि यह सुनिश्चित करने के लिए।
    2. एक क्रश चोट के प्रदर्शन है, तो, सभी एक्सोन तोड़ पहला क्रश साइट सीधा करने के लिए एक दूसरे के कोण पर इस कुचलने दोहराने के लिए लगातार दबाव का उपयोग कर 30 सेकंड के लिए तंत्रिका सेक करने के लिए ड्यूमॉन्ट # 5/45 संदंश का उपयोग करें। अन्यथा चोट जानवरों के बीच असंगत हो जाएगा, 30 सेकंड कुचलने के दौरान दबाव के चर मात्रा में आवेदन करने से बचें।

4. बंद करने और वसूली

  1. अंतर्निहित संरचनाओं से अधिक वसा और मांसपेशियों का स्थान बदलें।
  2. चीरा के किनारों अनुमानित और एक 7.5 मिमी घाव क्लिप का उपयोग कर घाव को बंद करें। टांके या गोंद भी घाव बंद करने के लिए स्वीकार्य हैं। Postsurgical दर्दनाशक दवाओं इस समय उपलब्ध कराया जा सकता है।
  3. माउस के कान से टेप निकालें। Isoflurane के प्रवाह को बंद करें और माउस एक मिनट 30 सेकंड के लिए शुद्ध ऑक्सीजन साँस लेने के लिए अनुमति देते हैं। Plसंज्ञाहरण से उबरने के लिए कोई बिस्तर के साथ एक खाली पिंजरे में माउस ऐस।
  4. माउस बरामद किया जाता है, चेहरे का पक्षाघात की पुष्टि के संकेत के लिए अपने व्यवहार की जांच। मूंछ पंगु और वापस गाल की ओर angled किया जाएगा, नाक भटक जाएगा, और आंख हवा का एक कश के जवाब में झपकी नहीं होगा।
  5. घर पशुओं संयुक्त रूप से सर्जरी के बाद वे महिला हैं। वे अधिक आक्रामक हो रहे हैं और जबरन संक्रमण की ओर जाता है जो उनके cagemate के घाव क्लिप, को दूर करने के लिए करते हैं क्योंकि संयुक्त रूप से पुरुष चूहों आवास से बचें। यदि आवश्यक हो, इस समय postsurgical दर्दनाशक दवाओं प्रदान करें।
  6. कोई संक्रमण या अन्य जटिलता postoperatively होता है कि यह सुनिश्चित करने के लिए ऑपरेशन के बाद कई दिनों के लिए एक दिन में एक बार चूहों मॉनिटर। वे अपने दम पर बाहर गिर नहीं किया है तो सर्जरी के बाद 10 दिन - घाव क्लिप 7 निकालें।
  7. आंख झपकी पलटा पुनः है या तो जब तक, दैनिक कॉर्निया जटिलताओं को रोकने के लिए प्रभावित आंख से आंख मरहम चिकनाई लागू करेंकवर या इच्छामृत्यु जब तक।

Representative Results

चित्रा 1 वर्णित प्रोटोकॉल भर में व्याख्या कर रहे हैं, जो महत्वपूर्ण कदम, पर प्रकाश डाला, ERRBS के एक सिंहावलोकन प्रदान करता है। ERRBS पुस्तकालयों 50 एनजी इनपुट डीएनए का उपयोग कर तैयार किया गया था।

तैयार पुस्तकालयों की गुणवत्ता का मूल्यांकन। लाइब्रेरी उत्पादन नियमित तौर पर 150-250 बीपी और 250-400 बीपी (चित्रा 3 ए-सी) के अंश का आकार पैदावार। नमूने के बीच पुस्तकालय आकार वितरण में मामूली अंतर उम्मीद कर रहे हैं। एक विशेष दृश्य के संवर्धन का संकेत बहुत तीव्र डीएनए आकार रहे हैं, वहाँ दोनों कम और उच्च पुस्तकालय भागों में ध्यान दें। दोहराए डीएनए के एक परिवार के संवर्धन में MspI पाचन परिणाम 190 बीपी, 250 बीपी और ERRBS पुस्तकालयों में 310 बीपी पर मानव जीनोम में मौजूद दृश्यों। ये तीन दोहराता (आंकड़े 3 ए-सी और 3 जी देखें) एक ERRBS पुस्तकालय में 20 की एक विशेषता हस्ताक्षर का प्रतिनिधित्व करते हैं। प्रतिनिधि पुस्तकालयों एक अगली पीढ़ी के अनुक्रम पर अनुक्रम गयाआर का उपयोग कर एकल अंत पढ़ता है। एक Illumina HiSeq 2500 Sequencer पर सिफारिश पुस्तकालय एकाग्रता में लोड हो रहा है, जब 2 मिमी प्रति 500,000-700,000 के क्लस्टर घनत्व उम्मीद कर रहे हैं। समूहों के इस क्लस्टरिंग घनत्व, 81.6% ± 3.14% (एन = 81) पर फिल्टर (चित्रा -4 ए) गुजरती हैं। कारण पुस्तकालय आवेषण के कम जटिलता अंत (MspI मान्यता साइट: सी ^ सीजीजी) के लिए एक स्वतंत्र नियंत्रण लेन, तो अनुक्रमण के दौरान दर्ज की तीव्रता मूल्यों और गुणवत्ता स्कोर, हालांकि, पहले तीन कुर्सियां ​​(चित्रा 4 बी-सी) में अत्यधिक चर रहे हैं (चर्चा देखें) शामिल है, अड्डों में से 85% से 30 या अधिक से अधिक की गुणवत्ता स्कोर होगा (Q30 मूल्यों, चित्रा 4D)।

