Summary
Das Ziel dieses Berichts ist es, die Protokolle zu beschreiben, um die retinale Pigmentepithel (RPE) von induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen) mit unterschiedlichen Größen Embryoidkörpern abzuleiten.
Introduction
Pluripotenten Stammzellen (iPS) -Zellen sind eine Art von pluripotenten Stammzellen durch Umprogrammieren erwachsenen Zellen mit extrinsische Faktoren 1 abgeleitet. Demgegenüber embryonale Stammzellen (WSR), eine andere Art von pluripotenten Stammzelle, aus der inneren Zellmasse des Blastozysten 2-3 erzeugt. Trotz ihrer unterschiedlichen Herkunft iPS-Zellen und WSR in ihrer unbegrenzte Fähigkeit, in vitro und in ihrer Fähigkeit, sich in jeden Zelltyp differenzieren 4-5 replizieren vergleichbar. Diese Eigenschaften der iPS-Zellen machen sie zu idealen Kandidaten für Anwendungen in der personalisierten regenerativen Medizin. Neueste Forschungsanstrengungen auf die Entwicklung von robusten Differenzierungsprotokolle zur Herstellung spezialisierten adulten Zellen einschließlich retinalen Pigmentepithel (RPE) 6-11 konzentriert.
Für mögliche klinische Anwendungen von iPS-abgeleiteten Zellen, ist eine gerichtete Differenzierung für den spezifischen Zelltyp wesentlich. Es gibt verschiedene Methodenzur gerichteten Differenzierung beider WSR und iPS-Zellen in RPE, die sich stark in ihrer Effizienz 6-7, 12-16 variiert veröffentlicht. Wir wissen noch nicht, viele der molekularen Ereignisse, die die Zell- / Gewebe Schicksal während der Entwicklung oder Differenzierung zu regieren. In den letzten Jahren wurden Anstrengungen unternommen, um das Protokoll, das die Differenzierung der Embryonalentwicklung so viel wie möglich nachahmen kann entwickeln. Während der Blastocysten Phase nicht gebundenen Population von Stammzellen sind zusammen in einer dreidimensionalen Mikroumgebung. So wurden verschiedene Strategien angewandt, um die ESC / iPS-Zellen zusammengebaut machen und wachsen sie in drei Dimensionen. Diese Stammzellaggregate Embryoidkörpern (EVG) genannt. Studien haben gezeigt, dass EB Differenzierung von Stammzellen zu imitieren frühen Stadium der Embryoentwicklung und können spontan entstehen primitive Endoderm auf seiner Außenfläche. Später, als EB Entwicklung fortschreitet, differenziert Zellphänotypen aller drei Keimlinien erscheinen 17-18. Therefore haben EVG basiert Differenzierungsprotokolle viel Aufmerksamkeit für die in vitro Differenzierung von ESC / iPS-Zellen angezogen und sind ein guter Kandidat für RPE-Generation von pluripotenten Stammzellen 13.
EVG kann mit verschiedenen Methoden von ESC / iPS-Zellen hergestellt werden. Zunächst wurden EBs durch Abschaben adhärenten Kolonien und ihre Beibehaltung in nicht-haftenden Suspensionskultur gemacht. Dagegen ergibt die dieser Ansatz heterogene Population von EVG, die geringe Reproduzierbarkeit führt. Hängenden Tropfen der Zellkultur und Mikrowell basierend EVG Bildung sind weitere beliebte Techniken zur EVG Formation, die homogene EVG definierter Größen, die in hohem Maße reproduzierbar sind zu erhalten. Weiterhin kann die Mikrowelltechnik Vielzahl von Aggregaten mit weniger Aufwand zu erhalten.
Differenzierung von Zellen im EVG durch einen Multiplex von morphogenen Hinweise aus der extra- und intrazellulären Mikro geregelt. Im Gegensatz zur Differenzierung in einem monolayer Format EVG bieten eine Plattform für komplexe Montage von Zellen und interzellulären Signalübertragung auftreten 17. Interessanterweise ist die Anzahl der pluripotenten Stammzellen verwendet, um einzelne EBs machen wurde beobachtet, um das Schicksal von Zellen beeinflussen. Zum Beispiel wird in einer hämatopoetischen Differenzierung Studium menschlicher WSR, wurde beobachtet, daß 500-Zellen EB gefördert Differenzierung gegen myeloider Abstammung wohin 1.000-Zell EB geschoben Richtung Erythroidlinie 20. In einer anderen Studie kleineren EBs begünstigt Endoderm Differenzierung während größere EBs Richtung Neuro Ektoderm Differentiation 11, 17 gefördert.
Diese früheren Studien legen nahe, dass die Zahl der verwendet, um einzelne EVG machen ESC / iPS-Zellen beeinflussen die EVG basierte Differenzierung zu allen Zelltypen. Jedoch nach unserer Kenntnis gibt es keine aktuellen Studien, die die Wirkung der EBs Größe in seiner Neigung aufgeklärt haben, auf RPE unterscheiden. Das Ziel dieser Studie ist es, den Einfluss der kennEB Größe für induzierte pluripotente Stammzellen (iPS-Zellen) - retinalen Pigmentepithel (iPS-RPE) Differenzierung und um die optimale Anzahl von Zellen, die EVG für gerichtete Differenzierung gegen RPE-Linie machen, zu identifizieren.
