Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Biology

Förstärkt Minskad Representation bisulfit sekvense för Bedömning av DNA-metylering vid baspar Upplösning

doi: 10.3791/52246 Published: February 24, 2015
* These authors contributed equally

Abstract

Metylering mönster DNA-kartläggning är starkt studeras i normala och sjuka vävnader. En mängd metoder har etablerats för att förhöra cytosin metyleringsmönster i celler. Minskad representation av hela genomet bisulfite sekvense utvecklades för att upptäcka kvantitativa baspar upplösning cytosin metyleringsmönster vid GC-rika iska loci. Detta åstadkommes genom att kombinera användningen av ett restriktionsenzym, följt av bisulfit-omvandling. Enhanced Reducerad Representation bisulfit Sequencing (ERRBS) ökar biologiskt relevant genomisk lokus täckt och har använts för att profilera cytosin metylering i DNA från människa, mus och andra organismer. ERRBS inleder med restriktionsenzymspjälkning av DNA för att generera lågmolekylära fragment för användning i biblioteks preparatet. Dessa fragment utsätts för standardbibliotek konstruktion för nästa generations sekvensering. Bisulfite konvertering av ometylerade cytosiner före den slutliga amplificatipå steg möjliggör kvantitativ bas lösa cytosin metylering nivåer i täckt iska loci. Protokollet kan slutföras inom fyra dagar. Trots låg komplexitet i de tre första baserna sekvense, ERRBS biblioteken ger högkvalitativa data när du använder en utsedd sekvensekontroll körfält. Kartläggning och bioinformatik analys utförs därefter och ger data som enkelt kan integreras med en mängd olika genomet hela plattformar. ERRBS kan använda små mängd insatsmaterial som gör det möjligt att bearbeta kliniska prover och tillämpas i en rad olika forskningsansökningar. Videon produceras visar kritiska stegen i ERRBS protokollet.

Introduction

DNA-metylering vid cytosin (5-metylcytosin) är en epigenetisk märke kritisk i däggdjursceller för en rad olika biologiska processer, inklusive men inte begränsat till prägling, X-kromosom inaktive, utveckling och reglering av genuttryck 1-8. Studien av DNA metyleringsmönster i maligna och andra störningar har fastställt sjukdomsspecifika mönster och bidrog till förståelsen av sjukdomen patogenes och potentiella biomarkörer upptäckter 9-17. Det finns många protokoll som förhöra epigenomet för DNA-metylering status. Dessa kan delas in i affinitetsbaserad, restriktionsenzymbaserad, och bisulfit omvandlingsbaserade analyser som utnyttjar microarray eller sekvenseplattformar nedströms. Vidare finns det några protokoll som överbryggar dessa allmänna kategorier inklusive men inte begränsat till, Kombinerad bisulfit restriktionsanalys 18 och Reducerad Representation bisulfit Sequencing (RRBS 19). RRBS ursprungligen beskrivits av Meissner et al. 19,20. Protokollet introducerade ett steg att berika GC-rika genomregioner följt av bisulfit sekvensering, vilket resulterade i kvantitativ basparsupplösning uppgifter som är kostnadseffektiv 21,22. GC-rika regioner är målet för den Mspl (C ^ CGG) restriktionsenzym, och cytosin metylering är löst genom bisulfit omvandling av cytosiner (deaminering av omodifierade cytosiner till uracil), följt av polymerase chain reaction (PCR). RRBS omfattade huvuddelen av genpromotorer och CpG-öar i en bråkdel av den sekvense krävs för en hela genomet; dock RRBS hade begränsad täckning av CpG stränder och andra intergena regioner från biologisk relevans. Flera grupper har publicerat uppdaterade RRBS protokoll sedan den ursprungliga rapporten som förbättrar den metod och resulte täckning av dessa genomiska regioner 23-25. Enhanced Minskad Representation bisulfit SEQUkonferenser (ERRBS) omfattar biblioteksberednings ändringar och en suppleant uppgifter inriktningsinflygnings 26 jämfört med RRBS. ERRBS resulterade i ett ökat antal CpG representerade i de data som genereras och ökad täckning av alla iska regioner förhörts 26. Denna metod har använts för att lösa DNA metyleringsmönster i mänsklig patient och andra djurprover 26-30.

Den ERRBS protokoll som beskrivs erbjudanden detaljer om alla steg som behövs för färdigställande och data genererades med hjälp av representativa mänskligt DNA (prover erhölls från tidigare rapporterade, avidentifierade patientprover 31, och en CD34 + benmärgsprov från en normal människa donator). Protokollet innehåller en automatiserad storlek process val, vilket minskar handläggningstiden per prov och möjliggör ökad noggrannhet i biblioteksurvalsstorleken. Protokollet kombinerar en serie av etablerade molekylärbiologiska tekniker. Högmolekylärt DNA spjälkas wed en metylering okänslig restriktionsenzym (Mspl) följt av slut reparation, A-tailing, och ligering av metylerade adaptrar. Storleks val av GC-rika fragment följs av bisulfit konvertering och PCR-amplifiering före sekvensering. Bisulfite omvandling har varit tidigare beskrivits 32 och detaljerad genomgång av dataanalys och tillämpningar är utanför ramen för denna uppsats, men rekommendationer och referenser ingår för läsarnas användning. Protokollet kan utföras över fyra dagar och är mottaglig för liten ingång (50 ng eller mindre) materialmängder. Protokollet som beskrivs ger data med hög täckning per CpG plats räcker inte bara för differential metylering site och regionbestäm men också för epigenetiska polymorfism upptäckt som beskrivs av Landan, et al. 33.

Protocol

Alla procedurer exekveras är godkända av Indiana University School of Medicine Institutional Animal Care och användning kommittén och följa nationella institutet riktlinjer Hälsa.

1. kirurgisk teknik

  1. Behåll aseptisk teknik under denna procedur genom att använda sterila handskar, instrument och ett sterilt kirurgiska området enligt NIH riktlinjer 25. Sterilisera verktyg innan du påbörjar operationen genom autoklavering dem (se tabell av särskilda reagenser / Utrustning för komplett lista). Använd en glaspärla autoklav för att sterilisera verktygen under operationen.