डाटा संरेखण और प्रोटोकॉल पैदावार आधार जोड़ी संकल्प डेटा के रूप में वर्णित साइटोसिन मेथिलिकरण दृढ़ संकल्प (तालिका 7)। मानव जीनोम के लिए, उच्च उत्पादन मोड में एक HiSeq 2500 की एक गली में एक ERRBS पुस्तकालय का एक 51-चक्र एकल पढ़ा अनुक्रमण रन नियमितly के 153,194,882 ± 12,918,302 कुल गुणवत्ता को छानने और अनुकूलक पैदावार trimming के बाद 152,231,183 ± 13,189,678 विश्लेषण पाइपलाइन में निवेश के लिए लिखा है कि पढ़ता उत्पन्न करता है। एक ERRBS पुस्तकालय के लिए औसत मानचित्रण दक्षता 10x CPG के प्रति एक न्यूनतम कवरेज और 84.94 ± 16.29 (एन = 100) की CPG प्रति एक औसत कवरेज के साथ आम तौर पर 62.95% 3,183,594 ± 713,547 CpGs के प्रतिनिधित्व के साथ% 5.92 ± है।

ERRBS प्रोटोकॉल (: मल्टिप्लेक्स अनुक्रमण के लिए प्रोटोकॉल अनुकूलन पूरक फ़ाइल 1 देखें) बहुसंकेतन के लिए उत्तरदायी है। 11 के लिए चार पुस्तकालयों एन =;। प्रतिनिधि अनुक्रमण से डाटा मल्टिप्लेक्स अनुक्रमण रन (51-चक्र एकल पढ़ा अनुक्रमण रन से चित्रा 5 डाटा में संक्षेप है चलाता है, एन = लेन प्रति दो पुस्तकालयों के लिए 128; एन = लेन प्रति 11 तीन के लिए पुस्तकालयों एन = 100) के साथ-साथ simulat के लिए एक एकल लेन downsampling; (51-चक्र एकल पढ़ा अनुक्रमण रन एक ERRBS पुस्तकालय का एक पूरा लेन अनुक्रमण की तुलना में थे) लेन प्रतिई 50%, 33% और का 25% लेन प्रति पढ़ता (2, 3, और लेन प्रति 4 नमूना बहुसंकेतन क्रमश; एन = 3)। का नमूना प्रति पढ़ता संख्या बहुसंकेतन कारक के साथ कम हो जाती है के रूप में, 10x की एक न्यूनतम कवरेज और CPG प्रति कवरेज पर कवर CpGs की संख्या के रूप में अच्छी तरह से (चित्रा 5 और टेबल 8) कम हो जाती है। उम्मीद की गैर CPG साइटों का मतलब रूपांतरण दर में 0.04% (एन = 400) ± 99.85% है। 99% से कम रूपांतरण दर झूठी मिथाइलेशन के स्तर की उच्च दर में परिणाम कर सकते हैं कि इष्टतम bisulfite रूपांतरण से भी कम समय का संकेत हो सकता।

एक प्रतिनिधि मानव जीनोमिक डीएनए से तैयार एक ERRBS पुस्तकालय से डाटा methylKit पैकेज 26 (कमांड विवरण के लिए पूरक कोड फ़ाइल 1 देखें) का उपयोग करते हुए आर 2.15.2 45 में विश्लेषण किया गया था। डेटा आमतौर पर इस्तेमाल किया जीनोम ब्राउज़रों (चित्रा 6A) में देखे जा सकते हैं। साइटोसिन मेथिलिकरण डेटा समान रूप से दोनों किस्में (चित्रा 6B) से ली गई है और पूरे पर्वतमाला हैसंभावित साइटोसिन मेथिलिकरण स्तर (चित्रा 6C) के स्पेक्ट्रम। डेटा परिणाम (चित्रा 6D) और जीनोमिक loci के एक व्यापक स्पेक्ट्रम में CpGs कवर के बीच एक प्रतिनिधि मानव डीएनए नमूना पैदावार उच्च क़बूल से तकनीकी प्रतिकृति का विश्लेषण (के रूप में चित्रा 6E और एफ और पहले 26 में वर्णित)। तकनीकी प्रतिकृतियां उच्च आर 2 मूल्यों (अधिक से अधिक 97%) निकलेगा, वहीं जैविक प्रतिकृतियां आर 0.92 से 0.96 26 से लेकर, और 0.86 (नहीं दिखाया डेटा) की तुलना में 2 मूल्यों कम आर निकलेगा विभिन्न मानव कोशिका प्रकार की तुलना 2 मूल्यों निकलेगा।

चित्र 1
चित्रा 1: ERRBS प्रोटोकॉल चरणों का चार्ट प्रवाह। चार्ट एक पारंपरिक काम दिन में पूरा किया जा सकता है, जो चरणों, का प्रतिनिधित्व करता है। * एक संभावित ठहराव बिंदु इंगित करता है (तुरंत पालन करें आईएनजी बंधाव को साफ और आकार का चयन, प्रोटोकॉल चरण 5) से पहले, जिस पर नमूनों प्रोटोकॉल की अवधि के साथ आगे बढ़ने से पहले -20 डिग्री सेल्सियस पर जमे हुए किया जा सकता है।

