Abstract
Vescicole sinaptiche rilasciano neurotrasmettitori alla sinapsi chimiche attraverso un ciclo dinamico di fusione e di recupero. Monitoraggio attività sinaptica in tempo reale e sezionare le diverse fasi di eso-endocitosi a livello di singolo-vescicole sono fondamentali per la comprensione funzioni sinaptiche in salute e malattia.
Geneticamente codificato sonde pH-sensibili direttamente mirate a vescicole sinaptiche e Total Internal Reflection microscopia a fluorescenza (TIRFM) forniscono la risoluzione spazio-temporale necessario per seguire la dinamica delle vescicole. Il campo evanescente generato per riflessione interna totale può eccitare solo fluorofori collocati in uno strato sottile (<150 nm) sopra il coperchio di vetro su cui le cellule aderiscono, esattamente dove i processi di eso-endocitosi avvengono. Le immagini ad alto contrasto risultanti sono ideali per le vescicole monitoraggio e l'analisi quantitativa di eventi di fusione.
In questo protocollo, SH-SY5Y umano ncellule euroblastoma sono proposti come modello utile per studiare il rilascio dei neurotrasmettitori a livello singolo vescicole da TIRFM, a causa della loro superficie piana e la presenza di vescicole dispersi. Vengono forniti i metodi per la coltivazione SH-SY5Y come cellule aderenti e per loro trasfezione con Synapto-pHluorin, così come la tecnica per effettuare TIRFM e imaging. Infine, una strategia che mira a selezionare, contare e analizzare gli eventi di fusione a livello di cellule intere e single-vescicola è presentato.
Per convalidare l'approccio di analisi procedura di imaging e di dati, le dinamiche di vescicole pHluorin-tag vengono analizzati sotto il riposo e stimolati (depolarizzante concentrazioni di potassio) condizioni. Depolarizzazione della membrana aumenta la frequenza degli eventi di fusione e provoca un aumento parallelo del segnale di fluorescenza netto constatato cellula intera. Analisi singola vescicola rivela modifiche di comportamento fusion-evento (altezza maggiore di picco e larghezza). Questi dati suggeriscono tha depolarizzazione potassio induce non solo un massiccio rilascio di neurotrasmettitore, ma modifica anche il meccanismo di fusione della vescicola e riciclaggio.
Con la sonda fluorescente caso, questa tecnica può essere impiegata in sistemi cellulari diversi per sezionare i meccanismi di secrezione costitutiva e stimolata.
Introduction
Trasmissione sinaptica chimica tra neuroni è un importante meccanismo di comunicazione nel sistema nervoso. Essa si basa sul rilascio di neurotrasmettitori attraverso un ciclo dinamico di fusione della vescicola e recupero nel sito presinaptico. Molte delle proteine coinvolte nella dinamica vescicole sono stati identificati; tuttavia, il loro contributo specifico al fenomeno resta da chiarire 1.
La nostra comprensione è in parte limitata dal fatto che i dosaggi più utilizzati per eso / endocitosi non sono sempre la più appropriata. Diversi studi relativi alla fusione delle vescicole e dinamiche si basano su tecniche elettrofisiologiche. Questa tecnica fornisce una risoluzione temporale ottimale ed è eccellente per studiare la fusione iniziale delle vescicole alla membrana plasmatica, ma è in grado di rilevare molti degli eventi molecolari alla base che supportano la funzione presinaptica. La microscopia elettronica, dall'altro lato, fornisce la migliore morphologicaDescrizione l di ogni passo singolare, ma l'aspetto dinamico della manifestazione non può essere catturato, perché i campioni devono essere fissati in modo da analizzare.
L'avvento di nuove tecniche di registrazione ottica 2,3, in combinazione con i progressi nella fluorescente sviluppo sonde molecolari 4-6, consente la visualizzazione dei processi di esocitosi in cellule vive, fornendo così nuovi livelli di informazioni sulla struttura e la funzione sinaptica.
Gli studi iniziali sfruttati coloranti attività-dipendente stirilici (FM1-43 e coloranti organici relativi) 7,8. State-of-the-art tecniche di imaging utilizzano varianti pH-sensibili della proteina verde fluorescente (GFP) (pHluorin) legato alle vescicole luminali proteine 9. Queste sonde sono normalmente spenti quando presenti nelle vescicole a causa del basso pH luminale. Dopo la fusione con la membrana plasmatica, l'interno della vescicola è esposta allo spazio extracellulare neutra, il pH aumenta bruscamente, allevia la tempra protone-dipendente di pHluorin e appare rapidamente il segnale fluorescente. Come la variazione pHluorin è più veloce l'evento di fusione, monitorando aumenti fluorescenza, vescicole fusione con la membrana può essere misurato e analizzato. Poiché molecole pHluorin-tag superficie sono endocitosi, il segnale di fluorescenza successivamente ritorna al livello basale, quindi lo stesso costrutto può anche essere usato per monitorare riciclo 9 vescicole.
Mentre il pH-sensore vescicole-tagged assicura la visualizzazione solo di quelle che in realtà vescicole si fondono con la membrana plasmatica, imaging ad alta risoluzione spaziale e temporale è richiesto di descrivere in dettaglio i passi necessari nei processi endocitiche eso /. La tecnica ottico che fornisce la risoluzione spazio-temporale necessaria è riflessione interna totale microscopia a fluorescenza (TIRFM), un'applicazione di microscopia a fluorescenza 10.