2. Anestesi och förberedelse

  1. Bedöva musen i en anestesi låda med en blandning av 0,9 L / min syre och 2,5% isofluran med hjälp av en veterinär isofluran Vaporizer systemet. Se till att musen inte svarar på förändringar i kroppsläge innan du tar bort den ur kartongen.
  2. Applicera oftalmologiska salva till mouSE: s ögon för att skydda dem från uttorkning.
  3. Slå gasflödet från rutan till noskonen. Placera musen och hållet på sin vänstra sida på en uppvärmd dyna täckt med en kirurgisk pad och absorberande bänkpapper med sin näsa och mun inuti konen. Kontinuerligt övervaka musens andningsrytm och hastighet och justera isofluran nivåer som behövs (mellan 2,5-3% isofluran) för att upprätthålla en tillräcklig bedövning, och använd tån nypa reflex att bekräfta total sedering.

3. Kirurgisk Approach

  1. Rikta och fokusera stereoskopet med kirurgiska området. Justera noskonen och tejpa ner den så att den är placerad längs kanten av synfältet.
  2. Med musen liggande på sin vänstra sida, tejpa kanten av det högra örat till noskonen, utsätta området bakom örat där snittet kommer att göras. Se till att den bakre öronvenen färdas horisontellt över örat. Notera att en korrekt placering av tHan djur och tejpning av örat är avgörande för att snabbt hitta ansiktsnerven.
  3. Blöt pälsen på och bakom örat med 70% etanol och raka operationsområdet med hjälp av en rakkniv eller skalpell blad. Pre-blöta pälsen gör rakningen lättare i detta anatomiska läge.
  4. Rengör huden med en jodlösning, såsom Betadine kirurgisk skrubb (7,5% povidon-jod), följt av 70% etanol. Upprepa denna rengöring två gånger för att grundligt desinficera området.
  5. För att avgöra var att göra snittet, spåra bakre öronvenen från örat kaudalt till området bakre till örat förhöjning. Använda våren sax, gör en 4 mm snitt 2-3 mm posteriort om förhöjning.
  6. Dissekera igenom underhudsfett och fascia använder dissektion. Undvik direkt skärning med saxen eftersom blodkärl eller muskelvävnad kunde lätt skadas.
  7. Om blödning uppstår, tryck mot operationsområdet med en steril bomullspinneunder åtminstone 30 sek. Om väsentlig vätskeförlust uppträder, injicera musen intraperitonealt med upp till 0,5 ml steril 0,9% koksaltlösning med användning av en 25 eller 27 G-nål.
  8. Använd flera viktiga landmärken, ryggmärgstillbehörsnerven, hörselgången, och främre Den tvåbukiga käkmuskeln (beskrivs nedan), för att lokalisera den ansiktsnerven. Dissekera runt dessa landmärken tills grenarna i ansiktsnerven visualiseras. Nerven visas som en betydande fast vitt struktur när det avslöjas och ett lager av fascia följer den till de underliggande strukturerna.
    1. Hitta spinal tillbehörsnerven, som färdas från kaudala delen av skallen för att inner trapeziusmuskeln, när underhudsfett och fascia har dissekerat. Den ansiktsnerven är djup till spinaltillbehörsnerven.
    2. Hitta broskhörselgången som ser pärlvita och kan ses rostralt om ansiktsnerven.
    3. Hitta muskeln magen av främre Den tvåbukiga käkmuskeln som ligger på toppen av och caudal till ansiktsnerven.
  9. När huvudgrenar ansiktsnerven visualiseras, spåra dem dorsalt för att hitta sitt ursprung från stylomastoid foramen. Använda fin spets Dumont pincett # 5/45 för att hålla operationsområdet öppna, flytta fram våren sax tips efter nerven väg, sedan flytta tången dorsalt för att hålla den nyligen avancerade område som är öppet.
  10. Visualisera bakluckan på ansiktsnerven med zygomatic, buckalt och marginella mandibular grenar på denna punkt.
    OBS: Den tidsmässiga gren kommer att hittas närmare foramen. De marginella mandibular nervgrenar till dess övre och nedre delarna närmare käken, alltså sådana nervgrenar kommer inte att vara synlig på den här nivån.
    1. Om du utför en nervtransection, stabilisera nerven försiktigt med fin spets pincett och skär nerven med vårens sax. Undvik att applicera för mycket dragkraft till nerven med pincett för att förhindra avulsing nerven från hjärnstammen. Tryckstubbar ifrån varandra, eller klippa och ta bort en del av den distala mage att säkerställa att ingen återinkoppling kan ske.
    2. Om du utför en krosskada, använd Dumont # 5/45 pincett för att komprimera nerven i 30 sekunder med hjälp av konstant tryck för att bryta alla axoner, sedan upprepa detta krossa med en andra vinkel vinkelrät mot den första krossa platsen. Undvik att varierande mängder tryck under 30 sek krossa, annars skadan blir inkonsekvent mellan djur.

4. Stängning och återställning

  1. Flytta fettet och musklerna under de underliggande strukturerna.
  2. Ungefärlig kanterna på snittet och stänga såret med hjälp av en 7,5 mm sår klipp. Suturer eller lim är också acceptabla för sårtillslutning. Postkirurgiska analgetika kan ges vid denna tidpunkt.
  3. Ta bort tejpen från musens öra. Stäng av isofluran flödet och gör musen att andas rent syre under 30 sek till 1 min. Pless musen i en tom bur med inga sängkläder för att återhämta sig från anestesi.
  4. När musen återvinns, granska sitt beteende för bekräftande tecken på ansiktsförlamning. Morrhåren ska förlamad och vinklas bakåt mot kinden, kommer näsan att avvika, och ögat kommer inte att blinka som svar på en pust av luft.
  5. Hus djur tillsammans efter operationen, om de är kvinnor. Undvik bostäder hanmöss tillsammans eftersom de är mer aggressiva och tenderar att med våld ta bort deras cagemate s sårklämmor, vilket leder till infektion. Ge postkirurgiska analgetika vid denna tid, om det behövs.
  6. Övervaka mössen en gång dagligen i flera dagar efter operationen för att säkerställa att ingen infektion eller annan komplikation inträffar postoperativt. Ta sårklämmor 7-10 dagar efter operationen, om de inte har fallit ut på egen hand.
  7. Applicera smörjögonsalva till det drabbade ögat dagligen för att förhindra hornhinnan komplikationer, antingen tills ögat blinkreflexen är retäckt eller tills dödshjälp.

Representative Results

Figur 1 ger en översikt över ERRBS, belyser viktiga steg, som förklaras i hela det protokoll som beskrivs. ERRBS biblioteken har sammanställts med 50 ng ingång DNA.

