Summary
Het doel van dit rapport is om de protocollen beschrijven aan de netvliespigmentepitheel (RPE) van geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPS) cellen met behulp van verschillende maten van embryoid lichamen af te leiden.
Introduction
Geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPS) cellen zijn een soort van pluripotente stamcellen afgeleid door het herprogrammeren van volwassen cellen met extrinsieke factoren 1. Daarentegen embryonale stamcellen (SER), een ander soort van pluripotente stamcellen, worden gegenereerd uit de binnenste celmassa van de blastocyst 2-3. Ondanks hun verschillende oorsprong, iPS cellen en SER vergelijkbaar in hun onbeperkte capaciteit tot replicatie in vitro en in hun vermogen om te differentiëren in elk celtype 4-5. Deze kenmerken van iPS-cellen maken ze ideale kandidaten voor toepassingen in gepersonaliseerde regeneratieve geneeskunde. Recent onderzoek inspanningen zijn gericht op het ontwikkelen van robuuste differentiatie protocollen voor het produceren van gespecialiseerde volwassen cellen waaronder netvliespigmentepitheel (RPE) 6-11.
Voor potentiële klinische toepassingen van iPS afgeleide cellen, een gerichte differentiatie die specifiek celtype is essentieel. Er zijn verschillende methodengepubliceerd voor gerichte differentiatie van zowel SER's en iPS-cellen in RPE dat varieert enorm in hun efficiency 6-7, 12-16. We weten nog steeds niet veel van de moleculaire gebeurtenissen die de cel / weefsel lot regeren tijdens de ontwikkeling of differentiatie. De laatste jaren zijn pogingen gedaan om de differentiatie protocol dat de embryologische ontwikkeling zoveel mogelijk kunnen nabootsen ontwikkelen. Tijdens de blastocyst fase vastgelegde populatie van stamcellen bij elkaar in een driedimensionale micro. Zo werden verschillende strategieën toegepast op de ESC / iPS cellen geassembleerd samen te groeien en ze in drie dimensies. Deze stamcellen aggregaten worden embryoid instanties (EBS) genoemd. Studies hebben aangetoond dat EB differentiatie van stamcellen nabootsen vroeg stadium van embryo-ontwikkeling en kan spontaan ontstaan primitieve endoderm op het buitenoppervlak geven. Later, zoals EB ontwikkeling vordert, gedifferentieerde cel fenotypes van drie kiem lijnen weergegeven 17-18. Therefore, EBS gebaseerd differentiatie protocollen hebben veel aandacht voor in vitro differentiatie van ESC / iPS-cellen aangetrokken en zijn een goede kandidaat voor RPE generatie van pluripotente stamcellen 13.
EVSA's kunnen worden gemaakt met behulp van verschillende methoden van ESC / iPS-cellen. Aanvankelijk, EBS werden gemaakt door het afschrapen van aanhangend koloniën en het handhaven ervan in niet-klevende schorsing cultuur. Echter, deze aanpak levert heterogene populatie van EBS die lage reproduceerbaarheid veroorzaakt. Opknoping druppel celcultuur en microwell gebaseerd EVSA vorming zijn andere populaire technieken voor EVSA formatie die homogeen EVSA van gedefinieerde maten die zijn zeer reproduceerbaar opleveren. Bovendien kan de microwell techniek groot aantal aggregaten opleveren met minder inspanning.
Differentiatie van cellen binnen EBS wordt geregeld door een multiplex van morfogenische signalen uit de extracellulaire en intracellulaire micro-omgeving. In tegenstelling tot differentiatie in een maolayer formaat, EBS een platform voor complexe samenstel van cellen en intercellulaire signalering optreden 17. Interessant is het aantal pluripotente stamcellen gebruikt om individuele EBS maken werd waargenomen dat het lot van cellen beïnvloeden. Bijvoorbeeld, in een hematopoietische differentiatie studie van de menselijke SER, werd waargenomen dat 500-cel EB bevorderde differentiatie naar myeloïde lijn terwijl 1000-cel EB geduwd richting erythroid lineage 20. In een andere studie, kleinere EBS begunstigd endoderm differentiatie terwijl grotere EVSA gepromoveerd naar neuro-ectoderm differentiatie 11, 17.
Deze eerdere studies suggereren sterk dat het aantal ESC / iPS-cellen gebruikt om individuele EBS maken van invloed op de EBS gebaseerde differentiatie naar elke celtypen. Echter, voor zover wij weten, zijn momenteel geen studies die de effecten van EBS grootte zijn toegelicht in de neiging om te differentiëren naar RPE. Het doel van deze studie is om de invloed van de kenmerkenEB grootte op geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPS-cellen) - netvliespigmentepitheel (iPS-RPE) differentiatie en om de optimale mobiele nummer aan de EBS te maken voor gerichte differentiatie naar RPE lineage identificeren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Voorbereiding van Cultuur Reagentia en Cultuur Platen
- Bereid voedingsvrije stamcellen kweekmedium door toevoeging van 100 ml 5x serumvrij supplement 400 ml stamcellen basaal medium. Het medium is stabiel bij 4 ° C gedurende maximaal 2 weken bij -20 ° C gedurende 6 maanden.