चित्र 2
चित्रा 2: आकार चयन प्रोटोकॉल। (ए) ERRBS प्रकार का सेब तैयारी प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया सेटिंग्स की स्क्रीन शॉट (प्रोटोकॉल खंड 5.1.2 देख - 5.1.6): (1) का चयन करें कैसेट प्रकार। (2) का चयन मानक इस्तेमाल किया जाएगा। (3) प्रत्येक लेन के लिए संग्रह मोड का चयन करें। (4) संग्रह बीपी पर्वतमाला दर्ज करें। (5) प्रोटोकॉल सहेजें प्रोटोकॉल खंड 5.2 में इस्तेमाल पुस्तिका जेल निकासी का (बी) के चरणों:। (1) कल्पना जेल सीढ़ी। (2) एक रेजर ब्लेड का उपयोग कर आकार चयन के लिए आकार में चिह्नित। Excised नमूने (: 150-250 बीपी और उच्च अंश: 250-400 बीपी कम अंश) (3) छवि।"> इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3: एक Bioanalyzer मशीन का उपयोग मानव डीएनए के नमूने से तैयार प्रतिनिधि ERRBS पुस्तकालयों के लिए गुणवत्ता नियंत्रण का परिणाम है। (ए) एक मानक सीढ़ी (1) दिखा जेल की तरह छवि, कम पुस्तकालय अंश (एक प्रकार का सेब प्रेप से 135-240 बीपी अंश); 2) और उच्च पुस्तकालय अंश (एक प्रकार का सेब प्रेप से 240-410 बीपी अंश); । की उम्मीद कम पुस्तकालय अंश का 3) (बी) के Bioanalyzer electropherogram (सी) की उम्मीद उच्च पुस्तकालय अंश का Bioanalyzer electropherogram डी -।। एफ) एक गरीब गुणवत्ता पुस्तकालय प्रस्तुत करने से प्रतिनिधि डेटा। मानक सीढ़ी (1) की जेल की तरह छवि (डी), कम पुस्तकालय अंश (2) और उच्च पुस्तकालय अंश (3)। 150 बीपी पर बैंड एक Arro के साथ चिह्नितडब्ल्यू एडाप्टर की अत्यधिक मात्रा में इंगित करता है। कम से Electropherogram (ई) और (तीर के साथ चिह्नित) 150 बीपी पर अतिरिक्त एडाप्टर चोटियों के साथ उच्च पुस्तकालय अंशों (एफ)। अनुक्रमण के लिए एक जमा ERRBS पुस्तकालय (G) Bioanalyzer electropherogram। लाल ट्रेस उच्च और निम्न भागों का बराबर प्रतिनिधित्व के साथ एक उच्च गुणवत्ता जमा पुस्तकालय का प्रतिनिधित्व करता है। ब्लू का पता लगाने की वजह से उच्च और निम्न अंशों की समान प्रतिनिधित्व की कमी के अनुक्रमण के लिए पर्याप्त नहीं एक जमा पुस्तकालय का प्रतिनिधित्व करता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4: एक प्रतिनिधि के लिए चार्ट अनुक्रमण उच्च उत्पादन में एक HiSeq 2500 Sequencer पर 51 चक्र एकल पढ़ा अनुक्रमण रन ERRBSमोड। (ए) क्लस्टर घनत्व (मिलीमीटर प्रति 2 = 1000 समूहों चुकता कश्मीर / मिमी, नीला)। और ERRBS पुस्तकालयों के साथ दो गलियों में फिल्टर (हरा) गुजर क्लस्टर घनत्व (बी) एक साथ एक गली में पहले 30 चक्र में दिखने वाले सामान्य तीव्रता ERRBS पुस्तकालय। के लिए पहले तीन चक्रों की तीव्रता में MspI पाचन से सीजीजी हस्ताक्षर ध्यान दें। एक ERRBS लेन में प्रत्येक चक्र के लिए 30 या अधिक की एक गुणवत्ता स्कोर (%> Q30) के साथ अड्डों में से (सी) का प्रतिशत। (डी) गुणवत्ता स्कोर वितरण एक ERRBS लेन में सभी चक्रों। ब्लू = Q30, ग्रीन से कम = से या Q30 के बराबर अधिक से अधिक। इस गली में, अड्डों में से 84.7% से 30 या अधिक की गुणवत्ता स्कोर था।

चित्रा 5
चित्रा 5: आउटपुट परिणाम अनुक्रमण। लेन अनुक्रमण आरयू प्रति मल्टिप्लेक्स और एकल नमूना से प्रयोगात्मक डेटा के बॉक्स भूखंडों एनएस (हरे बक्से के रूप में प्रदर्शित) और तीन ERRBS पुस्तकालयों का अनुक्रमण रन से नकली downsampling द्वारा प्राप्त डेटा के (नीले बॉक्स के रूप में प्रदर्शित, प्रत्येक अनुक्रमण चलाने के लिए पांच बार जांचा)। एकल पढ़ा अनुक्रमण चलाता है 51-चक्र बहुसंकेतन कारक से मेल खाती से ERRBS पुस्तकालयों की संख्या लेन प्रति अनुक्रम। 1 = पूरे लेन या 100 पढ़ता है और लेन प्रति एक ERRBS पुस्तकालय से डेटा का प्रतिनिधित्व करता है के%; गली के 2 = 50% और लेन प्रति दो ERRBS पुस्तकालयों से डेटा का प्रतिनिधित्व करता है; एक गली के 3 = 33% और लेन प्रति तीन ERRBS पुस्तकालयों से डेटा का प्रतिनिधित्व करता है; और, एक लेन की 4 = 25% और लेन प्रति चार ERRBS पुस्तकालयों से डेटा का प्रतिनिधित्व करता है। (ए) बहुसंकेतन कारक प्रति पढ़ें मायने रखता है, या विश्लेषण किया दृश्यों की संख्या,। (बी) बहुसंकेतन प्रति अनुक्रमण डेटा द्वारा कवर CPG की संख्या कारक। (सी) बहुसंकेतन कारक प्रति CPG प्रति मतलब कवरेज।"_blank> इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 6
चित्रा 6: मानव जीनोमिक डीएनए से तैयार एक ERRBS पुस्तकालय से प्रतिनिधि डेटा कैलिफोर्निया (ए) विश्वविद्यालय, सांता क्रूज़ (UCSC) जीनोम ब्राउज़र एक ERRBS अनुक्रमण लेन से प्रतिनिधि डेटा के 43 छवि।। Y अक्ष पैमाने बार 10x की एक न्यूनतम के साथ कवर प्रत्येक साइटोसिन में 0-100% मेथिलिकरण का प्रतिनिधित्व करता है। शीर्ष कस्टम ट्रैक आगे कतरा प्रतिनिधित्व करता है और कम कस्टम ट्रैक रिवर्स कतरा प्रतिनिधित्व करता है। । दिखाया chr12 है। आगे भी साथ CPG कवरेज (बी) के वितरण histograms 6,489,523-6,802,422 (hg19) इस जीनोमिक क्षेत्र के भीतर RefSeq जीन और CPG द्वीपों का समावेशी और एक प्रतिनिधि मानव CD34 + अस्थि मज्जा नमूने में किस्में रिवर्स (सी) के वितरण के हिस्टोग्रामएक प्रतिनिधि मानव CD34 + अस्थि मज्जा नमूने में दोनों किस्में साथ CPG मेथिलिकरण स्तरों की। एक मानव डीएनए नमूने के एक प्रतिनिधि तकनीकी प्रतिकृति से CPG मेथिलिकरण स्तरों (डी) सहसंबंध साजिश है। (ई) पाई चार्ट ERRBS में शामिल CpGs के अनुपात illustrating जो मानव जीनोमिक डीएनए से तैयार एक प्रतिनिधि नमूने में CPG द्वीप (हल्के हरे रंग), CPG किनारे (ग्रे) और अन्य क्षेत्रों (सफेद) को एनोटेट। (एफ) पाई चार्ट जीन प्रमोटरों को एनोटेट जो ERRBS में शामिल CpGs के अनुपात (लाल illustrating ), एक्सॉनों (हरा), इंट्रोन्स (नीला) और intergenic क्षेत्रों (बैंगनी)। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