Utvärdera kvaliteten på biblioteken förberedda. Bibliotek produktionen ger rutinmässigt fraktions storlekar av 150-250 bp och 250-400 bp (Figur 3A-C). Små skillnader i biblioteksstorleksfördel mellan proven förväntas. Observera att i både lägre och högre biblioteks fraktioner finns det mycket intensiva DNA storlekar indikerar anrikning av en viss sekvens. Mspl digereresulterar i anrikning av en familj av repetitiva DNA-sekvenser närvarande i det humana genomet vid 190 bp, 250 bp och 310 bp i biblioteken ERRBS. Dessa tre upprepningar utgör en karakteristisk tecknandet av ett ERRBS bibliotek 20 (se figur 3A-C och 3G). Representativa bibliotek sekvenserades på en nästa generations sekvensr använder single-end läser. Vid lastning vid den rekommenderade biblioteks koncentrationen på en Illumina HiSeq 2500 sequencer, är kluster tätheter av 500,000-700,000 per mm 2 förväntat. Vid denna klusterdensitet, 81,6% ± 3,14% (n = 81) av klustren passera filtret (Figur 4A). På grund av den låga komplexitet slutet av biblioteket inlägg (Mspl igenkänningsställe: C ^ CGG), intensitetsvärden och kvalitetsresultat som registrerats under sekvense är mycket varierande i de tre första baserna (Figur 4B-C), men om en oberoende kontroll körfält ingår (se diskussion), kommer 85% av baser har massor av 30 eller högre kvalitet (Q30-värden; Figur 4D).

Data anpassning och cytosin metylering bestämningen enligt beskrivningen i uppgifter protokoll avkastningen baspar upplösning (Tabell 7). För det mänskliga genomet, en 51-cykel singel-läs sekvense ett startande ERRBS bibliotek i ett körfält av en HiSeq 2500 i högeffektsläge regelbundenly genererar 153.194.882 ± 12.918.302 totalt läser att efter kvalitet filtrering och adapter trimning avkastning 152.231.183 ± 13.189.678 läser för inmatning i rörledningen analysen. Genomsnittlig kartläggning effektivitet för en ERRBS biblioteket är typiskt 62,95% ± 5,92% med representation av 3.183.594 ± 713.547 CpG med en minsta täckning per CpG av 10x och en genomsnittlig täckning per CpG av 84,94 ± 16.29 (n = 100).

Den ERRBS protokollet är mottaglig för multiplexering (se Kompletterande fil 1: Protokoll anpassning för multiplex sekvense). Data från representativa sekvensekörningar sammanfattas i figur 5 Data från multiplexade sekvense körningar (51-cykel singel-läs sekvense körning;. N = 128 för två bibliotek per körfält, n = 11 för tre bibliotek per körfält, n = 11 för fyra bibliotek per bana) var jämfört med en full körfält sekvensering av en ERRBS bibliotek (51-cykelenkel läs sekvense körningar; n = 100) samt nedsampling ett enda körfält att simulerie 50%, 33% och 25% av läsningar per körfält (2, 3, och 4 prov multiplexering per bana respektive; n = 3). Eftersom antalet läser per prov minskar med multiplexing faktorn, antalet CpG omfattas minst täckning 10x och täckningen per CpG minskar också (figur 5 och tabell 8). Mean omräkningskurser för icke-CpG platser som förväntas är 99.85% ± 0,04% (n = 400). Omräkningskurser lägre än 99% kan tyda mindre än optimal bisulfite konvertering som kan resultera i höga falska metylering nivåer.

Data från en ERRBS bibliotek framställt från en representant humant genomiskt DNA analyserades i R 2.15.2 45 använder methylKit paketet 26 (se Kompletterande kod fil 1 för kommando detaljer). Uppgifterna kan visualiseras i vanligen använda genom webbläsare (Figur 6A). Den cytosin metylering data lika härstammar från båda strängarna (Figur 6B) och varierar helaspektrum av potentiella cytosin metylering nivåer (figur 6C). Analys av tekniska replikat från en representativ DNA prov avkastning mänskliga hög överensstämmelse mellan dataresultat (Figur 6D) och täcker CpG i ett brett spektrum av genomisk lokus (Figur 6E och F och som tidigare beskrivits 26). Medan tekniska repliker kommer att ge höga R 2 värden (större än 97%), kommer den biologiska repliker ge R 2 värden som sträcker sig från 0,92 till 0,96 26, och jämföra olika humana celltyper kommer att ge R 2 värden som är lägre än 0,86 (data visas ej).

Figur 1
Figur 1: Flödesschema för ERRBS protokollsteg. Diagram representerar steg som kan genomföras i en traditionell arbetsdag. * Indikerar en potentiell pauspunkt (omedelbart efter ing ligering städa upp och innan storlek urval, protokoll steg 5) på vilka prover kan frysas vid -20 ° C innan du fortsätter med varaktighet protokollet.

Figur 2
Figur 2: Storleksselektionsprotokoll. (A) Skärmdump av inställningar som används i ERRBS Pippin Prep-protokollet (se protokoll avsnitt 5.1.2 - 5.1.6): (1) Välj kassett typ. (2) Välj standard som ska användas. (3) Välj insamlingsläge för varje bana. (4) Ange uppsamlings bp intervall. (5) Spara protokollet (B) Stadier av den manuella gelextraktion används i protokoll avsnitt 5.2:. (1) visualiseras gel stegar. (2) Marked Storlekar för storlek val med ett rakblad. (3) Bild av utskurna prover (lägre andel: 150-250 bp och högre andel: 250-400 bp)."> Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3
Figur 3: Kvalitetskontroll resultat för representativa ERRBS bibliotek framställda från humana DNA-prover med en bioanalyzer maskin. (A) Gel-liknande bild visar en vanlig stege (1), lägre biblioteks fraktion (135-240 bp fraktionen från Pippin Prep); 2) och den högre biblioteks fraktionen (240-410 bp-fraktionen från Pippin Prep); . 3) (B) Bioanalyzer electropherogram av den förväntade lägre biblioteks fraktion (C) Bioanalyzer electropherogram av den förväntade högre biblioteks fraktion D -.. F) Representativa uppgifter från en dålig kvalitet bibliotek prep. Gelliknande bild (D) för det standardstege (1), lägre bibliotek fraktion (2) och den högre biblioteks fraktionen (3). Bandet vid 150 bp markerade med en Arrow indikerar stora mängder av adapter. Elektroferogram över den nedre (E) och högre biblioteks fraktionerna (F) med överskottet adapter toppar vid 150 bp (markerade med pilar). (G) Bioanalyzer elektroferogram över en poolad ERRBS bibliotek för sekvensering. Röd kurva representerar en hög kvalitet poolade bibliotek med lika representation av högre och lägre fraktioner. Blå kurva representerar en sammanslagen biblioteket inte tillräckliga för sekvense på grund av brist på lika representation av de högre och lägre fraktioner. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 4
Figur 4: Sekvens diagram för en representativ ERRBS 51-cykel singel-läs sekvense körning på en HiSeq 2500 sequencer i hög effektläge. (A) Cluster tätheter (K / mm 2 = 1,000 kluster per millimeter i kvadrat, blå). Och kluster densiteter passerar filtret (grön) i två körfält med ERRBS bibliotek (B) Typiska intensiteter ses i de första 30 cykler i ett körfält med en ERRBS bibliotek. Notera CGG signaturen från Mspl uppslutning i intensiteterna hos de tre första cyklerna. (C) Procent av baser med en kvalitetspoäng på 30 eller högre (%> Q30) för varje cykel i en ERRBS körfält. (D) Kvalitetsfördelning för alla cykler i en ERRBS körfält. Blå = mindre än Q30, Grön = större än eller lika med Q30. I detta körfält, hade 84,7% av baser betyg för 30 eller högre kvalitet.