- Voeg 10 pM oplossing van-rho verbonden, ook indien opgerold-coil met proteïne kinase (Rock) remmer (Y-27362) in de handel verkrijgbare embryoid lichaam (EB) vorming medium.
- Bereid differentiatiemedium door 0,1 mM β-mercaptoethanol, 0,1 mM niet-essentiële aminozuren, 2 mM L-glutamine, 10% knockout serum vervanging (KSR) en 10 ug / ml gentamicine aan Dulbecco's Modified Eagle Medium / Nutrient Mixture F-12 (DMEM / F12).
- Bereid iPS-RPE medium door toevoeging 1x N1 supplement, 0,1 mM niet-essentiële aminozuren, 250 pg / ml taurine, 13 ng / ml trijood-L-thyronine natriumzout, 20 ng / ml hydrocortison, 5 ug / ml gentamicine en 15% Foetaal runderserum (FBS) <sup> 21 tot Minimum Essential Medium Eagle (MEM). Breng de pH op 7,4.
- Bereid trijood L-thyronine natriumzout stamoplossing. Los 1 mg trijood L-thyronine natriumzout in 1 N natriumhydroxide onder voorzichtig schudden. Voeg 49 ml MEM met 50 ml van 20 ug / ml trijood-L-thyronine natriumzout maken. Aliquots en invriezen bij -20 ° C totdat het nodig is. Gebruik de juiste hoeveelheid om de gewenste concentratie in het uiteindelijke kweekmedium te bereiken.
- Bereid hydrocortison stamoplossing. Oplosbaar 1 mg hydrocortison in 1 ml 100% ethanol door voorzichtig schudden. Voeg 19 ml MEM om 20 ml van 50 ug / ml hydrocortison voorraadoplossing. Aliquot en bevriezen bij -20 ° C totdat het nodig is. Gebruik geschikte volume op de gewenste concentratie in het uiteindelijke kweekmedium bereiken.
- Bereid een werkoplossing van Dispase van 1 mg / ml in DMEM / F12.
- Bereiding van matrix gecoate platen
- Bereid eiwitmatrix gewonnen uit Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) mouse sarcoom cellen in DMEM / F12 tot 0,08 mg / ml. Coat elk putje van een 6-wells plaat met 1 ml van de matrix oplossing. Incubeer de beklede platen bij kamertemperatuur gedurende 1 uur.
- Na 1 uur incubatie, zuig het overtollige DMEM / F12. Voeg 0,5 ml voedingsvrije stamcellen kweekmedium om uitdroging van de putjes te voorkomen. De matrix gecoate platen klaar voor gebruik.
- Bereid microwell platen onder spoelen elk putje met 2 ml DMEM / F12. Verwijder DMEM / F12 en voeg 0,5 ml EB vorming medium aangevuld met Rock remmer aan elk putje. Centrifugeer de plaat bij 2000 xg gedurende 5 minuten om eventuele luchtbellen te verwijderen.
- Bereid FACS kleuring buffer door het mengen van 2% FBS en 0,09% natriumazide in met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS). Stel de buffer op pH 7,4.
- Bereid trypsine neutraliserende oplossing door toevoeging van 10% FBS tot DMEM / F12.
2. iPS Cultuur
- Vóór iPS cel enten warm voedingsvrije stamcellen kweekmedium tot 37 ° C, en de matrix gecoate platen klaar.
- Snel ontdooien de IMR90-1 iPS cellen in een 37 ° C waterbad. Verwijder vervolgens de cryo-flacon uit het waterbad en veeg de flacon met 70% ethanol. Breng de cellen om een 15 ml conische buis met een pipet 2 ml tot breken van celklompjes minimaliseren.
- Voeg 5 ml warm-feeder gratis stamcel kweekmedium om de cellen druppelsgewijs en meng voorzichtig. Centrifugeer de cellen bij 300 g gedurende 5 min bij RT en de bovenstaande vloeistof.
- Resuspenderen de cel klonten in 2 ml voedingsvrije stamcellen kweekmedium en zaden de cel klonten in de putjes van met matrix gecoate plaat. Plaats de plaat in een 37 ° C incubator met 5% CO2, 95% vochtigheid.
- Veranderen dagelijks de iPS cel kweekmedium. Observeren ongedifferentieerde kolonies vijf tot zeven dagen na het zaaien. Controleer voor ongedifferentieerde kolonies die klaar zijn voor de passage (kolonies met een dichte midden) onder een lichtmicroscoop zijn.
3. Passage van iPS-cellen
- Vóór begin tot passage de iPS cellen warm de dispase oplossing DMEM / F12 en voedingsvrije stamcellen kweekmedium tot 37 ° C in een waterbad.