<टीडी> 10x टी -4 डीएनए ligase प्रतिक्रिया बफर
अभिकर्मक आयतन कमेंट
10 μl
Deoxynucleotide ट्रायफ़ोस्फेट (dNTP) समाधान मिक्स 4 μl प्रत्येक न्यूक्लियोटाइड की 10 मिमी का मिश्रण
टी -4 डीएनए पोलीमरेज़ 5 μl 3000 इकाइयों / मिलीलीटर
डीएनए पोलीमरेज़ मैं बड़ी (Klenow) टुकड़ा 1 μl 5000 इकाइयों / मिलीलीटर
टी -4 polynucleotide kinase 5 μl 10,000 इकाइयों / मिलीलीटर
DNase मुक्त पानी 45 μl

तालिका 1:। समाप्ति की मरम्मत प्रतिक्रिया अभिकर्मकों अभिकर्मक नाम और मात्रा अंत मरम्मत प्रतिक्रिया (प्रोटोकॉल कदम 2.1) में इस्तेमाल किया।

अभिकर्मक आयतन कमेंट
10x प्रतिक्रिया बफर 5 μl उदाहरण के लिए, NEBuffer 2
1 मिमी 2'- deoxyadenosine 5'-ट्रायफ़ोस्फेट (dATP) 10 μl
Klenow टुकड़ा (3 '→ 5' exo-) 3 μl 5000 इकाइयों / मिलीलीटर

तालिका 2:। ए-पीछा प्रतिक्रिया अभिकर्मकों अभिकर्मक नाम और मात्रा में एक-पीछा प्रतिक्रिया (प्रोटोकॉल कदम 3.1) में इस्तेमाल किया।

अभिकर्मक आयतन कमेंट
DNase मुक्त पानी में 15 माइक्रोन annealed एडेप्टर 3 μl पीई अनुकूलक 1.0 और पीई अनुकूलक 2.0; दृश्यों और संदर्भ के लिए टेबल 4 देखें
10x टी -4 डीएनए ligase प्रतिक्रिया बफर 581, एल
टी -4 डीएनए ligase 1 μl 2000000 इकाइयों / मिलीलीटर
DNase मुक्त पानी 31 μl

तालिका 3: एडाप्टर बंधाव प्रतिक्रिया अभिकर्मकों अभिकर्मक नाम और एडाप्टर बंधाव प्रतिक्रिया (प्रोटोकॉल कदम 4.2) में इस्तेमाल मात्रा।।

तालिका 4
टेबल 4:। बंधाव प्रतिक्रिया (प्रोटोकॉल चरण 4) और पीसीआर प्रवर्धन कदम (प्रोटोकॉल चरण 7) में ERRBS प्रोटोकॉल भर में इस्तेमाल oligos की ERRBS प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया oligos सूची।

अभिकर्मक आयतन कमेंट
10x FastStart उच्च फिडेलिटी प्रतिक्रिया बफर वाई18 मिमी मैग्नीशियम क्लोराइड वें 20 μl
10 मिमी dNTP समाधान मिक्स 5 μl
25 माइक्रोन पीसीआर पीई प्राइमर 1.0 4 μl तालिका 4 देखें
25 माइक्रोन पीसीआर पीई प्राइमर 2.0 4 μl तालिका 4 देखें
FastStart उच्च फिडेलिटी एनजाइम 2 μl 5 इकाइयों / μl FastStart Taq डीएनए पोलीमरेज़
DNase मुक्त पानी 125 μl

तालिका 5: पीसीआर प्रतिक्रिया अभिकर्मकों अभिकर्मक नाम और पीसीआर प्रवर्धन प्रतिक्रिया (प्रोटोकॉल कदम 7.1) में इस्तेमाल मात्रा।।