Figur 5
Figur 5: Sekvenseutgångsresultat. Box tomter av experimentella data från multiplex och enda prov per bana sekvense ru ns (visas som gröna rutorna) och av uppgifter som kommer från simulerad nedsampling från sekvense körningar av tre ERRBS bibliotek (visas som blå lådor, samplade fem gånger för varje sekvense körning) från 51-cykel singel-läs sekvense kör Multiplexeringen faktorn motsvarar. Antalet ERRBS bibliotek sekvens per körfält. 1 = helt körfält eller 100% av läser och representerar data från en enda ERRBS bibliotek per bana; 2 = 50% av körfält och representerar data från två ERRBS bibliotek per körfält; 3 = 33% av ett körfält och representerar data från tre ERRBS bibliotek per körfält; och representerar 4 = 25% av ett körfält och data från fyra ERRBS bibliotek per körfält. (A) De lästa räknas, eller antal sekvenser som analyseras, per multiplexering faktor. (B) Antalet CpG s omfattas av sekvense data per multiplexering faktor. (C) Medel täckning per CpG per multiplexering faktor._blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 6
Figur 6: Representativa data från en ERRBS bibliotek framställt från humant genomiskt DNA (A) University of California, Santa Cruz (UCSC) genomet browser 43 bilden av representativa uppgifter från en ERRBS sekvense körfält.. Y-axeln skala stapel representerar 0-100% metylering vid varje cytosin täckt med ett minimum av 10x. Den översta anpassade spåret representerar framåt strängen och den nedre anpassade spåret representerar den omvända strängen. Visas chr12:.. 6,489,523-6,802,422 (hg19) inklusive refseq gener och CpG-öar inom denna genomregion (B) Distribution histogram av CpG täckning längs framåt och bakåt trådar i en representativ människa CD34 + benmärgsprov (C) Distribution histogramCpG metylering nivåer längs båda strängarna i en representativ människa CD34 + benmärgsprov. (D) Korrelation tomt på CpG metylering nivåer från en representativ teknisk replika av ett mänskligt DNA-prov. (E) cirkeldiagram illustrerar proportionerna av CpG omfattas i ERRBS som kommenterade att CpG-öar (ljusgrön), CpG stränder (grå) och andra regioner (vita) i ett representativt urval framställts från humant genomiskt DNA. (F) cirkeldiagram illustrerar proportionerna av CpG omfattas i ERRBS som kommenterade att genpromotorer (röd ), exoner (grön), introner (blå) och intergeniska regioner (lila). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

<td> 10x T4 DNA-ligas Reaction Buffer
Reagens Volym Kommentera
10 | il
Deoxinukleotidtrifosfat (dNTP) Lösning Mix 4 il Blanda i 10 mM av varje nukleotid
T4-DNA-polymeras 5 pl 3000 enheter / ml
DNA-polymeras I Stort (Klenow) fragment 1 il 5000 enheter / ml
T4-polynukleotidkinas 5 pl 10.000 enheter / ml
DNas-fritt vatten 45 | il

Tabell 1:. Slut reparation reaktionsreagensen Reagensnamn och mängder som används i slutreparationsreaktion (protokollsteg 2.1).

Reagens Volym Kommentera
10x reaktionsbuffert 5 pl till exempel, NEBuffer 2
1 mM 2'-deoxiadenosin 5'-trifosfat (dATP) 10 | il
Klenowfragment (3 '→ 5 "exo) 3 il 5000 enheter / ml

Tabell 2:. A-tailing reaktions reagenser Reagens namn och mängder som används i A-tailing reaktion (protokollsteg 3.1).

Reagens Volym Kommentera
15 iM glödgade adaptrar i DNas-fritt vatten 3 il PE-adapter 1.0 och PE-adapter 2.0; se tabell 4 för sekvenser och referens
10x T4 DNA-ligas Reaction Buffer 581; l
T4 DNA-ligas 1 il 2000000 enheter / ml
DNas-fritt vatten 31 | il

Tabell 3: Adapter ligeringsreaktion reagenser Reagensnamn och storheter som används i adapter ligeringsreaktionen (protokollsteg 4.2)..

Tabell 4
Tabell 4:. Oligos används i ERRBS protokollet Förteckning över oligos används i hela ERRBS protokollet i ligeringsreaktionen (protokoll steg 4) och PCR amplifieringsstegen (protokoll steg 7).

Reagens Volym Kommentera
10x Faststart High Fidelity Reaction Buffer with 18 mM magnesiumklorid 20 | il
10 mM dNTP Solution Mix 5 pl
25 iM PCR PE primer 1.0 4 il Se tabell 4
25 iM PCR PE primer 2.0 4 il Se tabell 4
Faststart High Fidelity Enzyme 2 | il 5 enheter / | il Faststart Taq DNA-polymeras
DNas-fritt vatten 125 | il

Tabell 5: PCR-reaktionsreagens Reagensnamn och storheter som används i PCR amplifieringsreaktionen (protokollsteg 7.1)..