- Voordat passage iPS cellen, verwijder alle gebieden van differentiatie door het afschrapen van het gebied en het opzuigen van het medium. Spoel zorgvuldig de iPS cellen met 2 ml DMEM / F12.
- Voeg 1 ml van 1 mg / ml dispase aan elk putje en incubeer bij 37 ° C gedurende 7 min. Zuig het Dispase en voorzichtig spoel de cel kolonies met 2 ml DMEM / F12 tweemaal. Na spoelen, voeg 2 ml voedingsvrije stamcellen kweekmedium aan elke well.
- Met behulp van een pipet 5 ml voorzichtig schrapen de kolonies van de plaat naar cel klonten vormen. Breng de vrijstaande celklonten aan een 15 ml conische buis. Voeg voldoende voedingsvrije stamcellen kweekmedium de volgende passage van cellen zaad.
4. Generatie van EBS Met behulp Microwell Platen
- Bereiding van een enkele celsuspensie van iPS cellen
- Verwijder de medium van de iPS-cellen en spoel de iPS cellen met 2 ml DMEM / F12. Voeg 750 ul van Accutase om iPS cellen in elk putje van de 6-wells plaat. Incubeer de cellen bij 37 ° C en 5% CO2 om de cellen los te maken van de plaat (ongeveer 5-10 min).
- Gebruik een pipet om zacht dissociëren resterende cellen en alle resterende cellen los op het plaatoppervlak. Breng de cellen in een 50 ml conische buis. Spoel de plaat met 5 ml DMEM / F12 en combineren gespoeld DMEM / F12 met de cellen in de conische buis. Passeren de celsuspensie door een 40 micrometer cel zeef om eventuele resterende celklonten verwijderen.
- Centrifugeer de cellen bij 300 g gedurende 5 min bij RT om het Accutase verwijderen. Resuspendeer de celpellet in EB vorming medium zodat de celconcentratie ongeveer 0,5-1,0 x 10 7 cellen / ml.
- Bepaal het aantal levensvatbare cellen door het tellen van de cellen met trypaanblauw en een hemocytometer.
- Adjusting celdichtheid in microwells op maat bediend EBS vormen
- Pas het aantal cellen aan elk putje van de microwell plaat om de gewenste EB afmetingen genereren. Cellen toe te voegen aan de microwells van het bereid in stap 1.9 platen, Verdeel de cellen door de pipet voorzichtig de cellen meerdere malen.
OPMERKING: Aantal cellen nodig per well = gewenste aantal cellen per EB x aantal microwells per putje. - Stel de EB vorming medium aangevuld met Rock remmer in de putjes tot een eindvolume van 2,0 ml. Herverdeling van de cellen door de pipet voorzichtig elk putje. Centrifugeer de microwell platen bij 100 xg gedurende 3 min. Plaats de platen in een incubator bij 37 ° C met 5% CO2 en 95% vochtigheid gedurende 24 uur.
- Pas het aantal cellen aan elk putje van de microwell plaat om de gewenste EB afmetingen genereren. Cellen toe te voegen aan de microwells van het bereid in stap 1.9 platen, Verdeel de cellen door de pipet voorzichtig de cellen meerdere malen.
- Oogsten van EBS uit de microwell platen
- Oogst EBS van microputjes pipetteren medium in de put op en neer met een 1 ml micropipettor de meeste EBS verwijderen. Passeer de EB suspensie door een omgekeerde 40 micrometer celzeef bovenop een 50 ml conische buis enkelvoudige cellen te verwijderen.
- Was de microwell plaat 5 maal met 1 ml DMEM / F12 alle EBS verwijderen. Verzamel wast en gaat over de omgekeerde cel zeef. Draai de cel zeef op de kop om een nieuwe 50 ml conische buis. Verzamel de EBS door wassen met EB vorming medium. Telling EBS om de opbrengst te bepalen.
5. Plating EBS en Initiëren Differentiatie
- Plate de EBS eiwit bedekte matrix zes putjes (zoals in stap 1.8.1) in een dichtheid van <1,000 EBS / putje in EB vorming medium plus 10 uM Rock inhibitor. Incubeer de EBS bij 37 ° C met 5% CO2 en 95% vochtigheid gedurende 24 uur.
- 24 uur na EB plating, vervangen door differentiatiemedium differentiatie initiëren. Wijzig de helft van het differentiatiemedium om de dag tot de cellen verzameld voor verdere analyse.
- Verzamelen monsters op dag 6, 17, 29 en 60 tot RT-PCR uit te voeren, immunocytochemistry en FACS om de expressie van karakteristieke RPE genen en eiwitten te valideren.
6. RNA-extractie en PCR
- Uittreksel RNA van de EB monsters volgens de instructies in de handel verkrijgbare kit. Bepaal RNA-concentratie met behulp van een spectrofotometer.
- Voer reverse transcriptie op 100 ng totaal RNA volgens de handel verkrijgbare RNA in cDNA reverse transcriptie kit.