प्रोटोकॉल कदम अभिकर्मक / प्रोटोकॉल विस्तार इनपुट डीएनए राशि
5-10 एनजी 25 एनजी 50 एनजी
1 MspI एंजाइम 1 μl 2 μl 2 μl
MspI डाइजेस्ट प्रतिक्रिया मात्रा 50 100 100
4 बंधाव प्रतिक्रिया में एडेप्टर 1 μl 2 μl 3 μl
बंधाव प्रतिक्रिया मात्रा 20 μl 25 μl 50 μl
5 आकार चयन प्रोटोकॉल मैनुअल जेल ही एक प्रकार का सेब तैयारी या मैनुअल जेल एक प्रकार का सेब तैयारी या मैनुअल जेल
7 पीसीआर प्राइमर एकाग्रता 25 माइक्रोन 25 माइक्रोन 14 चक्र के लिए 10 माइक्रोन; 18 चक्र के लिए 25 माइक्रोन पीसीआर चक्रों की संख्या 18 18 14-18

टेबल 6:। 5-50 एनजी से लेकर इनपुट सामग्री मात्रा के लिए प्रोटोकॉल कदम संशोधनों प्रोटोकॉल भर में कई चरणों शुरू सामग्री के विभिन्न मात्रा से उच्च गुणवत्ता वाले पुस्तकालयों उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया अभिकर्मक मात्रा के संशोधन की आवश्यकता है। कुंजी अभिकर्मक मात्रा में परिवर्तन यहाँ शामिल किए गए हैं। तदनुसार प्रतिक्रियाओं में बफर और पानी के संस्करणों को समायोजित करें।

Chr आधार किनारा कवरेज freqC freqT
chr1 10,564 आर 366 85.52 14.48
chr1 10,571 एफ 423 91.25 8.75
chr1 10,542 एफ 432 91.2 8.8
chr1 10,563 एफ 429 94.64 5.36
chr1 10,572 आर 366 96.99 3.01
chr1 10590 आर 370 88.11 11.89
chr1 10,526 आर 350 92 8
chr1 10,543 आर 368 92.93 7.07
chr1 10,525 एफ 433 91.92 8.08
chr1 10,497 एफ 435 88.74 11.26
<पी वर्ग = "jove_content"> टेबल 7: प्रतिनिधि ERRBS डेटा। डेटा संरेखण और साइटोसिन मेथिलिकरण दृढ़ संकल्प के बाद आधार जोड़ी डेटा प्राप्त की है प्रत्येक CPG कवर के लिए, के रूप में वर्णित संरेखण प्रोटोकॉल जीनोमिक समन्वय (कॉलम: CHR = गुणसूत्र, बेस और किनारा) का निर्धारण करेगा।, विशिष्ट ठिकाना के कवरेज की दर (कवरेज ), और प्रतिशत (freqC और freqT के रूप में पता लगाने साइटोसिन बनाम thymidine की दर क्रमशः)।

लेन प्रति ERRBS पुस्तकालयों की संख्या विशिष्ट गठबंधन पढ़ता की संख्या मतलब CpGs की संख्या कवर मीन CPG प्रति कवरेज मीन
1 152,231,184 ± 13,189,678 3,183,594 ± 713,547 85 ± 16
2 77,680,837 ± 7,657,058 2,674,823153,494 ± 49 ± 9
3 49,938,156 ± 2,436,865 2,552,186 ± - 76,624 39 ± 2
4 34,457,208 ± 4,441,686 1,814,461 ± 144,339 28 ± 4

टेबल 8:। एकल अनुक्रमण से प्राप्त CPG साइट प्रति मतलब है और विशिष्ट गठबंधन का मानक विचलन, CpGs की संख्या कवर पढ़ता है और कवरेज: एकल और मल्टिप्लेक्स ERRBS पुस्तकालयों अनुक्रमण से प्रतिनिधि मापदंडों दिखाया गया है 51-चक्र एकल पढ़ा अनुक्रमण रन से लेन प्रति डेटा है लेन प्रति ERRBS पुस्तकालयों (एन = 100), लेन प्रति दो ERRBS पुस्तकालयों (एन = 128), लेन (एन = 11) के अनुसार तीन ERRBS पुस्तकालयों, और लेन (एन = 11) के अनुसार चार ERRBS पुस्तकालयों।

Discussion

जैविक रूप से प्रासंगिक जीनोमिक क्षेत्रों में साइटोसिन मिथाइलेशन के प्रोटोकॉल प्रस्तुत पैदावार आधार जोड़ी संकल्प डेटा। सामग्री शुरू करने के 50 एनजी के लिए अनुकूलित है के रूप में लिखा प्रोटोकॉल, तथापि, यह इनपुट सामग्री की एक सीमा (5 एनजी या अधिक) 26 संभाल करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। 6 तालिका के रूप में देखा यह प्रोटोकॉल कदम से कुछ के समायोजन की आवश्यकता होगी। ERRBS पुस्तकालयों भी अनुक्रमण द्वारा पूरा किया जा सकता बनती अंत अनुक्रमण और आगे जीनोमिक कवरेज के लिए उत्तरदायी हैं अब 51 चक्र की तुलना में पढ़ता है। नमूना प्रति एक कम लागत प्रोटोकॉल की पेशकश करेगा मल्टिप्लेक्स अनुक्रमण, हालांकि, इस डेटा (चित्रा 5 और टेबल 8) में प्रतिनिधित्व CPG साइट प्रति कम कवरेज में परिणाम होगा, और प्रति उच्च कवरेज की आवश्यकता होती है जो विश्लेषण प्रदर्शन करने के लिए कवरेज के लिए पर्याप्त गहराई नहीं निकलेगा (Landan एट अल। 33 द्वारा वर्णित के रूप में जैसे) CPG साइट। अंत में, इस प्रोटोकॉल (या किसी भी bisulfite आधारित protocoएल) मिथाइल-साइटोसिन और hydroxymethyl-साइटोसिन 46,47 के बीच भेद नहीं कर सकते। हालांकि, अन्य प्रोटोकॉल के साथ एकीकृत किया जा सकता उत्पन्न डेटा विभिन्न संशोधनों को चित्रित करने के लिए 48,49 परिणाम है, और अन्य साइटोसिन संशोधनों हाल ही में वे ब्याज की होनी चाहिए, 50 की सूचना दी।