"> Riflessione interna totale si verifica all'interfaccia tra il vetro di copertura antiscivolo e il campione. Quando il percorso luce raggiunge il vetro di copertura antiscivolo con un angolo di incidenza maggiore dell'angolo critico, la luce di eccitazione non è trasmesso nel campione, ma è completamente riflessa. In queste condizioni, un evanescenti forme d'onda della luce all'interfaccia e si propaga nel mezzo con meno densità ottica (campione). Come l'intensità del campo evanescente decade esponenzialmente con la distanza dall'interfaccia (con una profondità di penetrazione circa 100 nm) solo i fluorofori in vicinanza vicina alla copertura antiscivolo può essere eccitato mentre quelli più lontani dal confine no. In cellule trasfettate con GFP-costrutti, questa profondità corrisponde a proteine espresse sulla membrana plasmatica o in strutture vescicolari avvicinandosi. Come fluorofori nell'interno delle cellule non possono essere eccitati, la fluorescenza di fondo è ridotto al minimo, e l'immagine con un segnale alto / sfondo ratio si forma 11.Diverse caratteristiche rendono TIRFM la tecnica di scelta per il monitoraggio vescicole dinamica. Il contrasto perfetta e l'alto rapporto segnale-rumore rapporto permettono di rilevare segnali molto bassi derivanti dalle singole vescicole. Basato su chip di acquisizione delle immagini in ogni fotogramma fornisce la risoluzione temporale necessario per rilevare i processi altamente dinamici. Infine, l'esposizione minima di cellule a luce in qualsiasi altro aereo nel campione riduce fortemente fototossicità e consente la registrazione lungo time-lapse durata 12.
L'analisi dei dati rimane l'aspetto più impegnativo e cruciale di questa tecnica. Il modo più semplice per monitorare fusione della vescicola è quello di misurare l'accumulo di proteine reporter fluorescente sulla superficie cellulare, nel tempo 13. Con l'aumento della fusione, gli aumenti netti segnali di fluorescenza così. Tuttavia, questo metodo può sottostimare il processo, in particolare in grandi cellule ed in condizioni di riposo,perché i processi endocitosi e photobleaching compensare l'aumento di intensità di fluorescenza a causa vescicole esocitosi. Un metodo alternativo è quello di seguire ogni singolo evento di fusione 14. Quest'ultimo metodo è molto sensibile e può rivelare importanti dettagli circa i meccanismi di fusione. Tuttavia, esso richiede la selezione manuale di singoli eventi, perché procedure completamente automatizzate per seguire vescicole e di registrare la fluttuazione dei loro segnali fluorescenti non sono sempre disponibili. Osservazione delle dinamiche vescicole richiede celle di campionamento ad alta frequenza. Ciò genera una grande quantità di dati che può difficilmente essere analizzati manualmente.
La proposta di questo lavoro è quello di ottimizzare la tecnica di imaging TIRFM per monitorare il basale e rilascio di neurotrasmettitore stimolato nella linea cellulare di neuroblastoma SH-5YSY, e di descrivere, passo-passo, una procedura definita in laboratorio per analizzare i dati, sia a livelli di cellule intere e single-vescicole.
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Protocol
1. Cella Cultura e Transfection
- Coltura cellulare SH-SY5Y
NOTA: Gli esperimenti sono stati condotti con il neuroblastoma umano SH SY5Y (ATCC # CRL-2266) 15. Cellule SH-SY5Y crescono come una miscela di ammassi galleggianti e cellule aderenti. Seguire le istruzioni riportate nel protocollo (densità cellulare, rapporto di scissione, ecc.) Per avere cellule che crescono saldamente attaccati alla copertura in vetro, che è cruciale per TIRFM.- Prima di iniziare, sotto l'armadio biosicurezza flusso laminare, rendere il volume opportuno di soluzione di fosfato sterile salina tampone (PBS) e terreno di coltura.
- Effettuare 50 ml di PBS con concentrazioni di 150 mM NaCl, 24 mM tampone fosfato, pH 7,4. Filtrare la soluzione.
- Effettuare 50 ml di terreno cellulare da Modified Eagle Medium di Dulbecco (DMEM) con alto glucosio, siero inattivato al calore fetale bovino 10% (FBS), penicillina (100 U / ml), streptomicina (100 mcg / ml), L-glutammina ( 2 mM), epiruvato di sodio (1 mM). Filtrare la soluzione.
- Rimuovere mezzo di crescita completo e lavare le cellule con 3 ml di PBS.
- Incubare le cellule con 2 ml di 0,05% tripsina-acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) (per 6 piatto Petri cm) per 5 min a 37 ° C, 5% CO 2 e staccare cellule usando pipetta.
- Inattivare tripsina aggiungendo 2 ml di DMEM, e raccogliere le cellule per centrifugazione a 300 xg per 5 min.
- Rimuovere il surnatante, aggiungere 1 ml di DMEM al pellet e pipetta la soluzione su e giù sufficientemente per disperdere le cellule in una sospensione di cellule singole.
- Dividerli 1: 4 in un nuovo diametro Petri piatto 6 centimetri contenente 3 ml di terreno completo. Mantenere le cellule in coltura in 6 centimetri di diametro Petri, a 37 ° C in un incubatore CO 2 5%. Sub-coltura una volta alla settimana o quando hanno raggiungimento di 80 - 90% della superficie.
- Prima di iniziare, sotto l'armadio biosicurezza flusso laminare, rendere il volume opportuno di soluzione di fosfato sterile salina tampone (PBS) e terreno di coltura.
- Placcatura cellule SH-SY5Y per l'imaging
- Per gli esperimenti TIRFM, piastracellule su coperture in vetro. Impiegare vetro copre con 0,17 ± 0,005 millimetri di spessore e un indice di rifrazione 1,5255 ± 0,00015. Prima di iniziare, preparare i vetrini come segue:
- Vetro Pulire copre con il 90% di etanolo, O / N.
- Risciacquare accuratamente in acqua distillata (tre porzioni di acqua distillata). Vetro copre secco in forno.
- Luogo copre in vetro di Petri e sterilizzare in forno preriscaldato a 200 ° C per 3 ore.
- Il giorno prima transfezione, posizionare ogni coprioggetto in una capsula di Petri 3,5 centimetri, aggiungere 1 ml di terreno di coltura e incubare a 37 ° C in un incubatore CO 2 5%.