- Voer PCR met 10 ng cDNA met de volgende primers (tabel 1) bij een concentratie van 10 pmol / 10 ng cDNA. Stel de PCR als volgt: denatureren van DNA bij 95 ° C gedurende 5 min, amplificeren met 35 cycli bij 95 ° C gedurende 15 sec, 60 ° C gedurende 30 sec, 72 ° C gedurende 1 min, gevolgd door een laatste cyclus bij 72 ° C gedurende 10 min. Voer het PCR product op een 1% agarosegel.
7. Immunocytochemie
- Was de EBS met PBS tweemaal bij kamertemperatuur. Fix De EBS bij RT in 4% paraformaldehyde gedurende 10 min. Eenmaal met PBS spoelen bij kamertemperatuur. WINKEL monsters in PBS bij 4 ° C tot gebruik voor het kleuren.
- Op vlekken dag, behandel de vaste cellen met fixatie en permeabilisatie reagentia. Incubeer de monsters met blokkerende oplossing (10% geit serum in permeabilisatie oplossing) gedurende 1 uur bij KT.
- Voer immunochemische 10% geit serum in permeabilisatie oplossing met de volgende primaire antilichamen bij de aangegeven verdunningen: anti-Pax6 (01:10), anti-RX (1: 200), anti-MITF (01:30), en anti- ZO1 (1: 100). Incubeer monsters met overeenkomstige antilichamen O / N bij 4 ° C.
- De volgende dag, verwijder het primaire antilichaam uit de cellen en spoel de monsters driemaal met PBS. Incubeer monsters met fluorofoor geconjugeerde secundaire antilichamen gedurende 1 uur bij KT.
- Verwijder het secundaire antilichaam uit de cellen en spoel de monsters drie keer in PBS. Monteer de dekglaasjes op glasplaatjes met DAPI met montage medium en laat monsters naar O / N in een donkere kamer.Gebruik een fluorescentiemicroscoop van kleuring zichtbaar.
8. Kleuring voor FACS analyse
- Was de gekweekte EBS in PBS twee keer. Incubeer de EBS met 0,5 ml 0,25% trypsine gedurende 5-10 minuten om een enkele celsuspensie te maken. Neutraliseer het trypsine met trypsine neutraliserende oplossing (1 ml / putje).
- Breng de enkele celsuspensie aan een 15 ml conische buis en centrifugeer bij 600 xg gedurende 10 min.
- Verwijder het supernatant en voeg 10 ml DMEM / F12 aan de cellen in de buis. Voorzichtig omkeren om de cellen te mengen. Centrifugeer bij 600 x g. Na centrifugeren, gooi het supernatant en resuspendeer de cellen in FACS vlekken buffer.
- Tel het totale aantal cellen. Centrifugeer bij 600 xg gedurende 10 min. Na centrifugeren discard supernatant. Fixeer de cellen onmiddellijk gevolgd door toevoeging van 0,5 ml van 4% paraformaldehyde. Meng goed door zachte vortexen. Incubeer de cellen bij 4 ° C gedurende 20 min.
- Centrifugeer bij 600 xg gedurende 10 minuten en verwijder desupernatant. Vortex voorzichtig naar celpellet verstoren. Permeabilize de cellen door toevoeging van 1 ml gekoelde permeabilisatie oplossing. Vortex voorzichtig te mengen en incuberen op ijs gedurende 30 minuten.
- Centrifugeer bij 600 xg gedurende 10 minuten en verwijder het supernatant. Voeg 3 ml van FACS vlekken buffer en resuspendeer. Herhaal deze stap voor een keer. Resuspendeer de cellen in FACS kleuring buffer bij een eindconcentratie van 5 x 10 6 cellen / ml.
- Breng 100 pi van de celsuspensie (0,5 x 10 6 cellen) aan elk microfugebuizen en voeg het aanbevolen volume van primair antilichaam. Voor Pax6, voeg 5 ul van PE anti-Pax6 in 100 pl celsuspensie. Voor MITF, voeg 5 ul van anti-MITF in 100 pl celsuspensie.
- Mengen en incuberen bij kamertemperatuur gedurende 60 minuten. Voeg 3 ml FACS kleuring buffer. Mix en centrifugeer bij 600 xg gedurende 10 min. Verwijder het supernatant en herhaal 8.16 twee maal.
- Voor MITF vlekken, incubeer de cellen in het voortgezet AntiboDY, geit anti-muis Alexa Fluor 488 bij een verdunning van 1: 2000 gedurende 1 uur bij 4 ° C. Voor PAX6 vlekken, vermijd deze stap.
- Was de cellen met 5 ml FACS-kleuring buffer en centrifugeer bij 600 xg gedurende 10 min. Herhaal dit proces nog twee keer.
- Resuspendeer de cellen in 500 pi FACS-kleuring buffer en vortex voorzichtig aan de cel pellet te verstoren. Monsters zijn klaar voor flowcytometrische analyse.