चित्रा 3 जी (लाल ट्रेस) दोनों पुस्तकालय अंशों से बराबर दाढ़ योगदान का प्रतिनिधित्व के रूप में दिखाया चित्रा 3 ए-सी में दिखाया गया है, और एक बार अनुक्रमण के लिए जमा एक का पता लगाने की पैदावार के रूप में उच्च गुणवत्ता के पुस्तकालयों में दिखाई देगा। पुस्तकालय तैयारी विफलता प्रक्रिया के दौरान किसी भी कदम से परिणाम कर सकते हैं। अपमानित डीएनए संसाधित किया जाता है तो यह इस प्रोटोकॉल में वर्णित अनुक्रमण मापदंडों का उपयोग कम CPG कवरेज में इसलिए MspI टुकड़ों में समृद्ध और नहीं कर रहे हैं कि पुस्तकालयों में परिणाम होगा। एक एंजाइम गैर कार्यात्मक या अनजाने प्रतिक्रियाओं में से एक से बाहर रखा गया है, तो प्रोटोकॉल की उम्मीद पुस्तकालय नहीं निकलेगा। बंधाव इसकी वजह हैंction अक्षम है, एडेप्टर उम्मीद की तुलना में एक उच्च एकाग्रता में कर रहे हैं, और / या इस्तेमाल किया प्राइमरों एकाग्रता अंतिम प्रवर्धन कदम के लिए एक सीमित अभिकर्मक है, पुस्तकालय विफलता हो सकता है। कारण पुस्तकालय और अतिरिक्त एडेप्टर दोनों के अंधाधुंध क्लस्टरिंग को भी अनुक्रमण के साथ हस्तक्षेप करेगा पुस्तकालय में, (चित्रा 3 डी एफ Bioanalyzer परिणामों में ~ 150 बीपी पर एक चोटियों के रूप में देखा) अतिरिक्त एडेप्टर। इस तरह के एक पुस्तकालय जाहिरा तौर पर सामान्य रूप से अनुक्रम सकता है, के एक महत्वपूर्ण हिस्से महज एडाप्टर दृश्यों होगा पढ़ता है। अतिरिक्त एडेप्टर एक पुस्तकालय में मनाया जाता है, यह सामग्री मात्रा अनुपात एडाप्टर के लिए इष्टतम इनपुट सामग्री का उपयोग उपलब्ध है अगर पुस्तकालय तैयारी दोहराने के लिए सबसे अच्छा है। अंत में, पुस्तकालयों के कुशल पीसीआर प्रवर्धन सुनिश्चित करने के लिए कम और उच्च पुस्तकालय अंशों bisulfite रूपांतरण और पीसीआर संवर्धन कदम भर में अलग नमूने के रूप में रखा जाता है। ऐसा करने में विफलता पी दौरान प्रवर्धन का अंतर दक्षता पैदावारसीआर (चित्रा 3 जी नीले रंग का पता लगाने के रूप में देखा) उच्च और निम्न अंशों की प्रतिक्रिया और अनुक्रमण के दौरान प्रत्येक पुस्तकालय अंश में कवर संबंधित जीनोमिक loci के असमान प्रतिनिधित्व के लिए संभावित। उपयोगकर्ता पुस्तकालयों उत्पन्न किया जा रहा बढ़ाना करने की जरूरत है इष्टतम पीसीआर चक्र के आगे अनुमापन के लिए bisulfite रूपांतरण के बाद तुरंत एक मात्रात्मक पीसीआर कदम को शामिल करने का विकल्प चुन सकते हैं।

ERRBS पुस्तकालय तैयारी प्रोटोकॉल विशिष्ट अभिकर्मकों सिफारिश कर रहे हैं, जिसमें कई महत्वपूर्ण कदम है। अंत मरम्मत कदम पर, एक चार न्यूक्लियोटाइड dNTP मिश्रण का उपयोग ऐसे MspI एंजाइमी स्टार गतिविधि और मूल डीएनए नमूने में मौजूद sheared डीएनए टुकड़े से उत्पन्न उन के रूप में तटरक्षक की अधिकता, युक्त नहीं किसी भी उत्पाद के अंत की मरम्मत के लिए अनुमति देता है। इस परिणाम में सुधार CPG प्रतिनिधित्व में यह परिणाम है। बंधाव कदम पर सुनिश्चित करने के लिए एक उच्च एकाग्रता ligase (2000000 इकाइयों / एमएल) और methylated एडाप्टर का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है कि बंधाव reactiपर कुशल है और bisulfite रूपांतरण सटीक डाटा संरेखण के लिए आवश्यक एडाप्टर दृश्यों को प्रभावित नहीं करता है। पीसीआर कदम पर, bisulfite इलाज जीसी अमीर डीएनए टुकड़े amplifying में सक्षम एक पोलीमर्स का उपयोग कर उच्च विशिष्टता के लिए आवश्यक है। अंत में, अतिरिक्त एडेप्टर और प्राइमरों के उन्मूलन सुनिश्चित करने के लिए, (उदाहरण के लिए: Agencourt AMPure एक्सपी) SPRI मनका शुद्धि बंधाव और पीसीआर उत्पाद isolations के लिए स्तंभ आधारित assays के बजाय सिफारिश की है।