Protokollsteg Reagens / protokoll detalj Inmatnings DNA belopp
5-10 ng 25 ng 50 ng
1 Mspl-enzym 1 il 2 | il 2 | il
Mspl digerereaktionsvolym 50 100 100
4 Adaptrar i ligeringsreaktion 1 il 2 | il 3 il
Ligering reaktionsvolym 20 | il 25 | il 50 | il
5 Storlek selektionsprotokoll Endast Manuell gel Pippin Prep eller manuell gel Pippin Prep eller manuell gel
7 PCR-primer koncentration 25 pM 25 pM 10 uM för 14 cykler; 25 ^ M för 18 cykler Antalet PCR-cykler 18 18 14-18

Tabell 6:. Protokoll steg modifieringar för insatsmaterial mängder varierande 5-50 ng Flera steg hela protokollet kräver modifiering av reagensmängder som används för att generera bibliotek högkvalitativa från olika mängder av utgångsmaterial. Ändringar nyckelreagensmängder ingår här. Justera buffert och vattenvolymer i reaktioner därefter.

Chr Bas Strand Täckning freqC freqT
chr1 10564 R 366 85,52 14.48
chr1 10571 F 423 91,25 8,75
chr1 10542 F 432 91,2 8,8
chr1 10563 F 429 94,64 5,36
chr1 10572 R 366 96,99 3,01
chr1 10590 R 370 88,11 11,89
chr1 10526 R 350 92 8
chr1 10543 R 368 92,93 7,07
chr1 10525 F 433 91,92 8,08
chr1 10497 F 435 88,74 11,26
<p class = "jove_content"> Tabell 7: representativa ERRBS uppgifter. Efter dataanpassning och cytosin metylering beslutsamhet, baspar uppgifter erhålls för varje CpG täckt, kommer anpassningen protokollet som beskrivs bestämma iska koordinat (kolumner: chr = kromosom, Base och Strand)., Täckningsgraden av den specifika lokus (Täckning ), och graden av cytosin upptäckt kontra tymidin som procent (freqC och freqT respektive).

Antal ERRBS bibliotek per körfält Genomsnittlig antal unikt linje läser Genomsnittlig antal CpG omfattas Genomsnittlig täckning per CpG
1 152231184 ± 13189678 3183594 ± 713547 85 ± 16
2 77680837 ± 7657058 2674823± 153494 49 ± 9
3 49938156 ± 2436865 2552186 ± - 76624 39 ± 2
4 34457208 ± 4441686 1814461 ± 144339 28 ± 4

Tabell 8:. Representativa parametrar från sekvense enkel- och multiplexade ERRBS biblioteken Visas uppgifter per körfält från 51-cykelenkel läs sekvensekörningar: medelvärde och standardavvikelser för unikt linje läser, antal CpG omfattas och täckning per CpG plats erhållits från sekvense singel ERRBS bibliotek per körfält (n = 100), två ERRBS bibliotek per körfält (n = 128), tre ERRBS bibliotek per körfält (n = 11), och fyra ERRBS bibliotek per körfält (n = 11).

Discussion

Skördarna baspar upplösning uppgifter protokoll presenteras av cytosin metylering vid biologiskt relevanta iska regioner. Protokollet som skrivet är optimerad för 50 ng av utgångsmaterial, men det kan anpassas för att hantera en rad insatsmaterial (5 ng eller mer) 26. Detta kommer att kräva anpassningar av vissa av protokollsteg såsom framgår av tabell 6. Biblioteken ERRBS är mottagliga för parade slutsekvensering och ytterligare genomiska täckningen kan också åstadkommas genom sekvensavläsningar längre än 51 cykler. Multiplexed sekvense kommer att erbjuda en lägre kostnad protokoll per prov, men detta kommer att leda till minskad täckning per CpG plats representerade i data (Figur 5 och Tabell 8), och kommer inte att ge tillräckligt djup täckning för att utföra analyser som kräver hög täckning per CpG plats (t.ex. som beskrivs av et al. Landan 33). Slutligen detta protokoll (eller någon bisulfite baserad protocol) kan inte skilja mellan metyl-cytosin och hydroximetyl-cytosin 46,47. Men de data som genereras kan integreras med andra protokoll resultat 48,49 för att avgränsa de olika modifikationer, och andra cytosin modifieringar nyligen rapporterat 50, bör de vara av intresse.

Biblioteken Högkvalitativa visas som visas i figur 3A-C, och en gång samman för sekvense ger ett spår som visas i figur 3G (röd kurva) representerar lika molära bidrag från både biblioteksfraktioner. Bibliotek förberedelse misslyckande kan resultera från något steg under proceduren. Om nedbrutet DNA bearbetas det kommer att resultera i bibliotek som inte anrikas i Mspl fragment och därmed i svagt CpG täckningen med hjälp av sekvense parametrar som beskrivs i detta protokoll. Om ett enzym är icke funktionell eller oavsiktligt uteslutna från en av reaktionerna kommer protokollet att inte ge den förväntade biblioteket. Om ligering reaInsatser är ineffektivt, adaptrar är på en högre koncentration än väntat, och / eller primers koncentrationen som används är en begränsande reagens för de slutliga amplifieringsstegen, kan biblioteks fel uppstå. Överskott adaptrar (ses som en toppar vid ~ 150 bp i Bioanalyzer resultat, figur 3D-F) i biblioteket kommer också störa sekvense grund av urskillningslösa klustring av både biblioteket och överskott adaptrar. Medan ett sådant bibliotek kan sekvensera tydligen normalt, läser en betydande del av den kommer att vara enbart adaptersekvenser. Om överskott adaptrar observeras i ett bibliotek, är det bäst att upprepa biblioteket förberedelse om materialet är tillgängligt med hjälp optimal ingångsmaterial till adaptern kvantitetsförhållanden. Slutligen, för att säkerställa en effektiv PCR-amplifiering av biblioteken är de lägre och högre biblioteks fraktioner bibehållas som separata prover hela bisulfite konvertering och PCR anrikningssteg. Underlåtenhet att göra detta ger differentiell effektivitet förstärkning under PCR reaktion av högre och lägre fraktioner (som ses i figur 3G blå spår) och potentialen för ojämlik representation av respektive iska loci täckas i varje bibliotek fraktion under sekvensering. Användaren kan välja att inkludera en kvantitativ PCR steg omedelbart efter bisulfite omvandling för ytterligare titrering av optimala PCR-cykler som behövs för att förstärka biblioteken genereras.