- Trypsinize cellule come descritto ai punti 1.1.3 - 1.1.5, sospendere il pellet in 1 ml di terreno completo e contare. Calcolare il corretto volume di sospensione cellulare per aggiungere a ciascuna piastra di Petri per produrre 3 x 10 5 cellule / pozzetto. È richiesto Questo densità per la crescita cellulare ottimale e trasfezione efficiente. Incubare a 37 ° Cin un incubatore CO 2 5% O / N.
- Per gli esperimenti TIRFM, piastracellule su coperture in vetro. Impiegare vetro copre con 0,17 ± 0,005 millimetri di spessore e un indice di rifrazione 1,5255 ± 0,00015. Prima di iniziare, preparare i vetrini come segue:
- SH-SY5Ytransfection da polyethylenimine (PEI)
NOTA: Per visualizzare sinaptiche dinamiche vescicole, è stato utilizzato pCB6 vettore contenente Synapto-pHluorin. Il Synapto-pHluorin è stato generato da telaio in fusione di una variante sensibile al pH della proteina verde fluorescente (GFP) 16 e la proteina di membrana vescicolare sinaptobrevina 2. Il costrutto è stato ampiamente impiegato per indagare le proprietà vescicole sinaptiche all'interno neuroni 9.- Prima di iniziare trasfezione, fare 10 ml delle seguenti soluzioni. Conservare le soluzioni massima esempio 1 mese.
- Fare una soluzione 150 mM NaCl. Regolare a pH 5.5 con 0,01 N HCl.
- Fare una soluzione PEI al 10% polyethylenimine (PEI; 25 kDa lineare) in soluzione di NaCl 150 mm. Il pH della soluzione di sale a 8.8. Regolare il pH a 7,8 con 0,01 N HCl.
- 24 ore dopo la placcatura, rimuovere il supporto e aggiornare con 1,5 ml diterreno completo. Conservare le cellule a 37 ° C, in un incubatore CO 2 5%.
- Sotto il cabinet biosicurezza flusso laminare, in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga, aggiungere 3 g di plasmide DNA a 25 ml di soluzione di NaCl 150 mm e 100 ml di soluzione di PEI per 3,5 centimetri piastra di Petri.
- Vortex per 10 secondi, poi incubare la miscela DNA / PEI per 30 minuti a RT.
- Aggiungere con cautela la miscela di DNA / PEI alla piastra di Petri contenente vetrini con le cellule e scuotere delicatamente per distribuire equamente il reagente nella scatola di Petri.
- Dopo 4 ore cambiare il supporto e incubare le cellule O / N a 37 ° C in un incubatore CO 2 5%. Effettuare esperimenti di imaging 24-48 ore dopo la trasfezione.
- Prima di iniziare trasfezione, fare 10 ml delle seguenti soluzioni. Conservare le soluzioni massima esempio 1 mese.
Imaging 2. Cell di Total Internal Reflection microscopia a fluorescenza (TIRFM)
- Imaging set-up
- Eseguire l'imaging TIRF con il set-up descritto in Figura 1. Esso comprende un motore invertitomicroscopio (figura 1, riquadro A), la sorgente laser (Figura 1, riquadro B) e il TIRF-cursore (figura 1, riquadro C). Raggiungere l'illuminazione TIRFM attraverso un elevato apertura numerica (NA 1.45 Alpha Plan-Fluar) olio 100X, obiettivo ad immersione.
- Per illuminazione TIRFM, impiegare un multi-linea (458/488/514 nm) 100 mW argon laser-ion. Utilizzando una fibra in modalità mono, introdurre la luce laser polarizzata linearmente nel percorso ottico, tramite il cursore TIRF. Inserire il cursore TIRF nel piano diaframma di campo luminoso del percorso raggio riflesso di luce.
- Per un'ampia illuminazione campo, collegare il microscopio ad un tradizionale lampada al mercurio ad arco corto HBO luce bianca. Un doppio prisma a mantenimento di polarizzazione nel cursore assicura la combinazione simultanea di illuminazione TIRF e luce bianca.
- Filtrare la luce laser con un filtro di eccitazione (larghezza di banda 488/10 nm) montato su una ruota del filtro, introdotto nel percorso laser. Impiegaread alta velocità, software-controllato, otturatore per consentire il controllo rapido dell'illuminazione laser. Per l'analisi pHluorin, montare una banda passante del filtro 525/50 nm emissione. Catturare immagini digitali (512 x 512 pixel) in una camera CCD raffreddata veloce con il software immagine ProPlus.
- Il raggiungimento di illuminazione TIRF (Figura 2)
- Accendere i laser, il computer, la macchina fotografica, la ruota del filtro, e dei controllori di scatto; poi, attendere 20 minuti prima di iniziare l'esperimento come i laser hanno bisogno di riscaldarsi e stabilizzarsi.
- Prima di imaging, rendere il volume opportune delle seguenti soluzioni.
- Effettuare 50 ml di soluzione di Krebs (KRH) a 125 mM NaCl, KCl 5 mM, 1,2 mM MgSO4, 1.2 mM KH 2 PO 4, 25 mM 4- (2-idrossietil) piperazina-1-acido etansolfonico (HEPES) (tamponi per pH 7,4), 2 mM CaCl 2, e 6 mM di glucosio.
- Fare 10 ml di soluzione KCl-KRH (pH 7,4) a NaCl 80 mm, 50 mM KCl, 1.2 MgSO4 mM, 1,2 mm KH 2 PO 4, 25 mM HEPES (tamponata a pH 7,4), 2 mM CaCl 2, e 6 mM di glucosio.
- Togliere il coperchio di vetro con cellule trasfettate e inserirlo nella camera di imaging appropriata. Montare la camera e aggiungere 500 ml di soluzione KRH nel centro del vetro.