उच्च गुणवत्ता वाले डेटा उत्पन्न करने के लिए आदेश में, यह बहुत ही कुशल bisulfite रूपांतरण सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है। प्रस्तुत नियंत्रण उपयोगकर्ता अनुक्रमण करने से पहले रूपांतरण दक्षता का निर्धारण करने की क्षमता प्रदान करता है। एक विकल्प के रूप में, इस तरह के लैम्ब्डा डीएनए के रूप में एक गैर मानव डीएनए एक आंतरिक नियंत्रण (कील में) के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। कारण प्रजातियों में अंतर करने के लिए, एक नियंत्रण के इस प्रकार के सीधे नीचे की ओर अनुक्रमण में शामिल किया जा सकता है (उदाहरण के लिए यू द्वारा इस्तेमाल किया, एट अल। 34)। हालांकि, कील-में मैं अगरउपयोग किया है, यह विशिष्ट प्रवर्धित और स्वतंत्र रूप से पुस्तकालय अनुक्रमण के लिए पहले अनुक्रम जब तक पुस्तकालय अनुक्रमण करने से पहले रूपांतरण दक्षता का निर्धारण करने के लिए इस्तेमाल नहीं किया जा सकता। निर्धारित रूपांतरण दर गैर CPG स्थलों पर मेथिलिकरण स्थिति पर आधारित हैं। यह (उदाहरण के लिए भ्रूण स्टेम कोशिकाओं) गैर CPG संदर्भ और समानांतर नमूने या इस उद्देश्य के लिए उपयोग किया जा सकता रूपांतरण दक्षता के लिए आकलन के अन्य साधनों में उच्च साइटोसिन मिथाइलेशन के संदर्भ में इस्तेमाल के लिए उपयुक्त नहीं हो सकता।

ERRBS पुस्तकालयों का अनुक्रमण के लिए अद्वितीय हैं कि पता करने के लिए कुछ निरंतर कर रहे हैं। अनुक्रम पुस्तकालय अंशों की पहली तीन ठिकानों की वजह MspI मान्यता कटौती साइट के लिए लगभग समान रूप से गैर यादृच्छिक हैं (सी ^ सीजीजी, चित्रा 4 बी, सी देखें)। कारण कम गुणवत्ता के लिए महत्वपूर्ण डेटा हानि के लिए क्षमता में यह परिणाम अनुक्रमण के दौरान स्पष्ट उच्च क्लस्टर घनत्व के बावजूद गरीब क्लस्टर स्थानीयकरण से उत्पन्न पढ़ता है। इस बाधा को दूर करने के लिए,एक समर्पित नियंत्रण लेन के रूप में एक स्वतंत्र लेन (PhiX नियंत्रण या अन्य पुस्तकालय प्रकार) में एक उच्च जटिलता पुस्तकालय शामिल हैं। उच्च जटिलता पुस्तकालयों अनुक्रम पहले चार अड्डों में ए, सी, टी और जी का एक संतुलित प्रतिनिधित्व युक्त समाप्त होता है। उपयुक्त नियंत्रण गलियों ऐसे आरएनए-सेक, चिप-सेक, पूरे जीनोम अनुक्रमण, या अनुक्रमण मशीन निर्माता (जैसे PhiX नियंत्रण V3) द्वारा की पेशकश की एक नियंत्रण के रूप में पुस्तकालयों में शामिल हैं। संबंधित अनुक्रमण चलाने के लिए एक नियंत्रण लेन के रूप में नामित करते हैं, तो यह क्लस्टर पदों का पता लगाने के लिए अनुक्रमण के पहले चार ठिकानों के दौरान उपयोग किया जाता है जो मैट्रिक्स पीढ़ी के लिए आधार के रूप में सेवा कर सकते हैं। उच्च गुणवत्ता द्वारा CPG साइट प्रति मतलब कवरेज बढ़ा देंगे पर कब्जा कर लिया पढ़ता 5.2 (एन = 4)। वैकल्पिक रूप से, इस तकनीकी कठिनाई भी पहले 23 में वर्णित के रूप में एक अंधेरे अनुक्रमण दृष्टिकोण का उपयोग कर दूर किया जा सकता है। अन्य अनुक्रमण मापदंड निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार मानक संचालन प्रक्रियाओं का पालन करें। CPG ग प्रति अंत में, कवरेजडेटा विश्लेषण के लिए होसेन ब्याज की जैविक सवालों से उपयोगकर्ता द्वारा और भाग में निर्देशित किया जाएगा। 10x कवरेज दहलीज एक उच्च कवरेज विश्लेषण दृष्टिकोण, हालांकि इस सीमा है कि ब्याज की होनी चाहिए उतारा जा सकता है देता है।

ERRBS डेटा विश्लेषण की एक पूरी चर्चा हालांकि, विभिन्न methylated cytosines और क्षेत्रों खुला स्रोत उपकरण 31,51-53 का उपयोग करके निर्धारित किया जा सकता है, इस लेख के दायरे से परे है। अतिरिक्त विश्लेषण विचार और दृष्टिकोण 54,55 अच्छी तरह से वर्णित किया गया है, और पाठक की योजना बनाई विश्लेषण करने के लिए सबसे उपयुक्त उपकरणों के लिए साहित्य खोज करने के लिए प्रोत्साहित किया जाता है।

अन्य प्रकाशित तरीकों की तुलना में, ERRBS reproducibility के वर्णित पैदावार उच्च दर के रूप में प्रदर्शन किया है, जो जब एक चार दिवसीय प्रोटोकॉल प्रदान करता है। यह MassARRAY EpiTYPER 26 मानक सोने की तुलना में मान्य किया गया है, लागत प्रभावी उच्च कवरेज डेटा के लिए है, और विभिन्न इनपुट सामग्री के लिए अनुकूलनीय हैऔर अनुक्रमण दृष्टिकोण (कम आवृत्ति के नैदानिक ​​नमूना प्रसंस्करण और अन्य प्रकार की कोशिकाओं के लिए अनुकूल) के बराबर है। यह जीनोम चौड़ा बाध्यकारी प्रतिलेखन कारक, क्रोमेटिन remodeling, epigenetic के निशान और हित के अन्य साइटोसिन संशोधनों की रूपरेखा अन्य तकनीकों के साथ विश्लेषण करती जैविक रूप से प्रासंगिक loci में आधार जोड़ी संकल्प प्रदान करता है और एकीकृत में इस्तेमाल किया जा सकता है। इस तरह के अध्ययन में ERRBS डेटा का उपयोग एक व्यापक आणविक दृष्टिकोण के लिए योगदान और आयामी जैविक मॉडल और मानव रोग के अध्ययन के विश्लेषण में उच्च के लिए अनुमति दे सकते हैं।