9. iPS-RPE Isolatie en Cultuur
- Op dag 29, knip voorzichtig rond de geselecteerde gepigmenteerde kolonies van de cultuur plaat met behulp van een 200 ul pipet tip. Breng de drijvende kolonies aan een 15 ml conische buis. Centrifugeer de kolonies bij 600 xg gedurende 10 min bij RT en de bovenstaande vloeistof.
- Resuspendeer de cel kolonies in 10 ml DMEM / F12 en centrifugeer bij 600 xg gedurende 10 min. Verwijder het supernatant.
- Bereid een enkele celsuspensie door incuberen van de kolonies met 2 ml 0,25% trypsine bij 37 ° C gedurende 7-10 min. Zachtjes vortex de celsuspensie naar de koloniën distantiëren.
- Neutraliseren van de trypsine door toevoeging van 2 ml van iPS-RPE medium. Centrifugeer bij 600 xg gedurende 10 min en de bovenstaande vloeistof. Resuspendeer de enkele cellen in 2 ml van iPS-RPE medium. Breng de cellen in een eiwit bedekte matrix 6-well plaat en plaats in een incubator bij 37 ° C, 5% CO2 en 95% vochtigheid.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In dit experiment, iPS cellen werden gekweekt en gedifferentieerd in de RPE geslacht van EBS. EBS van gecontroleerde grootte gevormd met microwell platen. Zoals gezien in figuur 1 EB formatie homogeen in de platen met microputjes. Deze EBS werden vervolgens verzameld en uitgeplaat op platen met 6 putjes (figuur 2).
RPE kunnen worden geïdentificeerd door hun klassieke hexagonale morfologie, pigmentatie en expressie van RPE merkers. Na 12 weken van de cultuur, had de 200-cel EBS astrocyten en fibroblast morfologie ontwikkeld. Geen pigment werd waargenomen in deze cellen (Figuur 3A). Grotere EBS ontwikkelde een monolaag van klassieke RPE morfologie en pigmentatie (Figuur 3B en C) Immunocytochemie aan RPE markers detecteren, MITF en ZO1 bleek co-expressie van deze eiwitten die waren afgeleid van 500 cellen en 3000 cellen EBS (figuur 4) .
EXpressions eye veld en RPE-genen werden gecontroleerd met PCR. Figuur 5 toont het genexpressieprofiel van neuroectodermale, oogheelkunde precursoren en RPE markers in verschillende maten EBS. Belangrijk is dat de specifieke RPE merker, RPE65 gedetecteerd beginnend op dag 17.
Om de opbrengst van cellen die in RPE geslacht had gedifferentieerd kwantificeren, werd FACS-analyse uitgevoerd om de neuro-ectodermale en RPE precursor markers respectievelijk PAX6 en MITF detecteren. Figuur 6A toont neuroectodermale marker PAX6 in verschillende maten EBS op verschillende tijdstippen. Ongeveer 50% van de geanalyseerde cellen waren positief voor PAX6 op dag 6 van de cultuur in de 3000-cel EBS. Bovendien, FACS analyse van RPE marker, MITF op verschillende maten EB bleek dat 20% van de cellen tot expressie MITF op dag 60 van differentiatie.
Gekweekte RPE worden ook gekenmerkt door hun vermogen om hun pigment en veelhoekige morfologie te verliezen en het verkrijgen van eenfibroblast fenotype na passage. Daarom, om te bepalen of de iPS afgeleid RPE bezit deze kenmerken, we mechanisch geïsoleerd en de cellen gepasseerd. Figuur 7A toont de nieuw gepasseerd cellen pigment verloren en gewonnen fibroblast morfologie. Bovendien zijn deze cellen verspreid en weer de klassieke veelhoekige morfologie bij confluentie (figuur 7B). Binnen enkele weken, deze cellen weer hun pigmentatie (figuur 7C).
| Gen | NICB verwijzing | Sequentie (5'-3 ') | Grootte (bp) | |
| PAX6 | NM_001258465.1 | F | CGGAGTGAATCAGCT CGGTG | 300 |
| R | ||||
| RPE65 | NM_000329.2 | F | GCCCTCCTGCACAAG TTTGACTTT | 259 |
| R | AGTTGGTCTCTGTGC AAGCGTAGT | |||
| RX | NM_013435.2 | F | GAATCTCGAAATCTC AGCCC | 279 |
| R | CTTCACTAARRRGCT CAGGAC | |||
| MITF | NM_198178.2 | F | TTCACGAGCGTCCTG TATGCAGAT | 106 |
| R | TTGCAAAGCAGGATC CATCAAGCC | |||
| GAPDH- | NM_001256799.1 | F | ACCACAGTCCATGCC ATCAC | 452 |
| R | TCCACCACCCTGTTG CTGTA |
Tabel 1. PCR primer sequenties voor Pax6, RPE65, RX, MITF en GAPDH-genen.