- Aggiungere olio sopra l'obiettivo. Posizionare la camera di imaging sul palco del microscopio e posizionare l'obiettivo sotto il vetrino di vetro. Posizionare il coperchio di sicurezza sul campione.
- In modalità epifluorescenza, concentrarsi sul vetrino (superficie superiore) e scegliere cellule trasfettate poste al centro della camera. Selezionare le celle cui segnale fluorescente può essere registrato in modo chiaro con un tempo di esposizione al di sotto di 80 msec.
- Sotto il controllo del software, passare a illuminazione TIRF in modalità live.
- Per impostare la configurazione TIRF, controllare la posizione del raggio che emerge dell'obiettivo, sul coperchio del campione (Figura 2B). Quando il fascio è posizionato nel centro di tegli obiettivo (Figura 2A, a sinistra), un punto è visibile nel centro della copertura del campione TIRF (Figura 2B, sinistra) e la cella viene ripreso in modalità epifluorescenza (più piani fuoco, sfondo elevata fluorescenza; la figura 2C, sinistra) .
- Per raggiungere l'angolo critico, spostare il punto focalizzato nella direzione Y (in avanti o all'indietro; la figura 2B, centrale) tramite la vite di regolazione dell'angolo sul cursore TIRF (Figura 1C). Quando il fascio converge sul piano del campione ad un angolo superiore all'angolo critico (Figura 2A, a destra), il punto scompare e diritta, sottile linea concentrata è evidente al centro del coperchio campione (Figura 2B, destra).
- Per regolare l'angolo TIRF utilizzare il campione di cellule (Figura 2C). Guarda l'immagine di fluorescenza sul video, in questa fase, una immagine epifluorescenza simile è ancora visibile. Delicatamente, spostare la vite fino TIRF concondizione si ottiene: un solo piano ottico della cella è a fuoco (cioè, la membrana plasmatica a contatto con il coperchio antiscivolo), questo si traduce in un'immagine piatta con elevato contrasto (Figura 2C, destra).
- Immagini di esempio
- Impostare l'esperimento time-lapse singolo canale. Per ridurre al minimo photobleaching, catturare l'immagine utilizzando il minimo di esposizione e ad alto guadagno. Tempi di esposizione adeguati sono tra i 40 - 80 msec. Acquisire le immagini a 1 - 2 Hz frequenza di campionamento. Cinetica vescicole possono essere meglio apprezzato campionamento a frequenza più alta (10 Hz). Il tempo normale di osservazione è di solito 2 min.
- Aggiungere 500 ml di soluzione e registrare cellule KRH in modalità TIRFM. Questa è la condizione di riposo. Salvare le immagini sequenziali di tempo.
- Focus sulla stessa cella e registrare nelle stesse condizioni di riposo (di potenza laser, tempo di esposizione, numero di telaio). Dopo cinque fotogrammi, aggiungere 500 ml di soluzione di KCl-KRH e mantenere KCl nella camera.Questa è la condizione stimolato; salvare le immagini in sequenza di tempo.
3. Immagine Analisi ed elaborazione dati
NOTA: Per analizzare le immagini, le macro sono state sviluppate in laboratorio, sulla base di funzioni esistenti del software di analisi di immagine; macro simili sono disponibili online (URL fornito in Tabella dei Materiali e attrezzature).
- Quantificazione dell'intensità di fluorescenza
- Utilizzare una macro "Sequenza intensità di fluorescenza" per la quantificazione intensità di fluorescenza in una regione di interesse (ROI) dell'immagine, nel corso del film.
- Aprire le immagini in tempo-sequenziale. Vai al menu macro e selezionare 'Sequence intensità di fluorescenza'. Nella finestra 'Analysis' appare "selezionare il ROI".
- Scegli uno degli strumenti di selezione nel menu per creare il ROI. Mettere 3 ROI nelle regioni della membrana cellulare senza macchie (sfondo ROI). Impiegare this "background ROI" per valutare il photobleaching e per impostare la soglia per l'analisi evento di fusione (Figura 3A).
- Photobleaching correzione e la determinazione della soglia (Figura 3B)
- Per valutare il photobleaching, aprire i fluorescenza intensità righe "ROI di fondo", (Figura 3BA). Normalizzare i valori di intensità di fluorescenza in ogni fotogramma al valore intensità iniziale (F0) (F / F0) (Figura 3BB). La media dei valori.
- Evidenziare i dati medi e creare un grafico linea utilizzando le opzioni del menu grafico.
- Dal menu di analisi dei dati, selezionare "linea di tendenza" per aprire la finestra di analisi trama. Selezionare il tipo di regressione. Impostare regressione "esponenziale". Quindi selezionare "equazione display grafico". Nella finestra del grafico, viene visualizzata l'equazione esponenziale ed i valori dei parametri vengono assegnati automaticamente, (Figura 3BC
- Applicare la correzione esponenziale per i valori di intensità in ogni fotogramma come segue:
Fn (corretto) = Fn / exp (-n * a)
Fn = intensità di fluorescenza sperimentale misurato a telaio n; n = numero di fotogrammi; a = fattore di sbiancamento (costante che esprime il tasso di perdita di intensità a causa di photobleaching; Figura 3BD). - Per impostare la soglia, aprire un normalizzato e corretto "background ROI", calcolare il segnale media di fluorescenza e la sua deviazione standard (SD). Il valore medio più 3 SD rappresenta la soglia (Figura 3BE). Utilizzare questa soglia per l'analisi dei dati.
- Selezione di eventi di fusione utilizzando una procedura semiautomatica
- Aprire le immagini in tempo-sequenziale con il software di analisi delle immagini. Applicare un filtro gaussiano per la sequenza di immagini attiva.
- Analizzare le immagini utilizzando funzione "contare oggetti" o una macro che permette la selezionedi un oggetto la cui pixel hanno intensità media di fluorescenza in un intervallo definito. Impostare l'intensità gamma manualmente, utilizzando la funzione di soglia (andare al menu bar, impostare la soglia misura → per evidenziare l'area di interesse). Una soglia adeguata è del 30% rispetto al segnale di fondo fluorescente locale.
- Applicare una macro "Filtri oggetti" per selezionare solo gli oggetti che soddisfano i seguenti criteri:
- Applicare l'opzione range (min e max compreso) per aspetto. Aspect riporta il rapporto tra l'asse maggiore e l'asse minore dell'ellisse equivalente all'oggetto. Aspect è sempre ≥1. I valori sono adeguati min = 1, max = 3.
- Applicare gli intervalli per il diametro. Diametro riporta la lunghezza media dei diametri misurati a intervalli di due gradi unisce due punti della struttura e passante per il baricentro dell'oggetto. Impostare l'intervallo di pixel (o micron, se si utilizza un sistema calibrato).
- Definire il range ottimale in preliminEsperimenti ary: selezionare manualmente i punti di interesse e quindi misurare il loro diametro utilizzando la funzione di profilo trama.
- Seleziona "oggetti di visualizzazione": oggetti selezionati appariranno sovrapposte all'immagine TIRFM (Figura 4B).
- Includere nell'analisi solo i punti che mostrano una breve (1-3 fotogrammi) transitorio aumento di intensità di fluorescenza, immediatamente seguita da una marcata perdita di segnale (macchie transitorie). Impiegare la selezione circolare per creare un ROI del diametro di circa un punto radialmente attorno alle vescicole / spot selezionati (ROI sperimentale). Eseguire questo passaggio manualmente.
- Con le ROI selezionato, calcolare l'intensità media di fluorescenza di ogni ROI nel corso del film.
- Analisi dei dati (Figura 3C-D)
- Esportare il tempo-corso dei cambiamenti fluorescenza misurati in ogni "ROI sperimentale" ad un foglio di calcolo; (Figura 3DA). Normalizzare il valore di intensità in ogni frame per l'intensità iniziale di fluorescenza (F / F0), (Figura 3Db).
- Applicare la correzione esponenziale per i valori di intensità in ciascun frame come riportato al punto 3.2.4 (Figura 3Dc).
- Per calcolare il numero totale di eventi di fusione (numero di picco), la volta che si verifica ogni fusione (larghezza del picco) e l'ampiezza del picco fluorescente (altezza del picco e AUC) si applicano le funzioni logiche che utilizzano fogli di calcolo o di matematica pacchetti. Un esempio di analisi degli eventi di fusione con formule logiche è riportato in Figura 3DD e 3De.
- Assumere l'aumento dell'intensità della fluorescenza supera la soglia (intensità di fluorescenza di fondo media ± 3SD) come fusione delle vescicole alla membrana plasmatica ed il picco risultante come un evento di fusione.
- Calcolare la larghezza del picco come differenza tra l'ultimo ed il primo valore x di ogni picco. Moltiplicate questo valore per 1 / (frequenza di campionamento). Considerate questo valore uns il tempo di fusione delle vescicole e l'adesione a livello della membrana plasmatica prima vescicole ri-acidificazione e riciclaggio (Figura 3DD).
- Calcolare la AUC whole-cell come una somma di valori sopra soglia. Considerate questo valore come variazione netta fluorescente durante il tempo di registrazione grazie alla spontanea (a riposo) o evocata (stimolato) attività sinaptica.
- Calcolare l'altezza di picco come differenza tra il valore y massimo di ciascun picco e la soglia. Considerate questo valore come indicativo del tipo di fusione (singolo vs. fusione sequenziale / simultanea o transitoria vs. completa fusione).
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Representative Results
Le procedure TIRF imaging e analisi dei dati descritti sono stati concepiti per studiare vescicole dinamiche in sistemi cellulari. Questa tecnica può essere utilizzata per determinare gli effetti di molecole di segnalazione e farmaci sugli eventi di fusione e le dinamiche neurotrasmettitore vescicole 17. Utilizzando proteine di membrana plasmatica GFP-tagged, l'analisi TIRFM è stato impiegato per caratterizzare il traffico costitutiva di GFP-tagged trasportatori del glutammato in gliali e cellule epiteliali 18,19.
Per convalidare la strategia procedura di imaging e di analisi dei dati riportati, gli eventi di fusione sono registrati in condizioni basali e stimolati (depolarizzazione potassio indotta), in cellule di neuroblastoma SH-SY5Y trasfettate con Synapto-pHluorin. (Video 1, 2, rispettivamente). Due differenti analisi vengono eseguite: cellula intera (Figura 4) e analisi singole-vescicole (Figura 5).
Analisi delle cellule Whole meaSures il numero totale di eventi di fusione nella cellula e le conseguenti variazioni di fluorescenza indotte dalla stimolazione nette. Nella Figura 4, cellule trasfettate Synapto-pHluorin sono iscritte tra riposo e condizioni (stimolazione KCl) stimolato, utilizzando lo stesso protocollo sperimentale (tempo di esposizione, la potenza del laser, ecc). La figura 4A mostra che Synapto-pHluorin accumula in puncta fluorescenti sparsi sul membrana cellulare. Come descritto in letteratura, un segnale di fluorescenza debole è presente alla membrana plasmatica 9 anche; questo segnale è utile per identificare le cellule da acquisire. Nella Figura 4B, punti selezionati dalla procedura automatica descritta nella carta (punto 3.3) si sovrappongono all'immagine TIRFM riportato in Figura 4A. Figura 4C mostra i profili normalizzati intensità fluorescenti di punti selezionati in condizioni di riposo. Questi profili rivelano la presenza di picchi individuali di int fluorescenti simileensità che escono in diversi momenti durante la registrazione e probabilmente corrispondono a vescicole che fondono occasionalmente con la membrana. La figura 4D mostra gli effetti della stimolazione KCl. Come previsto, depolarizzazione con KCl 25 mM suscita una risposta pronta e diversi puncta fluorescenti molto luminosi appaiono a livello della membrana cellulare (Video 2). Questi puncta corrispondono alla piscina 'facilmente sganciabile' delle vescicole sinaptiche presenti sotto la membrana plasmatica. L'analisi andamento temporale delle variazioni fluorescenti misurati in corrispondenza di singoli punti indica la presenza di picchi di intensità di fluorescenza variabile, che appaiono improvvisamente dopo l'applicazione dello stimolo secretori (Figura 4D e 4F). I risultati dell'analisi cellule intere durante il tempo di registrazione vengono riportati in Figura 4E-H. KCl stimolazione provoca un rapido marcata aumento del numero di eventi di fusione (2,5 volte aumento rispetto condizioni di riposo) (Figura 4E-F) e le conseguenti variazioni di intensità di fluorescenza (9,3 volte maggiore su condizioni di riposo) (Figura 4G-H), indicando così massiccio rilascio di neurotrasmettitore.
Analisi singolo picco permette la caratterizzazione di eventi singola fusione (Figura 5). Figura 5A mostra il sequenziale immagini di un rappresentante "ROI sperimentale", registrato in condizioni di riposo. La particolare evidenzia un Synapto-pHluorin etichettato vescicole che si fonde con la membrana sotto la zona TIRF. Dopo due telai, il segnale fluorescente scompare, indicando recupero vescicole probabile e ri-acidificazione. Il profilo di fluorescenza normalizzato della regione di interesse (Figura 5B) misura l'aumento del segnale fluorescente in corrispondenza della comparsa posto nella zona TIRF. Al contrario, la fluorescenza torna al livello basale dopo punto la scomparsa (unico piccolarghezza media 1,91 ± 0,32 secondi; picco media altezza 0,042 ± 0,005 intensità di fluorescenza normalizzato). Figura 5C e 5D mostrano le immagini sequenziali di un "ROI sperimentale", registrato sotto stimolazione KCl e il corrispondente profilo di intensità di fluorescenza normalizzata. Nota l'aumento nel movimento di vescicole dentro e fuori dalla zona TIRF dopo KCl depolarizzazione.
40 eventi di fusione sono selezionati e analizzati in condizioni di riposo e stimolati. I seguenti parametri sono misurati: AUC picco media, la larghezza e l'altezza di picco. Larghezza Peak specifica il tempo di fusione delle vescicole, attaccamento e endocitosi prima di ri-acidificazione e riciclaggio, Figura 5G. Altezza Peak misura le variazioni di intensità di fluorescenza indotta da fusione delle vescicole, figura 5F. Le variazioni di questi parametri sono indicativi di diversi meccanismi di esocitosi. Analisi Single-peak rivela che KCl depolarizzazione modifica ilmodalità di fusione delle vescicole alla membrana plasmatica. Infatti, aumentare la superficie media di picco (3,8 ± 0,2 volte maggiore sulle condizioni di riposo, P <0,01 per paired t-test, Figura 5E), altezza del picco (2,75 ± 0,03 volte maggiore, P <0,01 per paired t-test, figura 5F) e larghezza (2,6 ± 0,5 volte maggiore, P <0.05 per paired t-test. Figura 5G) vengono rilevati in condizioni stimolati. Diverse spiegazioni possono essere previsti per questi risultati. Una possibilità è che KCl depolarizzazione provoca la fusione simultanea e / o sequenziale di vescicole in una regione vincolata delle cellule. Una spiegazione alternativa è che forte depolarizzazione favorisce completa fusione contro fusion transitoria. In condizioni basali, il meccanismo prevalente è una fusione transitorio: una fusione forme dei pori, il pH nelle vescicole aumenta e viene visualizzato il segnale fluorescente, ma il poro chiude immediatamente, permettendo così una rapida ri-acidificazione e riciclaggio. Sottocondizioni stimolati, la vescicola fusibili completamente con la membrana plasmatica, l'altezza e la larghezza aumento ricattura di componenti vescicole di membrana, ri-acidificazione e riciclaggio può richiedere un periodo più lungo. Un risultato simile è stato recentemente ottenuto analizzando synaptic come microvesicle esocitosi in endocrini β-cellule 20.
Figura 1. microscopio TIRF istituito. Schema e immagine (nel riquadro) del sistema di microscopio TIRF. L'allestimento comprende il microscopio motorizzato Axio Observer Z1 invertita (A), un multi-linea 100 mW laser argon-ion (B) e una TIRF-cursore (C). Sono mostrati La luce laser (linea verde) e la luce bianca (linea gialla). Le cellule vengono esposte con un obiettivo ad immersione di 100 × olio. Le immagini digitali vengono catturate da una telecamera CCD veloce RetigaSRV raffreddata. L'arbitroModulo lettore, l'emissione (488/10 nm) e l'eccitazione (passa banda 525/50 nm) filtri, il collimatore (L1) e la messa a fuoco (L2) lente sono indicati. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Come configurazione TIRFM. (A) Schema fumetto illustrano l'obiettivo, la copertura antiscivolo, il campione e la posizione del raggio laser (linea blu). Sinistra, il fascio di eccitazione viaggia direttamente attraverso l'interfaccia copertura antiscivolo-campione . Il campione è eccitato come nel modo epifluorescenza. Center, le forme fascio di eccitazione con il campione un angolo di incidenza inferiore all'angolo critico, la luce illumina il campione ad un angolo variabile. Destro, il fascio di eccitazione costituisce incident angolo maggiore dell'angolo critico, la luce riflessa viene completata nella lente obiettivo e un campo evanescente propaga nel campione. (B) mostra il coperchio fumetto campione e la posizione del fascio di eccitazione (cerchio blu), che emerge dell'obiettivo, durante la transizione da epifluorescenza (sinistra) verso illuminazione TIRF (a destra). (C) epifluorescenza (a sinistra) e TIRFM (a destra) le immagini di Synapto-pHluorin fluorescenza in un live di cellule SH-SY5Y. Scala bar:. 10 micron Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. elaborazione e analisi dei dati. (A) immagine TIRFM di Synapto-pHluorin fluorescenza in un live SH-SYCell 5Y. La piazza verde indica un rappresentante "background ROI". Scale bar 10 micron. (B) del flusso di lavoro proposto per sfondo ROI. Dall'alto in basso:.... Un corso di tempo di fluorescenza variazioni di intensità misurate sullo sfondo ROI; b normalizzazione delle variazioni di fluorescenza al valore di fluorescenza iniziale (F / F0); c applicazione della regressione esponenziale; d correzione per photobleaching, e. la valutazione di soglia (quadrato grigio trasparente). (C) TIRFM immagine di Synapto-pHluorin fluorescenza in una cellula SH-SY5Y live. Il quadrato bianco indica un rappresentante "ROI sperimentale". Scale bar 10 micron. (D) il flusso di lavoro proposto per il ROI sperimentale. Dall'alto in basso:.. Un corso temporale delle variazioni di intensità di fluorescenza; b normalizzazione dei dati al valore di fluorescenza iniziale (F / F0); c. photobleaching,. de applicazione di funzioni logiche per individuare il numero di picco, AUC, larghezza e altezza. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4. analisi delle cellule intero. (A) immagine TIRFM di Synapto-pHluorin fluorescenza in un live cellule SH-SY5Y. Le cellule sono iscritte riposo e stimolati (25 applicazioni KCl mm) le condizioni (campionati a 1 Hz). Scala bar: 10 micron. (B) punti individuati dalla procedura automatica sono mostrati sovrapposto (colore verde) l'immagine TIRFM on. (C) profili normalizzati intensità di fluorescenza (F / F0) di punti selezionati dalla procedura automatica in tutta la cella in condizioni di riposo. (D) NormalizED profili di intensità di fluorescenza (F / F0) di punti selezionati in condizioni stimolati. La barra sopra le tracce indica applicazione KCl. (EH) Numero di eventi e cambiamenti di intensità di fluorescenza registrate in tutta la cella in riposo (blu) e stimolati (rosso) condizioni. (E) istogrammi che mostra il numero totale di eventi di fusione registrati nella cella. (F) la distribuzione temporale degli eventi di fusione. (G) Gli istogrammi rappresentano variazioni di pHluorin intensità di fluorescenza che si verificano nella cellula intera (Totale AUC). (H) che mostrano le curve cumulate pHluorin variazioni di intensità di fluorescenza in funzione del tempo. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Video 2. cellule SH-SY5Y esprimono Synapto-pHluorin sono registrati in condizioni stimolati (campionati a 1 Hz). KCl perfusione è indicato. Cliccate qui per vedere il video.
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Discussion
Questo articolo presenta un protocollo di immagine e analizzare vescicole dinamica in cellule secernenti, utilizzando vettori cDNA codificati fluorescenti e TIRFM. Gli elementi chiave del successo di imaging da TIRFM sono la selezione del modello di cellulare e trasfezione delle cellule con indicatori ottici geneticamente codificate di rilascio delle vescicole e riciclo.
TIRFM è ideale per le cellule in crescita aderenti a una copertura in vetro e sufficientemente piatto per permettere la visualizzazione stabile di membrane e eventi di fusione. Le vescicole dovrebbe idealmente essere disperso nella cella in modo che il loro traffico, fusion e endocitosi possono essere esposte e quantificati a livello di singolo-vescicole. Purtroppo, i neuroni non soddisfare questi criteri: hanno forme irregolari, neuriti che spesso si incrociano l'un l'altro, e delle vescicole fusione è prevalentemente concentrata nelle piccole regioni (zone attive). Per queste regioni è molto difficile studiare dinamiche vescicole da TIRFM in colture primarie di neuroni.
Mentre la disponibilità di diversi reagenti e procedure di trasfezione rende trasfezione quasi una procedura standard in SH-SY5Y e anche in colture primarie neuronali, la cura deve essere presa durante la registrazione, l'analisi e l'interpretazione dei dati TIRFM. TIRFM facilita la raccolta di informazioni riguardanti i processi che si verificano in corrispondenza o in prossimità della membrana in cellule viventi, e permette l'analisi di eventi molecolari individuali attraverso il rilevamento di variazioni del segnale fluorescente derivati da proteine contrassegnati che si muovono in avanti o indietro della evanescente depositata. Tuttavia, diversi fattori possono modificare i segnali fluorescenti in questa zona, senza necessariamente implicare eso / eventi endocitiche, e questo deve essere prenderen in considerazione durante la registrazione e l'analisi dei dati. Tra questi ci sono alterazioni morfologiche della cellula, in particolare quelle riguardanti il piano a fuoco sotto il campo e fluoroforo modifiche evanescenti durante la registrazione.
Morfologiche modifiche
L'alta risoluzione della tecnica si basa sulla TIRF eccitazione fluorofori nel campo evanescente, con la profondità di 100 nm dall'interfaccia di vetro 11. Questa è una zona molto sottile e modificazioni morfologiche impercettibili dovrebbero cambiare il piano cellule a fuoco. Ciò vale in particolare per i neuroni e le cellule che presentano diversi processi e presentano arruffarsi pronunciato. In queste cellule, l'area della membrana a contatto con il coperchio antiscivolo durante la registrazione è irregolare e può cambiare rapidamente, provocando così la valutazione imprecisa di esocitosi. Per questo motivo, quando possibile, è importante selezionare il modello cellulare di ricerca. Per limitare moveme cellularenti possono essere utili a cappotto di vetro coperte con proteine della matrice extracellulare o poli-l-lisina. Tuttavia, si deve tenere presente che questi substrati possono modificare le dinamiche di comportamento delle cellule e vescicole.
Altre possibili fonti di modificazioni morfologiche durante la registrazione sono stimolazione cellulare, aggiunta di soluzioni e variazioni di temperatura. Gli stimoli in grado di indurre massiccia vescicole rilascio (cioè, KCl depolarizzazione) sono spesso causa di restringimento delle cellule che modifica ovviamente la superficie cellulare sotto la zona TIRF. È quindi importante selezionare accuratamente il tempo tipo, la concentrazione, e l'applicazione dello stimolo in esperimenti preliminari.
La semplice introduzione di soluzioni nel bagno con una pipetta, indipendentemente dalla composizione, può causare modificazioni della morfologia cellulare mediante sollecitazione di taglio. Per risolvere questo manufatto, aggiungere mezzo preferibilmente utilizzando un sistema di perfusione, eventualmente collegato con una pompa a vuoto per ridurre il rumore.
Fluoroforo
Alterazione dei segnali fluorescenti può anche essere dovuta alla modifica del fluoroforo durante la registrazione. La più importante è photobleaching 23. Photobleaching è la decomposizione fotoni indotta di un fluoroforo. Generalmente provoca una perdita permanente di fluorescenza e oscuramento del campione osservato nel corso del tempo. In TIRFM, solo fluorofori chiusa l'origine del campo evanescente può essere fotodecolorate e proteine di membrana GFP-tagged sono fotodecolorate perché risiedono in questo campo. La prevenzione della sbiadimento di intensità di emissione di fluorescenza è molto importante per ottenere immagini di alta qualità, e obbligatorio per microscopia a fluorescenza quantitativa. Con un ragionevole approssimazione, per una data molecola in un ambiente costante, fotoscolorimento dipende dal tempo e il ciclo di esposizione alla fonte di eccitazione. In molti casi, fotoscolorimento segue una semplice funzione di decadimento esponenziale, che rende la sua valutazione e la correzione facile effettuando registrazioni di controllo 23. Diverse formule di correzione / macro sono disponibili online (vedi tabella di materiali ed attrezzature); nel protocollo un semplice EXPOnentifunzione al è stato usato.
Ci sono diverse strategie per superare photobleaching. Una buona strategia è di impedire photobleaching alla fonte, ad esempio, utilizzando fluorofori con elevata fotostabilità. Purtroppo, in questo momento, la scelta di sonde a DNA codifica è ancora limitata. In questo caso, la perdita di attività causata da photobleaching può essere minimizzata durante l'acquisizione delle immagini, ottimizzando lasso di tempo di esposizione alla luce, l'energia fotonica della luce di ingresso e la frequenza di campionamento.
Quando si utilizzano sonde pH-sensibile, una ulteriore fonte di modificazione fluoroforo durante la registrazione è lo spostamento pH nel mezzo. Il volume di liquido della camera di registrazione è generalmente molto bassa e Drug Application, l'attività delle cellule e il metabolismo può modificare il pH del mezzo, soprattutto nel piccolo volume tra il cellulare e la superficie del vetrino. Questo a sua volta, cambia il segnale fluorescente pHluorin, causando sovra / sotto-stima di vescicole releasing. Ad esempio, stimolazioni forti possono portare ad una acidificazione calcio-dipendente del citosol e specchiato alcalinizzazione nello spazio extracellulare, conseguente all'aumento esagerato nel segnale fluorescente 24.
Per evitare questo problema, utilizzare sempre soluzioni tampone e monitorare eventuali modifiche del pH introdotte dal protocollo stabilito, in esperimenti preliminari. Per una stima più accurata del rilascio evocato vescicole, quando si analizzano i dati, monitorare il segnale di fluorescenza in una regione della superficie cellulare, senza eventi di fusione, e utilizzare modifiche del segnale fluorescente all'interno di questa regione come fattore di regolazione.
In conclusione, un metodo per monitorare e analizzare fusione della vescicola e dinamiche è stato descritto. Questa tecnica può essere utilizzata in diversi tipi cellulari (neuroni e cellule endocrine) per visualizzare e analizzare le varie fasi di eso / endocitosi, per rivelare il ruolo delle proteine e loro pathogenimutanti c nella regolazione della dinamica di vescicole e per scoprire i meccanismi di azione dei farmaci mirati esocitosi costitutiva e regolata.
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Acknowledgments
Gli autori desiderano ringraziare l'Università degli Studi di Milano per il sostegno a Eliana Di Cairano (borsa di studio post-dottorato) e Stefania Moretti (Ph.D. fellowship). Questo lavoro è stato sostenuto dal Programma di Ricerca dell'Università di PUR CP
Vorremmo ringraziare il Prof. Jeremy M. Henley, Facoltà di Biochimica, Università di Bristol, Regno Unito, per il pHluorin costruire e Dr. Francesco Dotti per l'assistenza nell'analisi dei dati, e di Silvia Marsicano per l'assistenza tecnica.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Axio Observer Z1 |  Zeiss |
491912-9850-000 | inverted microscope |
| Multiline Argon Laser Lasos 77 | Lasos |
00000-1312-752 | multi-line (458/488/514 nm), 100 mW argon-ion laser |
| Laser TIRF slider | Zeiss |
423681-9901-000 | |
| 100X Objective | Zeiss |
421190-9900-000 | Oil, NA 1.45 Alpha-Plan |
| CCD Camera RetigaSRV Fast 1394 | QImaging |
||
| LAMBDA 10-3 optical filter changer with SmartShutter | Sutter Instrument Company |
||
| Software | |||
| Image ProPlus 6.3 Software | Media Cybernetics |
spot selection, ROI selection, fluorescence intensity determination | |
| Excel | Microsoft |
photobleaching correction, whole-cell and single-vesicle analyses | |
| GraphPad Prism 4.00 | GraphPad Software, Inc. |
statistical analysis | |
References
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