Stammer Netthinne Pigment Epitel (RPE) fra Induced pluripotent Stem (IPS) Cells av forskjellige størrelser av embryoid Bodies
Summary
Målet med denne rapporten er å beskrive protokoller å utlede retinal pigment epitel (RPE) fra indusert pluripotent stilk (iPS-celler) ved hjelp av forskjellige størrelser av embryoid organer.
Abstract
Pluripotent stem cells possess the ability to proliferate indefinitely and to differentiate into almost any cell type. Additionally, the development of techniques to reprogram somatic cells into induced pluripotent stem (iPS) cells has generated interest and excitement towards the possibility of customized personal regenerative medicine. However, the efficiency of stem cell differentiation towards a desired lineage remains low. The purpose of this study is to describe a protocol to derive retinal pigment epithelium (RPE) from iPS cells (iPS-RPE) by applying a tissue engineering approach to generate homogenous populations of embryoid bodies (EBs), a common intermediate during in vitro differentiation. The protocol applies the formation of specific size of EBs using microwell plate technology. The methods for identifying protein and gene markers of RPE by immunocytochemistry and reverse-transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) are also explained. Finally, the efficiency of differentiation in different sizes of EBs monitored by fluorescence-activated cell sorting (FACS) analysis of RPE markers is described. These techniques will facilitate the differentiation of iPS cells into RPE for future applications.
Introduction
Induserte pluripotent stilk (IPS) celler er en type av pluripotent stamcelle avledet ved reprogrammering voksne celler med ytre faktorer 1. I motsetning til dette, embryonale stamceller (ESCS), en annen type av pluripotent stamcelle, blir generert fra den indre cellemasse av blastocysten 2-3. Til tross for deres forskjellige opphav, IPS-celler og ESCs er sammenlignbare i deres ubegrenset kapasitet til å replikere in vitro og i sin evne til å differensiere til en hvilken som helst celletype 4-5. Disse egenskapene til iPS-celler gjør dem ideelle kandidater for applikasjoner i personlig regenerativ medisin. Nyere forskning innsats er fokusert på å utvikle robuste differensiering protokoller for å produsere spesialiserte voksne celler inkludert retinal pigment epitel (RPE) 6-11.
For potensielle kliniske anvendelser av iPS avledet celler, er essensielt en rettet differensiering for den spesifikke celletype. Det finnes ulike fremgangsmåterpublisert for rettet differensiering av både ESCs og iPS-celler i RPE som varierer mye i deres effektivitet 6-7, 12-16. Vi vet fortsatt ikke mange av de molekylære hendelser som styrer celle / vev skjebne under utvikling eller differensiering. I de senere årene har det vært gjort for å utvikle differensiering protokoll som kan etterligne den embryologiske utviklingen så mye som mulig. Under blastocyst fase-iverk populasjon av stamceller er sammen i et tredimensjonalt mikromiljøet. Så ble forskjellige strategier anvendes for å gjøre de ESC / IPS-celler montert sammen og dyrke dem i tre dimensjoner. Disse stamcelle aggregater kalles embryoid organer (EBS). Studier har vist at EB differensiering av stamceller ligne tidlig stadium av embryo- utvikling og kan spontant gi opphav til primitive endoderm på sin ytre overflate. Senere, som EB utvikling utvikler seg, differensierte celle fenotyper av alle tre bakterie linjene vises 17-18. Therefore, har EBS basert differensiering protokoller tiltrakk seg mye oppmerksomhet for in vitro differensiering av ESC / iPS-celler og er en god kandidat for RPE generasjon fra pluripotente stamceller 13.
EBS kan gjøres ved hjelp av flere metoder fra ESC / iPS-celler. Utgangspunktet, EBS ble gjort ved å skrape av heft kolonier og opprettholde dem i ikke-tilhenger suspensjon kultur. Imidlertid gir denne tilnærmingen heterogen befolkning på EBS som forårsaker lav reproduserbarhet. Hengende dråpe cellekultur og mikro basert EBS formasjon er andre populære teknikker for EBS formasjon som gir homogene EBS av definerte størrelser som er reproduserbar. Videre kan mikro teknikken gir stort antall aggregater med mindre anstrengelse.