Figuur 1. Vorming van EBS met microwell platen. Elke microwell bevat (A) 100 cellen, (B) 200 cellen, (C) 500 cellen, en (D) 3,000 cellen. Cellen werden gedurende 24 uur bij 37 ° C en 5% CO2 gedurende de vorming van EBS. (Vergroting 100X, schaal bar = 400 pm). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2. EBS geoogst microwell platen. (A) 200 cellen EB, (B) 500 cel EB, (C) 3000-cellen EB, en (D) 15000-cel EB. (Vergroting 200X, schaal bar = 200 pm). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3. iPS afgeleide RPE van verschillende maten EBS. EBS werden gedurende 12 weken. (A) 200-cel EBS had alleen ontwikkeld astrocyten en fibroblast morfologie zonder pigmentatie; terwijl 80% - 90% van de cellen in de 500-cel EBS (B en C) ontwikkelde een monolaag van veelhoekige gepigmenteerde cellen. (A & B: Vergroting 100X, schaal bar= 400 pm; (C):. Vergroting 200X, schaal bar = 200 pm) Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 4. Co-expressie van MITF en ZO1. 500- en 3000-cel EBS uitgedrukt MITF en ZO1 na 17 dagen van de differentiatie. (Vergroting 400X, schaal bar = 20 pm). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 5. Genexpressieprofiel van verschillende grootte van EBS op verschillende tijdstippen van differentiatie. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 6. FACS-analyse van verschillende grootte voor EB RPE differentiatie. (A) FACS gegevens van neuroectodermal marker PAX6 in verschillende maten van EBS tijdens differentiatie. (B) FACS analyse van RPE marker MITF op gevarieerde EB maten op dag 60 van differentiatie. Het hoogste niveau van MITF bereikte 20% en was constant tussen EB van 500, 3000 en 15.000 cellen.
Figuur 7. Vervolg cultuur van handmatig geïsoleerd RPE. (A) RPE werd in subcultuur en fibroblast morpholo verworvengy na passage. (B & C) Cellen ontwikkeld veelhoekige morfologie en pigmentatie in de tijd. (Vergroting 100X, schaal bar = 400 pm). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Om de volledige belofte van pluripotente stamcellen voor celtherapie realiseren, is het noodzakelijk om hun differentiatie reguleren op consistente en reproduceerbare wijze. Dit rapport beschrijft protocollen op maat bediend EBS behulp microwell plate-technologie te vormen, initiëren differentiatie in de richting van RPE en identificeren van eiwit en gen markers van RPE. Om de in vitro differentiatie synchroniseren, werden homogene groottes van EBS gevormd door bekende aantallen iPS cellen gecentrifugeerd microwell platen geforceerde aggregatie. Immunocytochemie en reverse transcriptie polymerase ketenreactie (RT-PCR) worden gebruikt om de uitdrukkingen RPE eiwitten en genen verklaarde controleren. Tenslotte, de efficiëntie van differentiatie in verschillende maten EBS werd geanalyseerd door FACS analyse. Deze technieken kunnen de differentiatie van iPS-cellen in RPE voor toekomstige toepassingen te vergemakkelijken.
Er zijn verschillende belangrijke punten bij deze werkwijze die zorgvuldig moet worden uitgevoerd naar eNSure het succes van dit protocol en het bereiken van nauwkeurige gegevens. De eerste belangrijke stap optreedt tijdens de iPS celcultuur. iPS cellen moet worden gehandhaafd in een pluripotente staat om hun stemness behouden. De cellen moeten de dagelijkse veranderd om de juiste niveaus van bFGF behouden en zorgvuldig worden dagelijks gecontroleerd op tekenen van differentiatie medium hebben. Ongedifferentieerde iPS cellen groeien als compacte meercellige kolonies. De cellen moeten een hoge nucleaire om cytoplasma-ratio en prominente nucleoli hebben. De iPS kolonies worden gekenmerkt door een duidelijke grens met verscheidene lagen cellen in het midden. Tekenen van differentiatie zijn verlies van bepaalde kolonie grenzen, ongelijkmatige celmorfologie en het uiterlijk van duidelijke celtypen, zoals neuronen en fibroblasten. Enkele cellen die gedifferentieerd kunnen worden verwijderd door Dispase en spoelen echter kolonies met deze kenmerken handmatig worden verwijderd uit de kweek 22. Voorbereiding van een enkele iPS celsuspensie for vormen het EBS is de volgende belangrijke stap. Het is belangrijk om een suspensie zonder celaggregaten te stellen om het gewenste aantal cellen nauwkeurig leveren aan de microwell plaat en bereidt de gewenste grootte EB. RNA preparaten voor PCR analyse belangrijk. Inconsistent RNA kwaliteit is een belangrijke bron van variabiliteit in PCR data. RNA-extractie moet opleveren minimaal afgebroken RNA voor het beste resultaat. Succesvolle RNA-extractie zal totaal RNA opbrengst met minimale degradatie en vrij van vervuilende RNases. Na de bepaling van de RNA-concentratie spectrofotometrisch bij 260 nm, moet de zuiverheid van het monster bepaald bij 230 en 280 nm om verontreiniging te detecteren met polysacchariden of eiwitten. Het 230: 260: 2:: 1 tot hoge kwaliteit RNA geven zonder verontreiniging 23 280 ratio voor RNA moet 1 zijn. Tenslotte is het belangrijk om de cellen voor FACS kleuring adequaat oplossen. Tijdens deze fixatie stap moet de cellen worden gescheiden om klonteren te voorkomen. Insufficseerde cel resuspensie voorafgaand aan permeabilisatie zal leiden tot cel klonteren en onnauwkeurig vlekken.