ERRBS förberedelse biblioteksprotokoll har flera viktiga steg i vilka specifika reagens rekommenderas. I slutet-reparationssteg, användningen av en fyra-nukleotid dNTP mix möjliggör för end-reparation av några produkter som inte innehåller CG överhäng, såsom de som följer av Mspl enzymatisk stjärnan aktivitet och kluvna DNA-fragment som finns i den ursprungliga DNA-prov. Detta resulterar i förbättrade CpG representation i resultaten. Vid ligering steget är det viktigt att använda en hög koncentration ligas (2000000 enheter / ml) och metylerade adaptrar för att säkerställa att ligering Reactipå är effektiv och att den bisulfite konverteringen inte påverkar de adaptersekvenser väsentliga för exakt dataanpassning. Vid PCR-steget, med användning av ett polymeras med förmåga att amplifiera bisulfit-behandlad GC-rika DNA-fragment som är nödvändigt för hög specificitet. Slutligen, för att säkerställa eliminering av överskott av adaptrar och primrar, SPRI vulst rening (till exempel: Agencourt AMPure XP) rekommenderas hellre än kolonnbaserade analyser för ligering och PCR-produkt isoleringar.

För att generera data av hög kvalitet, är det viktigt att säkerställa en effektiv bisulfite konvertering. Kontrollen presenterade erbjuder användaren möjlighet att bestämma verkningsgraden före sekvensering. Som ett alternativ, kan en icke-human DNA, såsom lambda-DNA kan användas som en intern kontroll (spike-in). På grund av skillnaderna i art, kan denna typ av en kontroll omfattas direkt i nedströmssekvensering (t.ex. som användes av Yu, et al., 34). Om emellertid spike-i is utnyttjas, kan den inte användas för att bestämma verkningsgraden före bibliotekssekvense såvida unikt förstärks och självständigt sekvens före bibliotekssekvensering. De omräkningskurser som fastställts är baserade på metylering status vid icke-CpG platser. Detta kanske inte är lämplig för användning i samband med höga cytosin metylering i icke-CpG sammanhang (t.ex. embryonala stamceller) och parallella prover eller andra medel för att bedöma om verkningsgrad kan utnyttjas för detta ändamål.

Det finns några varningar till adress som är unika för sekvensering av ERRBS bibliotek. De tre första baserna i biblioteket fraktionerna sekvense är nästan likformigt icke-slumpmässigt på grund av den Mspl igenkännings cut ställe (C ^ CGG; se figur 4B, C). Detta resulterar i att potentialen för betydande förlust av data på grund av låg kvalitet läser följd av dålig kluster lokalisering trots till synes stora kluster täthet under sekvensering. För att övervinna detta hinder,inkludera en hög komplexitet bibliotek i en oberoende körfält (PhiX kontroll eller annan biblioteks typ) som en dedikerad kontroll körfält. Höga bibliotek komplexitet har ändar som innehåller en balanserad representation av A, C, T och G i de första fyra baserna sekvense. Lämpliga kontrollköer inkluderar bibliotek, såsom RNA-seq, Chip-punkter, hela genom sekvense, eller en kontroll som erbjuds av sekvense maskintillverkaren (t.ex. PhiX kontroll v3). När betecknas som en kontroll körfält för respektive sekvense sikt kan ligga till grund för matrisen generation som utnyttjas under de första fyra baserna av sekvense att upptäcka klusterpositioner. Ju högre kvalitet läser fångas kommer att höja den genomsnittliga täckning per CpG plats med 5,2 (n = 4). Alternativt kan denna tekniska svårigheter också övervinnas med hjälp av en mörk sekvense tillvägagångssätt som tidigare beskrivits 23. Andra sekvense kriterier följer standardrutiner per tillverkarens protokoll. Slutligen täckningen per CpG cHosen för dataanalys kommer att styras av användaren och delvis av de biologiska frågor av intresse. Tröskeln 10x täckning ger en hög täckningsgrad analys tillvägagångssätt, men denna tröskel kan sänkas bör det vara av intresse.

En fullständig diskussion av ERRBS dataanalys är utanför ramen för denna artikel, dock differentiellt metylerade cytosiner och regioner kan bestämmas med hjälp av open source-verktyg 31,51-53. Ytterligare överväganden och tillvägagångssätt analys har väl beskrivna 54,55, och läsaren uppmanas att söka litteraturen för verktyg som är lämpligast för analysen planerat.

Jämfört med andra publicerade metoder, erbjuder ERRBS en fyra-dagars protokoll som när den utförs såsom beskrivits utbyten höga hastigheter av reproducerbarhet. Det har validerats i förhållande till guldmyntfoten Massarray EpiTYPER 26, är kostnadseffektivt för data höga täcknings, och är anpassningsbar för olika insatsmaterialbelopp (gynnsamma för klinisk provhantering och andra celltyper med låg frekvens) och sekvense metoder. Det erbjuder baspar upplösning på biologiskt relevant geografisk och kan användas i integrativ analyser med andra tekniker profilering genomet hela transkriptionsfaktor bindande, Kromatinremodellering, epigenetiska märken och andra cytosin modifieringar av intresse. ERRBS uppgifter användning i sådana studier kan bidra till en övergripande molekylär strategi och möjliggöra hög dimensionell analyser i studien av biologiska modeller och mänsklig sjukdom.