Differensiering av celler i EBS er regulert av en multipleks av morphogenic signaler fra den ekstracellulære og intracellulære mikromiljøet. I motsetning til differensiering i en Manolayer format, EBS gi en plattform for kompleks sammensetning av celler og intersignale å skje 17. Interessant nok var antallet pluripotente stamceller som brukes til å lage enkelt EBS observert å påvirke skjebnen til cellene. For eksempel, i et hematopoetisk differensiering undersøkelse av menneskelige ESCs, ble det observert at 500-celle EB fremmet differensiering mot myeloide cellelinjen, mens 1000-celle EB skjøvet mot erytroid herkomst 20. I en annen studie, mindre EBS favoriserte endoderm differensiering mens større EBS fremmet mot neuro-ektoderm differensiering 11, 17.
Disse siste studiene tyder på at antall ESC / iPS-celler som brukes til å lage individuelle EBS påvirke EBS basert differensiering til eventuelle celletyper. Men til vår kunnskap, finnes det ingen aktuelle studier som har belyst virkningen av EBS størrelse i sin tilbøyelighet til å skille mot RPE. Målet med denne studien er å karakterisere påvirkning avEB størrelse på indusert pluripotent stilk (iPS-celler) – retinal pigment epitel (iPS-RPE) differensiering og å identifisere den optimale celle nummer for å gjøre EBS for rettet differensiering mot RPE avstamning.
Protocol
Representative Results
Discussion
For å realisere den fulle løftet av pluripotente stamceller for celleterapi, er det nødvendig å regulere deres differensiering på en konsekvent og reproduserbar måte. Denne rapporten beskriver protokoller for å danne size-kontrollerte EBS bruker mikro plate-teknologi, starter differensiering mot RPE og identifisere protein og genmarkører av RPE. Å synkronisere in vitro differensiering, ble homogene størrelser av EBS dannet av kjente antall iPS-celler sentrifugert i mikroplater med tvungen aggregering….
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The opinions or assertions contained herein are the private views of the authors and are not to be construed as official or as reflecting the views of the Department of the Army or the Department of Defense. This research was performed while the authors Alberto Muñiz, Ramesh R Kaini, Whitney A Greene and Jae-Hyek Choi held a National Research Council Postdoctoral Research Associateship at the USAISR. This work was supported by U.S. Army Clinical Rehabilitative Medicine Research Program (CRMRP) and Military Operational Medicine Research Program (MOMRP).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| mTeSR1 media + 5X supplement | Stem Cell Technologies | 5850 | |
| Y-27632 (Rock Inhibitor) | Stem Cell Technologies | 72304 | |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 11330-032 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M-7154 | |
| Non essential amino acids | Hyclone(Fisher) | SH30853.01 | |
| Knockout serum replacement | Life Technologies | 10828-028 | |
| Gentamicin | Life Technologies | 15750-060 | |
| L-Glutamine | Life Technologies | 25030-081 | |
| MEM media | Life Technologies | 10370-021 | |
| N1 supplement | Sigma | N-6530-5ML | |
| Taurine | Sigma | T-8691-25G | |
| Hydrocortisone | Sigma | H0888-1G | |
| Fetal bovine serum | Hyclone(Fisher) | SH3008803HI | |
| Triiodo-l-thyronine sodium salt | Sigma | T6397 | |
| Sodium hydroxide | Sigma | S5881 | |
| Dispase | Life Technologies | 17105-041 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354277 | |
| Phosphate buffered saline | Hyclone(Fisher) | 10010-023 | |
| Aggrewell 400 plate | Stem Cell Technologies | 27940 | |
| AggreWell medium | Stem Cell Technologies | 5893 | |
| Accutase | Stem Cell Technologies | 7920 | |
| BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Kit | BD Biosciences | 554714 | |
| Mouse Anti-PAX6 antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | ||
| Rabbit Anti- RX antibody | Abcam | Ab23340 | |
| Mouse Anti-MITF antibody | Thermo Scientific | MS-772-P | |
| Rabbit Anti-ZO-1 antibody | Invitrogen | 40-2200 | |
| RNeasy plus mini kit | Qiagen | 74134 | |
| PCR master mix | promega | M7502 | |
| High capacity RNA to c DNA kit | Life Technologies | 4387406 | |
References
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from fibroblast cultures. Nat Protoc. 2 (12), 3081-3089 (2007).