Wij raden aan dat het protocol te volgen zoals beschreven, echter een paar aanpassingen gemaakt kan worden indien nodig. Tijdens de generatie van EBS beschreven in stap 4, kan het aantal cellen per EB variëren van 500 tot 3000 op een hoge opbrengst van cellen gedifferentieerd in RPE bereiken. Als het aantal iPS cellen beperkt, werd 500 cellen EBS RPE vergelijkbaar met de 3000-cel EBS produceren. Extra zorg moet worden genomen tijdens de RNA-extractiewerkwijze beschreven in Stap 6. Monsters worden uitgevoerd in drievoud zodat hoogwaardige RNA kunnen worden verkregen. Bij immunocytochemie zoals beschreven in stap 7, kunnen de concentraties primaire en secundaire antilichaam zodanig aangepast aan signaalintensiteit verbeteren en de achtergrond. De positieve en negatieve controles dienen te worden opgenomen in de test. Tijdens stap 8, FACS-analyse, indien de verwachte resultaten niet acquired na kleuring, kan een kleine steekproef van de gekleurde cellen op een dia worden geplaatst en bekeken met een microscoop om vlekken te visualiseren. De positieve en negatieve controles dienen te worden opgenomen in de test. Wanneer de cellen niet worden gekleurd zoals verwacht, kan het antilichaam concentraties worden verhoogd of verlaagd nodig.
De in dit rapport beschreven techniek leidt tot een hogere opbrengst van RPE dan spontane differentiatie, zonder het gebruik van toegevoegde chemicaliën. De belangrijkste beperking van deze benadering is dat er ook een groot aantal niet-RPE cellen gegenereerd wordt. Daarom moet de RPE zorgvuldig worden uitgeselecteerd en verrijkt zoals beschreven in stap 9 om een homogene populatie.
De betekenis van deze benadering is dat een hogere opbrengst aan RPE worden ontleend iPS cellen dan spontane differentiatie technieken. Het gebruik van kleine moleculen RPE ontlenen iPS is ook vermeld om een hoge opbrengst gevengedifferentieerde cellen, echter deze techniek veel complexer en vereist de timing en concentraties van de kleine moleculen worden geoptimaliseerd om de gewenste resultaten te bereiken 7,10. Bovendien, de kleine moleculen die in deze werkwijzen hebben pleiotrope effecten die het resultaat kunnen verwarren.
De beschreven werkwijze kan worden toegepast om EBS gewenste grootte met hoge reproduceerbaarheid maken. Deze techniek gegenereerde EBS van uniforme grootte die werden gebruikt om de differentiatie van iPS cellen naar de RPE lijn optimaliseren zonder het gebruik van extra chemicaliën. De iPS-RPE cellen, afkomstig van EVSA kan dan verder worden gebruikt bij transplantatie studies om hun integratie in het netvlies te bevestigen in een functionele organisatie. Deze cellen kunnen ook een goede onderzoeksmodel aan de pathogenese van verschillende RPE ziekten in vitro bestuderen. De bruikbaarheid van deze benadering kan worden toegepast op de gerichte differentiatie in vele celtypen, afhankelijkde grootte van de EBS en in vivo oorsprong van de cel in de blastocyst. Cellen van het ectoderm zal leiden tot neuronen, epidermis, haren en borstklier cellen bevatten; endoderm geven aanleiding tot maag, dikke darm, longen en darmcellen geven; mesoderm zal aanleiding geven tot de skeletspieren, hart, nieren, en bindweefselcellen 3,11,19 geven. Zodra de juiste EB maat is vastgesteld, hebben de gedifferentieerde cellen alleen worden geanalyseerd door immunocytochemie of FACS voor de juiste expressie van merker-eiwitten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| mTeSR1 media + 5x supplement | Stem Cell Technologies | 5850 | |
| Y-27632 (Rock Inhibitor) | Stem Cell Technologies | 72304 | |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 11330-032 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M-7154 | |
| Non essential amino acids | Hyclone(Fisher) | SH30853.01 | |
| Knockout serum replacement | Life Technologies | 10828-028 | |
| Gentamicin | Life Technologies | 15750-060 | |
| L-Glutamine | Life Technologies | 25030-081 | |
| MEM media | Life Technologies | 10370-021 | |
| N1 supplement | Sigma | N-6530-5ML | |
| Taurine | Sigma | T-8691-25G | |
| Hydrocortisone | Sigma | H0888-1G | |
| Fetal bovine serum | Hyclone(Fisher) | SH3008803HI | |
| Triiodo-L-thyronine sodium salt | Sigma | T6397 | |
| Sodium hydroxide | Sigma | S5881 | |
| Dispase | Life Technologies | 17105-041 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354277 | |
| Phosphate buffered saline | Hyclone(Fisher) | 10010-023 | |
| Aggrewell 400 plate | Stem Cell Technologies | 27940 | |
| AggreWell medium | Stem Cell Technologies | 5893 | |
| Accutase | Stem Cell Technologies | 7920 | |
| BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Kit | BD Biosciences | 554714 | |
| Mouse Anti-PAX6 antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | ||
| Rabbit Anti-RX antibody | Abcam | Ab23340 | |
| Mouse Anti-MITF antibody | Thermo Scientific | MS-772-P | |
| Rabbit Anti-ZO-1 antibody | Invitrogen | 40-2200 | |
| RNeasy plus mini kit | Qiagen | 74134 | |
| PCR master mix | Promega | M7502 | |
| High capacity RNA to cDNA kit | Life Technologies | 4387406 |
References
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from fibroblast cultures. Nat Protoc. 2 (12), 3081-3089 (2007).