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए ब्याज की कोई संघर्ष नहीं है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MspI New England Biolabs R0106M 100,000 units/ml
NEBuffer 2 New England Biolabs B7002S Reaction buffer for MspI enzyme; protocol step 1.2
Phenol solution Sigma-Aldrich P4557 Equilibrated with 10 mM Tris HCl, pH 8.0; see safety and handling instructions at http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p4557
Chloroform Sigma-Aldrich C2432 See safety and handling instructions at http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/c2432
Glycogen Sigma-Aldrich G1767 19-22 mg/ml
NaOAc Sigma-Aldrich S7899 3 M, pH 5.2
Ethanol Sigma-Aldrich E7023 200 proof, for molecular biology
Buffer EB Qiagen 19086 10 mM Tris-Cl, pH 8.5
tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris) Sigma-Aldrich T1503 prepare a 1 M, pH 8.5 solution
Tris- Ethylenediaminetetraacetic acid (TE) Sigma-Aldrich T9285 Dilute to 1x buffer solution per manufacturer's recommendations
T4 DNA Ligase Reaction Buffer New England Biolabs B0202S 10x concentration
Deoxynucleotide triphosphate (dNTP) Solution Mix New England Biolabs N0447L 10 mM each nucleotide
T4 DNA Polymerase New England Biolabs M0203L 3,000 units/ml
DNA Polymerase I, Large (Klenow) Fragment New England Biolabs M0210L 5,000 units/ml
T4 Polynucleotide Kinase New England Biolabs M0201L 10,000 units/ml
QIAquick PCR Purification Kit Qiagen 28104 Used for DNA product purification in protocol step 2.3
2'-deoxyadenosine 5'-triphosphate (dATP) Promega U1201 100 mM
Klenow Fragment (3'→5' exo-) New England Biolabs M0212L 5,000 units/ml
MinElute PCR Purification Kit Qiagen 28004 Used for DNA product purification in protocol step 3.3
T4 DNA Ligase New England Biolabs M0202M 2,000,000 units/ml
Methylation Adapter Oligo Kit Illumina ME-100-0010
Agencourt AMPure XP Beckman Coulter A63881 Used in protocol sections that implement magnetic bead purification steps (steps 4.3 and 8.2). Equilibrate to room temperature before use.
Pippin Prep Gel Cassettes, 2% Agarose, dye-free Sage Science CDF2010 with internal standards
Certified Low Range Ultra Agarose Bio-Rad 161-3106
Tris-Borate-EDTA (TBE) buffer Sigma-Aldrich T4415
Ethidium bromide solution Sigma-Aldrich E1510 10 mg/ml
50 bp DNA Ladder NEB N3236S
100 bp DNA Ladder NEB N3231S
Gel Loading Dye, Orange (6x) NEB B7022S
Scalpel Blade No. 11 Fisher Scientific 3120030
QIAquick Gel Extraction Kit Qiagen 28704
EZ DNA Methylation Kit Zymo Research D5001 Used in protocol step 6.2
EZ DNA Methylation-Lightning Kit Zymo Research D5030 Alternative for step 6.2
Universal Methylated Human DNA Standard Zymo Research D5011 Used as bisulfite conversion control
FastStart High Fidelity PCR System Roche 03553426001
Qubit dsDNA High Sensitivity Assay Kit Life Technologies Q32854 A fluorescence-based DNA quantitation assay; used in protocol steps 1.1, 9.1 and 10.1
DynaMag-2 Magnet Life Technologies 12321D
High Sensitivity DNA Kit Agilent Technologies 5067-4626
2100 Bioanalyzer Agilent Technologies
PhiX Control v3 Illumina FC-110-3001
HiSeq 2500 Illumina
Pippin Prep Sage Science
Qubit 2.0 Fluorometer Life Technologies Q32872
TruSeq SR Cluster Kit v3-cBot-HS Illumina GD-401-3001
TruSeq SBS Kit v3-HS Illumina FC-401-3002
TruSeq RNA Sample prep Illumina RS-122-2001 Barcoded adapters used for multiplexing libraries; See Supplemental file for multiplexing protocol.
Microcentrifuge
Vortex Mixer
Dry Block Heater
Thermal Cycler
Water Bath
Gel electrophoresis system
Electrophoresis power supply
Gel doc
UV or blue light transilluminator

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References

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जेनेटिक्स अंक 96 epigenetics bisulfite अनुक्रमण डीएनए मेथिलिकरण जीनोमिक डीएनए 5 मिथाइलसिटोसाइन उच्च throughput
आधार जोड़ी संकल्प पर डीएनए मेथिलिकरण के आकलन के लिए प्रतिनिधित्व Bisulfite अनुक्रमण कम बढ़ाया
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Garrett-Bakelman, F. E., Sheridan, C. K., Kacmarczyk, T. J., Ishii, J., Betel, D., Alonso, A., Mason, C. E., Figueroa, M. E., Melnick, A. M. Enhanced Reduced Representation Bisulfite Sequencing for Assessment of DNA Methylation at Base Pair Resolution. J. Vis. Exp. (96), e52246, doi:10.3791/52246 (2015).

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