- Reubinoff, B. E., et al. Embryonic stem cell lines from human blastocysts: somatic differentiation in vitro. Nat Biotechnol. 18 (4), 399-404 (2000).
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318 (5858), 1917-1920 (2007).
- Buchholz, D. E., et al. Derivation of functional retinal pigmented epithelium from induced pluripotent stem cells. Stem Cells. 27 (10), 2427-2434 (2009).
- Ukrohne, T. U., et al. Generation of retinal pigment epithelial cells from small molecules and OCT4 reprogrammed human induced pluripotent stem cells. Stem Cells Transl Med. 1 (2), 96-109 (2012).
- Subba, R. M., Sasikala, M., Nageshwar, R. D. Thinking outside the liver: induced pluripotent stem cells for hepatic applications. World J Gastroenterol. 19 (22), 3385-3396 (2013).
- Yoshida, Y., Yamanaka, S. iPS cells: a source of cardiac regeneration. J Mol Cell Cardiol. 50 (2), 327-332 (2011).
- Mak, S. K., et al. Small molecules greatly improve conversion of human-induced pluripotent stem cells to the neuronal lineage. Stem Cells Int. 2012, 140427 (2012).
- Bauwens, C. L., et al. Control of human embryonic stem cell colony and aggregate size heterogeneity influences differentiation trajectories. Stem Cells. 26 (9), 2300-2310 (2008).
- Cour la, M., Tezel, T. The Retinal Pigment Epithelium. Advances in Organ Biology. 10, 253-273 (2006).
- Vaajassari, V., et al. Toward the defined and xeno-free differentiation of functional human pluripotent stem cell-derived retinal pigment epithelial cells. Mol Vis. 17, 558-575 (2011).
- Carr, A. J., et al. Protective effects of human iPS-derived retinal pigment epithelium cell transplantation in the retinal dystrophic rat. PLoS One. 4 (12), e8152 (2009).
- Muniz, A., et al. Retinoid uptake, processing, and secretion in human iPS-RPE support the visual cycle. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (1), 198-209 (2014).
- Meyer, J. S., et al. Modeling early retinal development with human embryonic and induced pluripotent stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (39), 16698-16703 (2009).
- Bratt-Leal, A. M., Carpenedo, R. L., McDevitt, T. C. Engineering the embryoid body microenvironment to direct embryonic stem cell differentiation. Biotechnol Prog. 25 (1), 43-51 (2009).
- Kurosawa, H. Methods for inducing embryoid body formation: in vitro differentiation system of embryonic stem cells. J Biosci Bioeng. 103 (5), 389-398 (2007).
- Itskovitz-Eldor, J., et al. Differentiation of human embryonic stem cells into embryoid bodies compromising the three embryonic germ layers. Mol Med. 6 (2), 88-95 (2000).
- Ng, E. S., et al. Forced aggregation of defined numbers of human embryonic stem cells into embryoid bodies fosters robust, reproducible hematopoietic differentiation. Blood. 106 (5), 1601-1603 (2005).
- Maminishkis, A., et al. Confluent monolayers of cultured human fetal retinal pigment epithelium exhibit morphology and physiology of native tissue. Invest Ophthalmol Vis Sci. 47 (8), 3612-3624 (2006).