Disclosures

Författarna har inga intressekonflikter att lämna ut.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MspI New England Biolabs R0106M 100,000 units/ml
NEBuffer 2 New England Biolabs B7002S Reaction buffer for MspI enzyme; protocol step 1.2
Phenol solution Sigma-Aldrich P4557 Equilibrated with 10 mM Tris HCl, pH 8.0; see safety and handling instructions at http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p4557
Chloroform Sigma-Aldrich C2432 See safety and handling instructions at http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/c2432
Glycogen Sigma-Aldrich G1767 19-22 mg/ml
NaOAc Sigma-Aldrich S7899 3 M, pH 5.2
Ethanol Sigma-Aldrich E7023 200 proof, for molecular biology
Buffer EB Qiagen 19086 10 mM Tris-Cl, pH 8.5
tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris) Sigma-Aldrich T1503 prepare a 1 M, pH 8.5 solution
Tris- Ethylenediaminetetraacetic acid (TE) Sigma-Aldrich T9285 Dilute to 1x buffer solution per manufacturer's recommendations
T4 DNA Ligase Reaction Buffer New England Biolabs B0202S 10x concentration
Deoxynucleotide triphosphate (dNTP) Solution Mix New England Biolabs N0447L 10 mM each nucleotide
T4 DNA Polymerase New England Biolabs M0203L 3,000 units/ml
DNA Polymerase I, Large (Klenow) Fragment New England Biolabs M0210L 5,000 units/ml
T4 Polynucleotide Kinase New England Biolabs M0201L 10,000 units/ml
QIAquick PCR Purification Kit Qiagen 28104 Used for DNA product purification in protocol step 2.3
2'-deoxyadenosine 5'-triphosphate (dATP) Promega U1201 100 mM
Klenow Fragment (3'→5' exo-) New England Biolabs M0212L 5,000 units/ml
MinElute PCR Purification Kit Qiagen 28004 Used for DNA product purification in protocol step 3.3
T4 DNA Ligase New England Biolabs M0202M 2,000,000 units/ml
Methylation Adapter Oligo Kit Illumina ME-100-0010
Agencourt AMPure XP Beckman Coulter A63881 Used in protocol sections that implement magnetic bead purification steps (steps 4.3 and 8.2). Equilibrate to room temperature before use.
Pippin Prep Gel Cassettes, 2% Agarose, dye-free Sage Science CDF2010 with internal standards
Certified Low Range Ultra Agarose Bio-Rad 161-3106
Tris-Borate-EDTA (TBE) buffer Sigma-Aldrich T4415
Ethidium bromide solution Sigma-Aldrich E1510 10 mg/ml
50 bp DNA Ladder NEB N3236S
100 bp DNA Ladder NEB N3231S
Gel Loading Dye, Orange (6x) NEB B7022S
Scalpel Blade No. 11 Fisher Scientific 3120030
QIAquick Gel Extraction Kit Qiagen 28704
EZ DNA Methylation Kit Zymo Research D5001 Used in protocol step 6.2
EZ DNA Methylation-Lightning Kit Zymo Research D5030 Alternative for step 6.2
Universal Methylated Human DNA Standard Zymo Research D5011 Used as bisulfite conversion control
FastStart High Fidelity PCR System Roche 03553426001
Qubit dsDNA High Sensitivity Assay Kit Life Technologies Q32854 A fluorescence-based DNA quantitation assay; used in protocol steps 1.1, 9.1 and 10.1
DynaMag-2 Magnet Life Technologies 12321D
High Sensitivity DNA Kit Agilent Technologies 5067-4626
2100 Bioanalyzer Agilent Technologies
PhiX Control v3 Illumina FC-110-3001
HiSeq 2500 Illumina
Pippin Prep Sage Science
Qubit 2.0 Fluorometer Life Technologies Q32872
TruSeq SR Cluster Kit v3-cBot-HS Illumina GD-401-3001
TruSeq SBS Kit v3-HS Illumina FC-401-3002
TruSeq RNA Sample prep Illumina RS-122-2001 Barcoded adapters used for multiplexing libraries; See Supplemental file for multiplexing protocol.
Microcentrifuge
Vortex Mixer
Dry Block Heater
Thermal Cycler
Water Bath
Gel electrophoresis system
Electrophoresis power supply
Gel doc
UV or blue light transilluminator