- Reubinoff, B. E., et al. Embryonic stem cell lines from human blastocysts: somatic differentiation in vitro. Nat Biotechnol. 18 (4), 399-404 (2000).
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318 (5858), 1917-1920 (2007).
- Buchholz, D. E., et al. Derivation of functional retinal pigmented epithelium from induced pluripotent stem cells. Stem Cells. 27 (10), 2427-2434 (2009).
- Ukrohne, T. U., et al. Generation of retinal pigment epithelial cells from small molecules and OCT4 reprogrammed human induced pluripotent stem cells. Stem Cells Transl Med. 1 (2), 96-109 (2012).
- Subba, R. M., Sasikala, M., Nageshwar, R. D. Thinking outside the liver: induced pluripotent stem cells for hepatic applications. World J Gastroenterol. 19 (22), 3385-3396 (2013).
- Yoshida, Y., Yamanaka, S. iPS cells: a source of cardiac regeneration. J Mol Cell Cardiol. 50 (2), 327-332 (2011).
- Mak, S. K., et al. Small molecules greatly improve conversion of human-induced pluripotent stem cells to the neuronal lineage. Stem Cells Int. 2012, 140427 (2012).
- Bauwens, C. L., et al. Control of human embryonic stem cell colony and aggregate size heterogeneity influences differentiation trajectories. Stem Cells. 26 (9), 2300-2310 (2008).
- Cour la, M., Tezel, T. The Retinal Pigment Epithelium. Advances in Organ Biology. 10, 253-273 (2006).
- Vaajassari, V., et al. Toward the defined and xeno-free differentiation of functional human pluripotent stem cell-derived retinal pigment epithelial cells. Mol Vis. 17, 558-575 (2011).
- Carr, A. J., et al. Protective effects of human iPS-derived retinal pigment epithelium cell transplantation in the retinal dystrophic rat. PLoS One. 4 (12), e8152 (2009).
- Muniz, A., et al. Retinoid uptake, processing, and secretion in human iPS-RPE support the visual cycle. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (1), 198-209 (2014).
- Meyer, J. S., et al. Modeling early retinal development with human embryonic and induced pluripotent stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (39), 16698-16703 (2009).
- Bratt-Leal, A. M., Carpenedo, R. L., McDevitt, T. C. Engineering the embryoid body microenvironment to direct embryonic stem cell differentiation. Biotechnol Prog. 25 (1), 43-51 (2009).
- Kurosawa, H. Methods for inducing embryoid body formation: in vitro differentiation system of embryonic stem cells. J Biosci Bioeng. 103 (5), 389-398 (2007).
- Itskovitz-Eldor, J., et al. Differentiation of human embryonic stem cells into embryoid bodies compromising the three embryonic germ layers. Mol Med. 6 (2), 88-95 (2000).
- Ng, E. S., et al. Forced aggregation of defined numbers of human embryonic stem cells into embryoid bodies fosters robust, reproducible hematopoietic differentiation. Blood. 106 (5), 1601-1603 (2005).
- Maminishkis, A., et al. Confluent monolayers of cultured human fetal retinal pigment epithelium exhibit morphology and physiology of native tissue. Invest Ophthalmol Vis Sci. 47 (8), 3612-3624 (2006).
- Maintenance of hESCs and hiPSCs. mTESR1 and mTESR2. , Stem Cell Technologies. Available from: http://www.stemcell.com (2010).
- The Analysis of DNA or RNA using its wavelengths: 230 nm. 260 nm. 280nm.. About Biotechnology. 230, Available from: http://archive.today/0qTh (2013).