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Protocol
1. Vorbereitung der Reagenzien und Kultur Kulturplatten
- Bereiten Feeder-freien Stammzellkulturmedium durch Zugabe von 100 ml 5x serumfreien Ergänzung zu 400 ml der Stammzell Basalmedium. Das Medium ist bei 4 ° C für bis zu 2 Wochen und bei -20 ° C für 6 Monate stabil.
- In 10 uM Lösung von Rho-assoziierten, Coiled-Coil, die Proteinkinase (Rock) Inhibitor (Y-27362) zu handelsüblichen Embryoidkörper (EB) Bildung Medium.
- Bereiten Differenzierungsmedium durch Zugabe von 0,1 mM β-Mercaptoethanol, 0,1 mM nicht-essentiellen Aminosäuren, 2 mM L-Glutamin, 10% knockout Serumersatz (KSR) und 10 ug / ml Gentamycin in Dulbeccos Modified Eagle Medium / Nutrient Mixture F-12 (DMEM / F12).
- Bereiten iPS-RPE Medium durch Zugabe 1x N1 Ergänzung, 0,1 mM nicht-essentielle Aminosäuren, 250 ug / ml Taurin, 13 ng / ml triiodo-L-thyronin-Natriumsalz, 20 ng / ml Hydrocortison, 5 ug / ml Gentamicin, und 15% Fötales Rinderserum (FBS) <sup> 21 bis Minimum Essential Medium Eagle (MEM). Den pH-Wert auf 7,4.
- Bereiten Triiod-L-Thyronin Natriumsalz-Stammlösung. Lösen Sie 1 mg Triiod-L-Thyronin Natriumsalz in 1 N Natronlauge durch vorsichtiges Schwenken. Hinzufügen 49 ml MEM auf 50 ml von 20 ug / ml triiodo-L-thyronin-Natriumsalz zu machen. Bereiten Aliquots und bei -20 ° C, bis sie benötigt. Verwenden Sie geeignete Lautstärke, um die gewünschte Konzentration in Endmedium erzielen.
- Bereiten Sie Hydrocortison-Stammlösung. Solubilisieren 1 mg Hydrocortison in 1 ml 100% Ethanol leicht gerührt. Fügen Sie 19 ml MEM auf 20 ml 50 ug / ml Hydrocortison-Stammlösung zu machen. Aliquotieren und bei -20 ° C, bis es benötigt. Verwenden Sie geeignete Lautstärke, um die gewünschte Konzentration in der fertigen Kulturmedium zu erreichen.
- Vorbereiten einer Arbeitslösung Dispase von 1 mg / ml in DMEM / F12.
- Herstellung der Matrix beschichteten Platten
- Bereiten Proteinmatrix von Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) extrahiert mouse Sarkomzellen in DMEM / F12 bis 0,08 mg / ml. Coat jede Vertiefung einer Platte mit 6 Vertiefungen mit 1 ml der Matrixlösung. Inkubieren der beschichteten Platten bei Raumtemperatur für 1 Std.
- Nach 1 h Inkubation aspirieren die überschüssige DMEM / F12. 0,5 ml von Feeder-freien Stammzellkulturmedium, um das Trocknen der Vertiefungen zu verhindern. Die Matrix beschichteten Platten sind gebrauchsfertig.
- Bereiten Mikrotiterplatten durch Spülen jedes Well mit 2 ml DMEM / F12. Entfernen DMEM / F12, und fügen Sie 0,5 ml EB Bildung Medium mit Rock-Inhibitor in jede Vertiefung ergänzt. Zentrifugieren Sie die Platte bei 2.000 xg für 5 min, um Luftblasen zu entfernen.
- Bereiten FACS Färbepuffer durch Vermischen von 2% FBS und 0,09% Natriumazid in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS). Stellen Sie den Puffer auf pH 7,4.
- Bereiten Trypsin Neutralisierungslösung durch Zugabe von 10% FBS zu DMEM / F12.
2. iPS Kultur
- Vor der iPS-Zellaussaat, warm Einzug freie Spindelzellkulturmedium auf 37 ° C, und die matrix beschichteten Platten bereit.
- Tauen schnell die IMR90-1 iPS-Zellen in einem 37 ° C Wasserbad. Entfernen Sie dann die Kryo-Röhrchen aus dem Wasserbad und wischen Sie das Fläschchen mit 70% Ethanol. Übertragen der Zellen in ein 15 ml konisches Röhrchen mit einer 2 ml-Pipette zum Brechen von Zellklumpen zu minimieren.
- 5 ml warmem Feeder-freien Stammzellkulturmedium zu den Zellen tropfenweise und vorsichtig mischen. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 xg für 5 Minuten bei Raumtemperatur und Überstand.
- Die Zellklumpen vorsichtig resuspendieren in 2 ml von Feeder-freien Stammzellkulturmedium und das Seeding von Zellklumpen in die Vertiefungen matrixbeschichteten Platte. Legen Sie die Platte in eine 37 ° C-Inkubator mit 5% CO 2, 95% Luftfeuchtigkeit.
- Ändern Sie den iPS-Zellkulturmedium täglich. Beachten undifferenzierte Kolonien fünf bis sieben Tage nach der Aussaat. Prüfen Sie, ob undifferenzierte Kolonien, die bereit sind für den Durchgang (Kolonien mit einem dichten Zentrum) unter einem Lichtmikroskop sind.
3. Passagieren von iPS-Zellen
- Vor Beginn um den Durchgang der iPS-Zellen, warm das Dispase-Lösung, DMEM / F12 und Feeder-freien Stammzellkulturmedium auf 37 ° C im Wasserbad.
- Vor der Passage iPS-Zellen, entfernen Sie alle Bereiche der Differenzierung durch Abschaben der Gegend und Absaugen des Mediums. Die iPS-Zellen vorsichtig spülen Sie mit 2 ml DMEM / F12.
- 1 ml von 1 mg / ml Dispase in jede Vertiefung und Inkubieren bei 37 ° C für 7 min. Saugen Sie das Dispase und sanft spülen Sie die Zellkolonien mit 2 ml DMEM / F12 zweimal. Nach dem Spülen, 2 ml Feeder freie Spindelzellkulturmedium in jede Vertiefung.
- Mit einem 5 ml-Pipette sanft kratzen die Kolonien von der Platte, um Zellklumpen zu bilden. Übertragen Sie die freistehende Zellklumpen zu einem 15 ml konischen Röhrchen. Ausreichend Einzug freie Spindelzellkulturmedium, um den nächsten Durchgang von Zellen Saatgut.
4. Erzeugung von EVG Mit Mikrotiterplatten
- Herstellung einer Einzelzellsuspension von iPS
- Entfernen Sie die medium von den iPS-Zellen und spülen Sie die iPS-Zellen mit 2 ml DMEM / F12. Fügen Sie 750 ul von Accutase zu iPS-Zellen in jedem Well der 6-Well-Platte. Inkubieren der Zellen bei 37 ° C und 5% CO 2, um damit die Zellen von der Platte (ca. 5-10 min) löst.
- Verwende eine Pipette, um sanft dissoziieren jegliche verbleibenden Zellen und um jegliche verbleibenden Zellen auf der Plattenoberfläche zu lösen. Übertragen der Zellen in ein 50 ml konischen Röhrchen. Spülen der Platte mit 5 ml DMEM / F12 und verbinden das gespült DMEM / F12 mit den Zellen in dem konischen Rohr. Übergeben Sie die Zellsuspension durch ein 40 um Zellsieb um mögliche Restzellklumpen zu entfernen.
- Zentrifugiere die Zellen bei 300 g für 5 min bei RT, die Accutase entfernen. Zellpellet in EB Bildung Medium, so daß die Zellkonzentration etwa 0,5-1,0 x 10 7 Zellen / ml.
- Bestimmung der Anzahl der lebensfähigen Zellen durch Zählen der Zellen mit Trypan-Blau und einem Hämocytometer.
- Einrig Zelldichte in Mikrogröße gesteuerte EVGs zu bilden
- Stellen Sie die Anzahl der Zellen in jede Vertiefung der Mikrotiterplatte, um die gewünschten EB Größen erzeugen. In Zellen, um die Vertiefungen der in Schritt 1.9 vorbereitet Platten, Verteilen Sie die Zellen durch vorsichtiges Pipettieren Sie die Zellen mehrmals.
HINWEIS: Anzahl der Zellen pro Vertiefung required = gewünschte Anzahl von Zellen pro EB x Anzahl der Vertiefungen pro Vertiefung. - Stellen Sie die EB Bildung Medium mit Fels Inhibitor zu einem Endvolumen von 2,0 ml, ergänzt in den Vertiefungen. Verteilen Sie die Zellen durch vorsichtiges Pipettieren jede Vertiefung. Zentrifugieren Sie die Mikrotiterplatten bei 100 × g für 3 min. Legen Sie die Platten in einem Inkubator bei 37 ° C mit 5% CO 2 und 95% Feuchtigkeit für 24 Stunden.
- Stellen Sie die Anzahl der Zellen in jede Vertiefung der Mikrotiterplatte, um die gewünschten EB Größen erzeugen. In Zellen, um die Vertiefungen der in Schritt 1.9 vorbereitet Platten, Verteilen Sie die Zellen durch vorsichtiges Pipettieren Sie die Zellen mehrmals.
- Ernten EBs aus den Mikrotiterplatten
- Ernte-EVG von Vertiefungen pipettiert Medium in der gut nach oben und unten mit einer 1 ml Mikropipette, die meisten der EVG zu entfernen. Übergeben Sie die EB Suspension durch ein umgekehrtes 40 um ZellSieb auf einem 50 ml konischen Röhrchen um einzelne Zellen zu entfernen.
- 5 mal Waschen Sie die Mikrotiterplatte mit 1 ml DMEM / F12, um alle EVG entfernen. Sammeln Sie wäscht und übergehen das invertierte Zellsieb. Drehen Sie den Zellsieb rechten Seite nach oben auf ein neues 50 ml konischen Röhrchen. Sammeln Sie die EVG durch Waschen mit EB Bildung Medium. Graf EVG, um die Ausbeute zu bestimmen.
5. Überzug EVG und Initiieren Differenzierung
- Platte der EVG auf Proteinmatrix beschichtet sechs Well-Platten (wie in Schritt 1.8.1) mit einer Dichte von <1,000 EVG / Vertiefung in EB Bildung Medium plus 10 uM Felsen Inhibitor. EBS Bei 37 ° C mit 5% CO 2 und 95% Luftfeuchtigkeit für 24 Stunden.
- 24 h nach der EB-Beschichtung, ersetzen mit Differenzierungsmedium zur Differenzierung zu initiieren. Ändern Hälfte des Differenzierungsmedium alle zwei Tage, bis die Zellen werden für die weitere Analyse gesammelt.
- Proben werden an Tag 6, 17, 29 und 60 bis RT-PCR durchzuführen, immunocytochemistry und FACS, die Expression von charakteristischen RPE Gene und Proteine zu validieren.
6. RNA-Extraktion und PCR
- Extrahieren von RNA aus den EB Proben entsprechend den Anweisungen in dem im Handel erhältlichen Kit bereitgestellt. RNA-Konzentration zu bestimmen, unter Verwendung eines Spektrophotometers.
- Führen Sie die reverse Transkription auf 100 ng Gesamt-RNA nach handelsüblichen RNA in cDNA umgekehrter Transkript Kit.
- Führen PCR mit 10 ng der cDNA unter Verwendung der folgenden Primer (Tabelle 1) bei einer Konzentration von 10 umol / 10 ng cDNA. Stellen Sie die PCR wie folgt: Denaturierung DNA bei 95 ° C für 5 Minuten, zu amplifizieren mit 35 Zyklen bei 95 ° C für 15 sec, 60 ° C für 30 sec, 72 ° C für 1 min, gefolgt von einem abschließenden Zyklus bei 72 & deg; C für 10 min. Führen des PCR-Produkts auf einem 1% Agarose-Gel.
7. Immunocytochemistry
- Zweimal bei RT Waschen Sie die EVG mit PBS. Befestigen Sie die EVG bei RT in 4% paraformaldehyde für 10 min. Einmal mit PBS spülen bei RT. Lagerung von Proben in PBS bei 4 ° C bis zur Färbung verwendet.
- Auf Färbung Tag behandeln die fixierten Zellen mit Fixierung und Permeabilisierung Reagenzien. Die Proben mit Blockierungslösung (10% Ziegenserum in Permeabilisierung Lösung) für 1 Stunde bei RT inkubiert.
- Führen Immun in 10% Ziegenserum in Permeabilisierung Lösung mit den folgenden primären Antikörpern bei den angegebenen Verdünnungen: anti-Pax6 (1:10), anti-RX (1: 200), anti-MITF (1:30) und anti- NV1 (1: 100). Proben inkubieren mit entsprechenden Antikörpern O / N bei 4 ° C.
- Am nächsten Tag, nehmen Sie den primären Antikörper aus den Zellen und dreimal spülen Sie die Proben mit PBS. Proben mit Fluorophor-konjugierten sekundären Antikörper, Inkubation für 1 h bei RT.
- Entfernen Sie die sekundäre Antikörper aus den Zellen und dreimal spülen Sie die Proben in PBS. Montieren Sie die Deckgläser auf Glasobjektträger mit DAPI, die Einschlussmittel und erlauben Proben O / N in einem dunklen Raum eingestellt.Verwenden Sie ein Fluoreszenzmikroskop, um die Färbung zu visualisieren.
8. Die Färbung für die FACS-Analyse
- Zweimal waschen kultiviert EVG in PBS. Die EVG mit 0,5 ml 0,25% Trypsin inkubieren 5-10 Minuten, um eine Einzelzellsuspension zu machen. Neutralisieren des Trypsins mit Trypsin Neutralisierungslösung (1 ml / Vertiefung).
- Übertragen der Einzelzellsuspension in ein 15 ml konisches Röhrchen und zentrifugiert bei 600 g für 10 min.
- Überstand verwerfen und 10 ml DMEM / F12, um die Zellen in der Röhre. Vorsichtig umdrehen, um die Zellen zu mischen. Zentrifuge bei 600 x g. Nach dem Zentrifugieren den Überstand verwerfen und die Zellen resuspendieren in FACS Färbepuffer.
- Zählen der Gesamtzahl der Zellen. Zentrifuge bei 600 × g für 10 min. Nach Zentrifugation Ablagestand. Fixieren die Zellen unmittelbar durch Zugabe von 0,5 ml 4% Paraformaldehyd. Gut mischen durch vorsichtiges Vortexen. Inkubieren der Zellen bei 4 ° C für 20 min.
- Zentrifugieren bei 600 · g für 10 Minuten und entfernen Sie dieÜberstand. Vortex vorsichtig, um das Zellpellet zu stören. Permeabilisierung der Zellen durch Zugabe von 1 ml gekühltem Permeabilisierung Lösung. Vortex vorsichtig mischen und Inkubation auf Eis für 30 min.
- Zentrifugieren bei 600 · g für 10 Minuten, und entfernen Sie den Überstand. 3 ml FACS Färbepuffer und resuspendieren. Wiederholen Sie diesen Schritt noch einmal. Die Zellen in FACS-Färbepuffer bei einer Endkonzentration von 5 x 10 6 Zellen / ml.
- Dann 100 ul der Zellsuspension (0,5 x 10 6 Zellen) in jedes Mikroröhrchen und fügen die empfohlene Volumen des primären Antikörpers. Für Pax6 werden 5 ul PE anti-Pax6 in 100 & mgr; l Zellsuspension. Für MITF werden 5 ul Anti MITF in 100 & mgr; l Zellsuspension.
- Mischen und Inkubation bei Raumtemperatur für 60 min. 3 ml FACS Färbepuffer. Mischen Sie und Zentrifuge bei 600 g für 10 min. Überstand verwerfen und wiederholen 8,16 für zwei weitere Male.
- Für MITF Färbung, Inkubation der Zellen in sekundären Antibody, Ziegen-Anti-Maus-Alexa Fluor 488 bei einer Verdünnung von 1: 2000 für 1 Stunde bei 4 ° C. Für Pax6 Färbung, vermeiden Sie diesen Schritt.
- Die Zellen werden mit 5 ml FACS-Färbung Puffer und Zentrifugieren bei 600 × g für 10 min. Wiederholen Sie den Vorgang für zwei weitere Male.
- Die Zellen in 500 ul FACS Färbepuffer und vortexen, um die Zellpellets zu stören. Die Proben sind bereit für die Durchflusszytometrie.
9. iPS-RPE Isolierung und Kultur
- Am Tag 29, vorsichtig um die ausgewählten pigmentierte Kolonien von der Kulturplatte unter Verwendung eines 200 & mgr; l-Pipettenspitze geschnitten. Übertragen Sie die schwimmenden Kolonien zu einem 15 ml konischen Röhrchen. Zentrifugieren Sie die Kolonien bei 600 g für 10 Minuten bei Raumtemperatur und Überstand.
- Resuspendieren der Zellkolonien in 10 ml DMEM / F12 und zentrifugiert bei 600 g für 10 min. Entfernen Sie den Überstand.
- Vorbereiten einer Einzelzellsuspension durch Inkubation der Kolonien mit 2 ml 0,25% Trypsin bei 37 ° C für 7-10 min. Vortexen Sie vorsichtig die Zellsuspension, die Kolonien zu distanzieren.
- Neutralisieren des Trypsins durch Zugabe von 2 ml von iPS-RPE Medium. Zentrifugieren bei 600 · g für 10 min und den Überstand verwerfen. Resuspendieren der einzelnen Zellen in 2 ml von iPS-RPE Medium. Übertragen der Zellen in einer Proteinmatrix beschichtet 6-Well-Platte und in einen Inkubator bei 37 ° C, 5% CO 2 und 95% Luftfeuchtigkeit.
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Representative Results
In diesem Experiment wurden iPS-Zellen kultiviert und differenziert in die RPE-Linie von EVG. EVG kontrollierter Größen wurden mit Mikrowell-Platten gebildet. Wie in Abbildung 1 EB Bildung gesehen homogen war in den Mikrotiterplatten. Diese EBs wurden dann gesammelt und auf Platten mit 6 Vertiefungen ausplattiert (Abbildung 2).
RPE können durch ihre klassischen hexagonaler Morphologie, Pigmentierung und Expression von RPE-Marker identifiziert werden. Nach 12 Wochen der Kultur, war die 200-Zellen EVG Astrozyten und Fibroblasten-Morphologie entwickelt. Kein Pigmentierung in diesen Zellen (3A) beobachtet. Größere EBs entwickelt eine Monoschicht von klassischen RPE Morphologie und Pigmentierung (3B und C) Immunocytochemistry RPE Marker erkennen, MITF und NV1 ergab die Co-Expression dieser Proteine, die aus 500-Zellen und 3000-Zellen EBs abgeleitet worden war (Figur 4) .
Expressions Augenfeld und RPE-Gene wurden durch PCR überprüft. Abbildung 5 zeigt das Genexpressionsprofil neuroektodermalen, Blickfeld Vorläufer und RPE Marker in verschiedenen Größen von EVG. Wichtig ist, dass die spezifische RPE Marker, RPE65 erkannt beginnend an Tag 17.
Um die Ausbeute von Zellen, die in RPE-Linie differenziert hatten zu quantifizieren, wurde eine FACS-Analyse durchgeführt, um die neuroektodermalen und RPE Vorläufermarker PAX6 und MITF jeweils detektieren. 6A zeigt neuroektodermalen Marker PAX6 in verschiedenen Größen von EBs zu unterschiedlichen Zeitpunkten. Etwa 50% der untersuchten Zellen waren positiv für Pax6 an Tag 6 der Kultur in der 3000-Zellen-EVG. Zusätzlich FACS-Analyse von RPE-Marker, MITF auf vielfältige EB Größen ergeben, dass 20% der Zellen exprimiert MITF vom Tag 60 der Differenzierung.
Kultivierte RPE sich auch durch ihre Fähigkeit, ihr Pigment und polygonale Morphologie zu verlieren und zu erhalten, dadurch gekennzeichnet, aFibroblasten-Phänotyp bei Passagieren. Deshalb, um festzustellen, ob die iPS abgeleitet RPE besitzen diese Eigenschaften, die wir mechanisch isoliert und die Zellen passagiert. 7A zeigt die neu agiert Zellen Pigment verloren und gewonnen Fibroblasten-Morphologie. Zusätzlich proliferierten die Zellen und wieder den klassischen polygonale Morphologie bei Konfluenz (7B). Innerhalb von wenigen Wochen, gewann diese Zellen ihre Pigmentierung (7C).
| Gen | NICB Referenz | Sequenz (5'-3 ') | Größe (bp) | |
| Pax6 | NM_001258465.1 | F | CGGAGTGAATCAGCT CGGTG | 300 |
| R | ||||
| RPE65 | NM_000329.2 | F | GCCCTCCTGCACAAG TTTGACTTT | 259 |
| R | AGTTGGTCTCTGTGC AAGCGTAGT | |||
| RX | NM_013435.2 | F | GAATCTCGAAATCTC AGCCC | 279 |
| R | CTTCACTAARRRGCT CAGGAC | |||
| MITF | NM_198178.2 | F | TTCACGAGCGTCCTG TATGCAGAT | 106 |
| R | TTGCAAAGCAGGATC CATCAAGCC | |||
| GAPDH | NM_001256799.1 | F | ACCACAGTCCATGCC ATCAC | 452 |
| R | TCCACCACCCTGTTG CTGTA |
Tabelle 1. PCR-Primer-Sequenzen für Pax6, RPE65, RX, MITF und GAPDH-Gene.
Abbildung 1. Bildung von EBs mit Mikrotiterplatten. Jede Mikrovertiefung enthält (A) 100-Zellen (B) 200-Zellen (C) 500 Zellen, und (D) 3000 Zellen. Die Zellen wurden 24 h bei 37 ºC und 5% CO 2 für die Bildung von EBs inkubiert. (Vergrößerung 100X, Maßstab = 400 & mgr; m). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
Abbildung 2. EBs aus Mikrotiterplatten geerntet. (A) 200-Zellen EB, (B) 500-Zelle EB, (C) 3,000 Zellen EB, und (D) 15.000 Zellen EB. (Vergrößerung 200X, Maßstab = 200 & mgr; m). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
Abbildung 3. iPS-derived aus verschiedenen Größen von EVG. EBs RPE wurden 12 Wochen lang kultiviert. (A) 200-Zellen EVG erst entwickelt Astrozyten und Fibroblasten-Morphologie ohne Pigmentierung; während 80% - 90% der Zellen in der 500-Zell EBs (B und C) entwickelte eine Monoschicht von polygonalen pigmentierten Zellen. (A & B: Vergrößerung 100X, Maßstab= 400 um; (C):. Vergrößerung 200X, Maßstab = 200 um) Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
Abbildung 4. Die Co-Expression von MITF und ZO1. 500- und 3.000-Zell EVG ausgedrückt MITF und ZO1 nach 17 Tagen der Differenzierung. (Vergrößerung 400X, Balken = 20 um). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
Abbildung 5. Genexpressionsprofil der unterschiedlichen Größen der EVG zu verschiedenen Zeitpunkten der Differenzierung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
Abbildung 6. FACS-Analyse von verschiedenen EB Größe für RPE Differenzierung. (A) FACS-Daten neuroektodermalen Marker PAX6 in verschiedenen Größen von EVG während der Differenzierung. (B) FACS-Analyse von RPE Marker MITF auf vielfältige EB Größen am Tag 60 der Differenzierung. Die höchste Ebene der MITF erreichte 20%, und betrug zwischen EB Größe von 500, 3.000 und 15.000 Zellen konstant.
Abbildung 7. Fortsetzung Kultur der Hand isoliert RPE. (A) RPE subkultiviert wurde und Fibroblasten morpholo erworbengy nach dem Durchgang. (B & C) Zellen entwickelt polygonale Morphologie und Pigmentierung im Laufe der Zeit. (Vergrößerung 100X, Maßstab = 400 & mgr; m). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
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Discussion
Um die volle Versprechen der pluripotenten Stammzellen für die Zelltherapie zu realisieren, ist es notwendig, ihre Differenzierung konsistent und reproduzierbar zu regeln. Dieser Bericht beschreibt Protokolle Größe gesteuerte EVGs mit Mikrotiterplatte Technologie bilden, initiieren die Differenzierung in Richtung RPE und identifizieren Protein und Gen-Marker der RPE. Um die in vitro Differenzierung synchronisiert wurden homogene Größen EVG durch eine bekannte Anzahl von iPS-Zellen in Mikrotiterplatten durch Zwangs Aggregation zentrifugiert gebildet. Immuncytochemie und Reverse-Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) verwendet werden, um die Ausdrücke RPE Proteine und Gene erläutert zu überwachen. Schließlich wurde die Effizienz der Differenzierung in verschiedene Größen von EBs durch FACS-Analyse analysiert. Diese Techniken können die Differenzierung von iPS-Zellen in RPE für zukünftige Anwendungen zu erleichtern.
Es gibt einige wichtige Punkte in diesem Verfahren, die sorgfältig ausgeführt wird, muss eine E werdenNsure den Erfolg dieses Protokoll und die Erreichung der genaue Daten. Der erste entscheidende Schritt erfolgt während der iPS-Zellkultur. iPS-Zellen müssen in einem pluripotenten Zustand gehalten werden, um ihre stemness halten. Die Zellen müssen das Medium täglich, um ein angemessenes Maß an bFGF zu erhalten und sorgfältig täglich auf Anzeichen der Differenzierung untersucht werden geändert. Undifferenzierte iPS-Zellen wachsen als kompakte vielzellige Kolonien. Die Zellen sollten eine hohe Kern zu Zytoplasma-Verhältnis und prominenten Nukleolen. Die iPS Kolonien werden durch eine deutliche Grenze ist, mit mehreren Schichten von Zellen in der Mitte. Anzeichen der Differenzierung umfassen Verlust definiert Koloniegrenzen ungleichmäßige Zellmorphologie und das Aussehen der offensichtlichen Zelltypen, wie Neuronen und Fibroblasten. Einzelne Zellen, die differenziert sind, können durch Dispase und Spülen entfernt werden, jedoch Kolonien mit diesen Eigenschaften müssen manuell von der Kultur 22 entfernt werden. Vorbereitung eines einzelnen iPS-Zellsuspension for Bildung der EVG ist der nächste wichtige Schritt. Es ist wichtig, eine Suspension ohne Zellaggregate, um die gewünschte Anzahl von Zellen genau zu liefern, um die Mikrotiterplatte und bereiten Sie die gewünschte Größe EB vorzubereiten. RNA-Präparationen für die PCR-Analyse sind ebenfalls wichtig. Inkonsistenten Qualität der RNA ist eine wesentliche Quelle der Variabilität in der PCR-Daten. RNA-Extraktion sollte minimal abgebaut RNA für die besten Ergebnisse zu erzielen. Erfolgreiche RNA-Extraktion wird Gesamt-RNA mit minimaler Verschlechterung und frei von verunreinigenden RNasen ergeben. Nach Bestimmung der RNA-Konzentration durch Spektrophotometrie bei 260 nm, sollte die Reinheit der Probe bei 230 und 280 nm bestimmt, um eine Kontamination mit Polysacchariden oder Protein nachzuweisen. Der 230: 260: 2: 1, um qualitativ hochwertige RNA ohne Kontamination 23 zeigen Verhältnis 280 für RNA sollte 1. Schließlich ist es wichtig, die Zellen für die FACS-Färbung ausreichend fixieren. Während dieser Fixierungsschritt müssen die Zellen voneinander getrennt werden, um ein Verklumpen zu verhindern. Insufficabler Zelle Resuspension vor Permeabilisierung wird Zellverklumpung und ungenau Färbung führen.
Es empfiehlt sich, das Protokoll, wie beschrieben, aber ein paar Änderungen kann bei Bedarf gestellt werden folgen. Während die Erzeugung von EBs in Schritt 4 beschrieben, kann die Anzahl der Zellen pro EB zwischen 500 bis 3000 liegen, um eine hohe Ausbeute an Zellen in RPE differenziert erzielen. Wenn die Anzahl der iPS-Zellen begrenzt ist, werden 500-Zellen-EVG RPE vergleichbar mit den 3000-Zell EVG zu produzieren. Besondere Sorgfalt muss bei der in Schritt beschriebenen RNA-Extraktionsverfahren 6. Die Proben sollten in dreifacher Ausführung durchgeführt, um sicherzustellen, dass qualitativ hochwertige RNA erfasst werden wird, haben muss. Während Immunzytochemie wie in Schritt 7 beschrieben, können die primären und sekundären Antikörperkonzentrationen gegebenenfalls angepasst werden, um die Signalstärke zu verbessern und Hintergrund. Die entsprechenden positiven und negativen Kontrollen sollten im Assay einbezogen. Während der Schritt 8, FACS-Analyse, ob die erwarteten Ergebnisse nicht ACQnach Anfärbung uired kann eine kleine Probe der gefärbten Zellen auf einen Objektträger gegeben und mit einem Mikroskop betrachtet, um Fleckenbildung zu visualisieren. Die entsprechenden positiven und negativen Kontrollen sollten im Assay einbezogen. Wenn die Zellen nicht angefärbt, wie erwartet, können die Antikörper-Konzentrationen erhöht oder verringert, wie benötigt werden.
Die in diesem Bericht beschriebenen Technik wird in einer höheren Ausbeute an RPE als spontane Differenzierung führen, ohne den Einsatz von zusätzlichen Chemikalien. Jedoch ist die Haupteinschränkung dieses Ansatzes, dass es auch eine große Anzahl von nicht-RPE-Zellen erzeugt werden. Daher muß die RPE sorgfältig ausgewählt und angereichert, wie in Schritt 9 beschrieben, um eine homogene Population zu gewährleisten.
Die Bedeutung dieses Ansatzes ist, dass eine höhere Ausbeute an RPE aus iPS-Zellen als spontane Differenzierung Techniken abgeleitet werden. Die Verwendung von kleinen Molekülen auf RPE von iPS abgeleitet wurde auch berichtet, um eine hohe Ausbeute an gebendifferenzierten Zellen ist jedoch, dass die Technik viel komplexer und erfordert das Timing und die Konzentration der kleinen Moleküle optimiert werden, um die gewünschten Ergebnisse zu 7,10 erreicht werden. Darüber hinaus werden die kleinen Moleküle in diesen Verfahren verwendet werden, haben pleiotrope Effekte, die die Ergebnisse verwechseln kann.
Das beschriebene Verfahren kann verwendet werden, um EBs des gewünschten Größen mit hoher Reproduzierbarkeit herzustellen. Diese Technik erzeugt EBs einheitlicher Größe, die verwendet wurden, um die Differenzierung von iPS Richtung der RPE-Linie, ohne die Verwendung zusätzlicher Chemikalien zu optimieren. Die iPS-RPE-Zellen aus EBs ableiten kann dann in Transplantationsstudien verwendet werden, um ihre Integration in die Netzhaut in einer funktionalen Organisation zu bestätigen. Diese Zellen können auch eine gute Forschungsmodell, um die Pathogenese verschiedener Erkrankungen RPE in vitro zu untersuchen. Die Nützlichkeit dieses Ansatzes kann die gerichtete Differenzierung in vielen anderen Zelltypen angewendet werden, abhängig vondie Größe der EBs und die in vivo Ursprung der Zelle in der Blastozyste. Zellen des Ektoderms wird Anlass zu Neuronen, Epidermis, Haare und Brustdrüsenzellen; Entoderm wird Anlass zu Magen, Dickdarm, Lunge und Darm-Zellen; Mesoderm wird Anlass zu Skelettmuskel, Herz, Niere, und Bindegewebszellen 3,11,19. Sobald die korrekte EB Größe bestimmt wurde, müssen die differenzierten Zellen nur Immunzytochemie oder FACS für die korrekte Expression von Markerproteinen analysiert.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| mTeSR1 media + 5x supplement | Stem Cell Technologies | 5850 | |
| Y-27632 (Rock Inhibitor) | Stem Cell Technologies | 72304 | |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 11330-032 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M-7154 | |
| Non essential amino acids | Hyclone(Fisher) | SH30853.01 | |
| Knockout serum replacement | Life Technologies | 10828-028 | |
| Gentamicin | Life Technologies | 15750-060 | |
| L-Glutamine | Life Technologies | 25030-081 | |
| MEM media | Life Technologies | 10370-021 | |
| N1 supplement | Sigma | N-6530-5ML | |
| Taurine | Sigma | T-8691-25G | |
| Hydrocortisone | Sigma | H0888-1G | |
| Fetal bovine serum | Hyclone(Fisher) | SH3008803HI | |
| Triiodo-L-thyronine sodium salt | Sigma | T6397 | |
| Sodium hydroxide | Sigma | S5881 | |
| Dispase | Life Technologies | 17105-041 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354277 | |
| Phosphate buffered saline | Hyclone(Fisher) | 10010-023 | |
| Aggrewell 400 plate | Stem Cell Technologies | 27940 | |
| AggreWell medium | Stem Cell Technologies | 5893 | |
| Accutase | Stem Cell Technologies | 7920 | |
| BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Kit | BD Biosciences | 554714 | |
| Mouse Anti-PAX6 antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | ||
| Rabbit Anti-RX antibody | Abcam | Ab23340 | |
| Mouse Anti-MITF antibody | Thermo Scientific | MS-772-P | |
| Rabbit Anti-ZO-1 antibody | Invitrogen | 40-2200 | |
| RNeasy plus mini kit | Qiagen | 74134 | |
| PCR master mix | Promega | M7502 | |
| High capacity RNA to cDNA kit | Life Technologies | 4387406 |
References
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