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jones, P. A. Functions of DNA methylation: islands, start sites, gene bodies and beyond. Nat Rev Genet. 13, (7), 484-492 (2012).
  2. Barlow, D. P. Genomic imprinting: a mammalian epigenetic discovery model. Annual Review Of Genetics. 45, 379-403 (2011).
  3. Thiagarajan, R. D., Morey, R., Laurent, L. C. The epigenome in pluripotency and differentiation. Epigenomics. 6, (1), 121-137 (2014).
  4. Reik, W. Stability and flexibility of epigenetic gene regulation in mammalian development. Nature. 447, (7143), 425-432 (2007).
  5. Hartnett, L., Egan, L. J. Inflammation, DNA methylation and colitis-associated cancer. Carcinogenesis. 33, (4), 723-731 (2012).
  6. Smith, Z. D., Meissner, A. DNA methylation: roles in mammalian development. Nat Rev Genet. 14, (3), 204-220 (2013).
  7. Li, E., Bestor, T. H., Jaenisch, R. Targeted mutation of the DNA methyltransferase gene results in embryonic lethality. Cell. 69, (6), 915-926 (1992).
  8. Okano, M., Bell, D. W., Haber, D. A., Li, E. DNA methyltransferases Dnmt3a and Dnmt3b are essential for de novo methylation and mammalian development. Cell. 99, (3), 247-257 (1999).
  9. Feinberg, A. P. Phenotypic plasticity and the epigenetics of human disease. Nature. 447, (7143), 433-440 (2007).
  10. Bock, C. Epigenetic biomarker development. Epigenomics. 1, (1), 99-110 (2009).
  11. Laird, P. W. The power and the promise of DNA methylation markers. Nat Rev Cancer. 3, (4), 253-266 (2003).
  12. How Kit, A., Nielsen, H. M., Tost, J. DNA methylation based biomarkers: practical considerations and applications. Biochimie. 94, (11), 2314-2337 (2012).
  13. Mikeska, T., Bock, C., Do, H., Dobrovic, A. DNA methylation biomarkers in cancer: progress towards clinical implementation. Expert Review Of Molecular Diagnostics. 12, (5), 473-487 (2012).
  14. Gyparaki, M. T., Basdra, E. K., Papavassiliou, A. G. DNA methylation biomarkers as diagnostic and prognostic tools in colorectal cancer. Journal of Molecular Medicine. 91, (11), 1249-1256 (2013).
  15. Figueroa, M. E., et al. DNA methylation signatures identify biologically distinct subtypes in acute myeloid leukemia. Cancer Cell. 17, (1), 13-27 (2010).
  16. Heyn, H., Mendez-Gonzalez, J., Esteller, M. Epigenetic profiling joins personalized cancer medicine. Expert review of Molecular Diagnostics. 13, (5), 473-479 (2013).
  17. Kulis, M., Esteller, M. DNA methylation and cancer. Advances in Genetics. 70, 27-56 (2010).
  18. Xiong, Z., Laird, P. W. COBRA: a sensitive and quantitative DNA methylation assay. Nucleic Acids Res. 25, (12), 2532-2534 (1997).
  19. Meissner, A., et al. Reduced representation bisulfite sequencing for comparative high-resolution DNA methylation analysis. Nucleic Acids Res. 33, (18), 5868-5877 (2005).
  20. Gu, H., et al. Preparation of reduced representation bisulfite sequencing libraries for genome-scale DNA methylation profiling. Nat Protoc. 6, (4), 468-481 (2011).
  21. Bock, C., et al. Quantitative comparison of genome-wide DNA methylation mapping technologies. Nat Biotechnol. 28, (10), 1106-1114 (2010).
  22. Harris, R. A., et al. Comparison of sequencing-based methods to profile DNA methylation and identification of monoallelic epigenetic modifications. Nat Biotechnol. 28, (10), 1097-1105 (2010).
  23. Boyle, P., et al. Gel-free multiplexed reduced representation bisulfite sequencing for large-scale DNA methylation profiling. Genome Biol. 13, (10), R92 (2012).
  24. Chatterjee, A., Rodger, E. J., Stockwell, P. A., Weeks, R. J., Morison, I. M. Technical considerations for reduced representation bisulfite sequencing with multiplexed libraries. Journal of Biomedicine & Biotechnology. 2012, 741542 (2012).
  25. Lee, Y. K., et al. Improved reduced representation bisulfite sequencing for epigenomic profiling of clinical samples. Biological Procedures Online. 16, (1), 1 (2014).
  26. Akalin, A., et al. Base-pair resolution DNA methylation sequencing reveals profoundly divergent epigenetic landscapes in acute myeloid leukemia. PLoS Genet. 8, (6), e1002781 (2012).
  27. Hatzi, K., et al. A Hybrid Mechanism of Action for BCL6 in B Cells Defined by Formation of Functionally Distinct Complexes at Enhancers and Promoters. Cell Reports. 4, (3), 578-588 (2013).
  28. Will, B., et al. Satb1 regulates the self-renewal of hematopoietic stem cells by promoting quiescence and repressing differentiation commitment. Nature Immunology. 14, (5), 437-445 (2013).
  29. Lu, C., et al. Induction of sarcomas by mutant IDH2. Genes Dev. 27, (18), 1986-1998 (2013).
  30. Kumar, R., et al. AID stabilizes stem-cell phenotype by removing epigenetic memory of pluripotency genes. Nature. 500, (7460), 89-92 (2013).
  31. Li, S., et al. An optimized algorithm for detecting and annotating regional differential methylation. BMC Bioinformatics. 14, Suppl 5. S10 (2013).
  32. Patterson, K., Molloy, L., Qu, W., Clark, S. DNA methylation: bisulphite modification and analysis. Journal of Visualized Experiments. (56), 3170 (2011).
  33. Landan, G., et al. Epigenetic polymorphism and the stochastic formation of differentially methylated regions in normal and cancerous tissues. Nat Genet. 44, (11), 1207-1214 (2012).
  34. Yu, M., et al. Tet-assisted bisulfite sequencing of 5-hydroxymethylcytosine. Nat Protoc. 7, (12), 2159-2170 (2012).
  35. Goecks, J., Nekrutenko, A., Taylor, J., Galaxy, T. Galaxy: a comprehensive approach for supporting accessible, reproducible, and transparent computational research in the life sciences. Genome Biol. 11, (8), R86 (2010).
  36. Dorff, K. C., et al. GobyWeb: simplified management and analysis of gene expression and DNA methylation sequencing data. PLoS One. 8, (7), e69666 (2013).
  37. Roehr, J. T., Dodt, M., Ahmed, R., Dieterich, C. Flexbar − flexible barcode and adapter processing for next-generation sequencing platforms. MDPI Biology. 1, (3), 895-905 (2012).
  38. Martin, M. Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads. EMBnet.journal, North America. 17, (1), 10-12 (2011).
  39. Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 30, (15), 2114-2120 (2014).
  40. Needleman, S. B., Wunsch, C. D. A general method applicable to the search for similarities in the amino acid sequence of two proteins. J Mol Biol. 48, (3), 443-453 (1970).
  41. Krueger, F., Andrews, S. R. Bismark: a flexible aligner and methylation caller for Bisulfite-Seq applications. Bioinformatics. 27, (11), 1571-1572 (2011).
  42. Li, H., et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25, (16), 2078-2079 (2009).
  43. Kent, W. J., et al. The human genome browser at UCSC. Genome Res. 12, (6), 996-1006 (2002).
  44. Thorvaldsdottir, H., Robinson, J. T., Mesirov, J. P. Integrative Genomics Viewer (IGV): high-performance genomics data visualization and exploration. Briefings in Bioinformatics. 14, (2), 178-192 (2013).
  45. Team, R. C. R. A language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing. Vienna, Austria. ISBN 3-900051-07-0, http://www.R-project.org (2012).
  46. Nestor, C., Ruzov, A., Meehan, R., Dunican, D. Enzymatic approaches and bisulfite sequencing cannot distinguish between 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine in DNA. BioTechniques. 48, (4), 317-319 (2010).
  47. Huang, Y., et al. The behaviour of 5-hydroxymethylcytosine in bisulfite sequencing. PLoS One. 5, (1), e8888 (2010).
  48. Yu, M., et al. Base-resolution analysis of 5-hydroxymethylcytosine in the mammalian genome. Cell. 149, (6), 1368-1380 (2012).
  49. Song, C. X., et al. Genome-wide profiling of 5-formylcytosine reveals its roles in epigenetic priming. Cell. 153, (3), 678-691 (2013).
  50. Ito, S., et al. Tet proteins can convert 5-methylcytosine to 5-formylcytosine and 5-carboxylcytosine. Science. 333, (6047), 1300-1303 (2011).
  51. Akalin, A., et al. methylKit: a comprehensive R package for the analysis of genome-wide DNA methylation profiles. Genome Biol. 13, (10), R87-1186 (2012).
  52. Stockwell, P. A., Chatterjee, A., Rodger, E. J., Morison, I. M. DMAP: Differential Methylation Analysis Package for RRBS and WGBS data. Bioinformatics. 30, (13), 1814-1822 (2014).
  53. Sun, D., et al. MOABS: model based analysis of bisulfite sequencing data. Genome Biol. 15, (2), R38 (2014).
  54. Bock, C. Analysing and interpreting DNA methylation data. Nat Rev Genet. 13, (10), 705-719 (2012).
  55. Rivera, C. M., Ren, B. Mapping human epigenomes. Cell. 155, (1), 39-55 (2013).
Förstärkt Minskad Representation bisulfit sekvense för Bedömning av DNA-metylering vid baspar Upplösning
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Garrett-Bakelman, F. E., Sheridan, C. K., Kacmarczyk, T. J., Ishii, J., Betel, D., Alonso, A., Mason, C. E., Figueroa, M. E., Melnick, A. M. Enhanced Reduced Representation Bisulfite Sequencing for Assessment of DNA Methylation at Base Pair Resolution. J. Vis. Exp. (96), e52246, doi:10.3791/52246 (2015).More

Garrett-Bakelman, F. E., Sheridan, C. K., Kacmarczyk, T. J., Ishii, J., Betel, D., Alonso, A., Mason, C. E., Figueroa, M. E., Melnick, A. M. Enhanced Reduced Representation Bisulfite Sequencing for Assessment of DNA Methylation at Base Pair Resolution. J. Vis. Exp. (96), e52246, doi:10.3791/52246 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter