Abstract
シナプス小胞が融合し、検索の動的なサイクルを通じて化学シナプスでの神経伝達物質を放出し。 リアルタイムでシナプス活性を監視し、単一小胞レベルでのエキソサイトーシスの異なるステップを解剖することは、健康および疾患におけるシナプスの機能を理解するために重要である。
遺伝的にコードpH感受性直接シナプス小胞をターゲットとプローブと全反射蛍光顕微鏡（TIRFM）は小胞のダイナミクスに従うことが必要な時空間的分解能を提供。全反射によって生成されたエバネッセントフィールドは、エキソサイトーシスのプロセスが行われる正確な場所は、細胞が付着したガラスのカバーの上の薄層（<150 nm）の中に入れ、フルオロフォアを励起することができる。得られる高コントラスト画像は、理想的には、追跡小胞融合事象の定量分析に適している。
このプロトコルでは、SH-SY5Yヒトnはeuroblastoma細胞は、それらの平らな表面と分散小胞の存在のため、TIRFMによって単一小胞レベルでの神経伝達物質の放出を研究するための貴重なモデルとして提案されている。接着細胞としてSH-SY5Yを成長させるためとsynapto-pHluorinでそれらをトランスフェクトするための方法はTIRFMおよびイメージングを実行するための技術と同様に、提供される。最後に、選択してカウントし、全細胞および単一小胞レベルでの融合事象を分析することを目的と戦略が提示されている。
撮像手順及びデータ分析アプローチを検証するために、pHluorinタグ付きの小胞のダイナミクスは、静止条件下で分析し、（カリウム濃度の脱分極）の条件を刺激する。膜の脱分極は、融合事象の頻度を増加させ、全体のセルに記録正味の蛍光シグナルの並列上昇を引き起こす。単一小胞の分析は、融合事象の挙動の改変（増加したピーク高さと幅）を明らかにする。これらのデータは、目を提案カリウム脱分極で大規模な神経伝達物質の放出を誘導するだけでなく、小胞融合やリサイクルの仕組みを変更するだけではなく。
適切な蛍光プローブで、この技術は、構成的分泌刺激のメカニズムを分析するために、異なるセルラーシステムで使用することができる。
Introduction
ニューロン間の化学シナプス伝達は、神経系におけるコミュニケーションの主要なメカニズムである。それは、シナプス前サイトでの小胞融合と検索の動的なサイクルを通して神経伝達物質の放出に依存している。小胞動態に関与するタンパク質の多くが同定されている。しかし、現象への具体的な貢献は、1を明確にされていない。
我々の理解は、部分的に、エキソ/エンドサイトーシスのために最も広く使用されるアッセイは、常に最も適切ではないという事実によって制限される。小胞融合とダイナミクスに関連したいくつかの研究では、電気生理学的手法に依存している。この技術は、最適な時間分解能を提供し、原形質膜への小胞の初期の融合を調査するための優れているが、シナプス前機能をサポートする基礎となる分子事象の多くを検出できない。電子顕微鏡は、他の側に、最高級のmorphologicaを提供していますサンプルが分析されるために修正される必要があるため、Lの各特異ステップの説明が、イベントの動的な側面は、捕獲することができない。
新たな光記録技術の出現2,3は 、蛍光分子プローブの開発4-6の進歩と組み合わせて、このようにシナプスの構造と機能についての情報の新しいレベルを提供する、 生きた細胞内のエキソサイトーシスのプロセスの可視化を可能にします。
初期の研究に活用活動依存スチリル染料（FM1-43および関連有機染料）7,8。最先端のイメージング技術は、管腔小胞タンパク質9につなが緑色蛍光タンパク質（GFP）（pHluorin）のpH感受性変異体を使用する。これらのプローブは、通常は低いため管腔のpHをベシクル中に存在する場合にオフになります。原形質膜との融合の後、小胞の内部は中性細胞外空間のpHに曝露される突然、増加pHluorinのプロトン依存消光を軽減し、蛍光シグナルが急速に表示されます。 pHluorinの変化は、蛍光の増加を監視することにより、融合事象よりも高速であるように、膜との小胞の融合を測定し、分析することができる。表面pHluorinタグ化分子はエンドサイトーシスされているので、蛍光シグナルは、その後、基礎レベルに戻るので、同一の構築物は、9のリサイクル小胞を監視するためにも使用することができる。
小胞 - タグ付きのpHセンサーはだけは本当に細胞膜と融合するもの胞の可視化を保証しながら、高い空間と時間分解能でのイメージングは細部にエキソ/エンドサイトーシスプロセスに関与する手順を記述するために必要とされる。必要な時空間分解能を提供する光学技術は、全内部反射蛍光顕微鏡（TIRFM）、蛍光顕微鏡10の適用である。
">内部全反射は、光路が臨界角よりも大きな入射角でガラスカバースリップに達するとガラスカバースリップと試料との間の界面で発生する励起光を試料に伝達されないが完全界面におけるエバネッセント光の波形は、これらの条件下ではバックの反射が少ない光学濃度（サンプル）を含む培地中で伝播する。エバネッセント場の強度の侵入深さで（界面からの距離とともに指数関数的に減衰するようにさらに、境界から離れたものがGFP構築物でトランスフェクトした細胞ではなくなってから約100nm）をカバースリップに最も近接のみフルオロフォアを励起することができ、この深さは、原形質膜上に発現されるタンパク質、または小胞構造に対応細胞内部でフルオロフォアを励起することができないように、バックグラウンド蛍光が最小化される。それに接近し、非常に高いシグナル/バックグラウンドラットの画像ioが11が形成されている。いくつかの特徴は、小胞の動態を監視するための選択肢のTIRFM技術を作る。完璧なコントラスト及び高い信号対雑音比は、単一の小胞に由来する非常に低い信号の検出を可能にする。各フレーム内のチップベースの画像取得が非常に動的なプロセスを検出するのに必要な時間分解能を提供する。最後に、サンプル内の他の面での光への細胞の最小限の露出が強く光毒性を軽減し、長期的なタイムラプス記録12を可能にします。
データ分析は、この技術の最も挑戦的で重要な側面のまま。小胞の融合をモニターするための最も簡単な方法は、時間13にわたって、細胞表面でのレポーター蛍光タンパク質の蓄積を測定することである。融合が増大すると、正味の蛍光シグナルも同様に増加する。しかし、この方法は、特に大細胞および休止状態で、プロセスを過小評価することが、エンドサイトーシスおよび光退色プロセスにより小胞のエキソサイトーシスに対する蛍光強度の増加を相殺するためである。別の方法は、各単一の融合事象14に従うことである。この後者の方法は非常に敏感であり、融合のメカニズムに関する重要な詳細を明らかにすることができます。完全に自動化された手順は、小胞を追跡し、それらの蛍光シグナルの変動を登録するために常に利用可能ではないので、それは、単一のイベントを手動で選択する必要がある。小胞の動態を観察したところ、高い周波数でサンプリングセルが必要です。これは、ほとんど手動で分析することができない大量のデータを生成する。
この論文の提案は両方、基礎を監視するためのTIRFMイメージング技術を最適化し、SH-5YSY神経芽細胞腫細胞株における神経伝達物質の放出を刺激し、そしてデータを分析するために、ステップバイステップで、実験室で開発された手順を記述することである全細胞および単一小胞レベルで。
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Protocol
1.細胞培養およびトランスフェクション
- SH-SY5Y細胞培養
注：実験は、ヒト神経芽細胞腫SH-SY5Y（ATCC＃CRL-2266）15を用いて行われてきた。 SH-SY5Y細胞は、浮遊クラスタおよび接着細胞の混合物として成長する。しっかりとTIRFMのために重要であるガラスカバーに付着して増殖する細胞を持っているプロトコル（細胞密度、分割比など ）で報告された指示に従ってください。- 開始する前に、層流生物学的安全キャビネットの下で、無菌のリン酸緩衝生理食塩水（PBS）、培養液の適切な容積を行う。
- 、150mMのNaClの濃度でPBSを50mlを加える24 mMリン酸緩衝液（pH7.4）。溶液を濾過する。
- 高グルコース、10％熱不活化ウシ胎児血清（FBS）、ペニシリン（100 U / ml）を、ストレプトマイシン（100μg/ ml）を、L-グルタミン（ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）で細胞培地50mlを加える2ミリモル）、及びピルビン酸ナトリウム（1mM）を。溶液を濾過する。
- 完全増殖培地を除去し、3mlのPBSで細胞を洗浄。
- 37℃で5分間（6センチメートルシャーレ用）0.05％トリプシンエチレンジアミン四酢酸2ml（EDTA）、5％CO 2で細胞をインキュベートし、ピペットを用いて細胞を取り外す。
- DMEM 2 mlを添加することによってトリプシンを不活性化し、5分間300×gでの遠心分離によって細胞を収集する。
- 上清を除去し、ペレットに1mlのDMEMを追加し、ソリューションをピペット上下十分に単一細胞懸濁液に細胞を分散させるために。
- 完全培地の3ミリリットルを含む新しい直径6cmシャーレに4：彼らに1を分割。 5％CO 2インキュベーター中、37℃で、直径6cmのペトリ皿中で、培養中の細胞を維持する。週に一回継代培養あるいは80に覆われたとき - 表面積の90％。
- 開始する前に、層流生物学的安全キャビネットの下で、無菌のリン酸緩衝生理食塩水（PBS）、培養液の適切な容積を行う。
- イメージング用のSH-SY5Y細胞のメッキ
- TIRFM実験のために、プレートガラスカバーの上に細胞。ガラスは0.17±0.005ミリメートルの厚さと1.5255±0.00015屈折率でカバーして採用する。開始する前に、次のようにカバーガラスを準備します。
- きれいなガラスを90％エタノール、O / Nで覆う。
- 蒸留水（蒸留水を3回交換）でそれらを徹底的に洗浄します。乾燥したガラスは、乾燥オーブンで覆う。
- 場所は、ガラスペトリ皿にカバーし、3時間、200℃で予熱したオーブン中で滅菌する。
- トランスフェクションの前日に、3.5センチメートルペトリ皿に各カバースリップを置き、1mlの培地を追加し、5％CO 2インキュベーター中、37℃でインキュベートする。
- 1.1.5、完全培地1mlの細胞ペレットを中断し、カウント - ステップ1.1.3で説明したように細胞をトリプシン処理。ウェル/ 3×10 5個の細胞を得るために各ペトリ皿に追加し、細胞懸濁液の正確な体積を計算する。この密度は、最適な細胞成長および効率的なトランスフェクションのために必要とされる。 37℃でインキュベート5％CO 2インキュベータO / Nである。
- TIRFM実験のために、プレートガラスカバーの上に細胞。ガラスは0.17±0.005ミリメートルの厚さと1.5255±0.00015屈折率でカバーして採用する。開始する前に、次のようにカバーガラスを準備します。
- ポリエチレンイミン（PEI）によるSH-SY5Ytransfection
NOTE：シナプス小胞の動態を可視化するために、synapto-pHluorinを含むpCB6ベクターが使用されている。 synapto-pHluorinは、緑色蛍光タンパク質（GFP）16のpH感受性変異体のフレーム融合にすることによって生成された構築物2小胞膜タンパク質シナプトブレビンが広くニューロン9内のシナプス小胞の特性を調査するために採用されている。- トランスフェクションを開始する前に、次のソリューションの10ミリリットルを作る。 1月として最大のようなソリューションをしてください。
- 150 mMのNaCl溶液を作る。 0.01 N HClでpH5.5に調整します。
- 150 mMのNaCl溶液中で、10％のポリエチレンイミン（25 kDaの直鎖PEI）でのPEI溶液を作る。溶液のpHは8.8に上昇する。 0.01 N HClで7.8にpHを調整する。
- めっき24時間後、培地を除去し、1.5 mlのリフレッシュ完全培地。 5％CO 2インキュベーター中で、37℃で細胞を保管してください。
- 層流バイオセーフティキャビネットの下で、1.5mlマイクロチューブに、150 mMのNaCl溶液を25μlと3.5センチメートルペトリ皿当たりPEI溶液100μlにプラスミドDNA3μgのを追加します。
- 渦は、10秒間、次いで室温で30分間DNA / PEI混合物をインキュベートする。
- 慎重に細胞をカバーガラスを含むペトリ皿にDNA / PEI混合物を追加し、穏やかに均等にペトリ皿に試薬を分配するために振る。
- 4時間後、培地を変更し、5％CO 2インキュベーター中、37℃で細胞のO / Nインキュベートする。トランスフェクション後48時間 - イメージング実験24を実行します。
- トランスフェクションを開始する前に、次のソリューションの10ミリリットルを作る。 1月として最大のようなソリューションをしてください。
全反射蛍光顕微鏡2.細胞イメージング（TIRFM）
- イメージングセットアップ
- 図1で説明したセットアップでTIRFイメージングを実行します。それは、電動倒立と、顕微鏡（ 図1、挿入図A）、レーザー光源（ 図1、挿入図B）及びTIRFスライダ（ 図1、挿入図C）。高開口数（NA 1.45アルファプラン-Fluar）100X油、浸対物レンズを通してTIRFM照明リーチ。
- TIRFM照明用、マルチライン（458/488/514 nm）で100 mWのアルゴンイオンレーザーを採用している。モノモードファイバを使用して、TIRFスライダを介して、ビーム経路に直線偏光のレーザ光を導入する。反射光ビーム経路の発光視野絞り平面にTIRFスライダを挿入します。
- 広い視野照明の場合、従来の水銀ショートアークランプHBO白色光に顕微鏡を接続します。スライダーで偏波保持ダブルプリズムは、TIRF照明と白色光の同時組み合わせを保証します。
- 励起フィルター（バンド幅10分の488 nm）を有するレーザ光をフィルタリングするレーザー経路に導入されたフィルターホイールに取り付けられた。採用する高速、ソフトウェア制御、シャッターは、レーザー照射の高速制御を可能にする。 pHluorin分析のために、バンドは50分の525 nmの発光フィルターを通過マウント。画像PROPLUSソフトウェアと冷却高速CCDカメラ上のデジタル画像（512×512ピクセル）をキャプチャします。
- TIRF照明を実現する（図2）
- レーザー、コンピュータ、カメラ、フィルターホイール、及びシャッタコントローラをオンにします。その後、レーザーはウォームアップして安定化する必要があるとして、実験を開始する前に、20分待ってください。
- イメージングの前に、次の解決策の適切なボリュームを作る。
- にバッファリング125のNaCl、5mMのKClを、1.2mMの硫酸マグネシウム、1.2mMのKH 2 PO 4、25mMの4-（2-ヒドロキシエチル）ピペラジン-1-エタンスルホン酸（HEPES）（少なくとも50mlのクレブス（KRH）溶液を作るpH7.4）に、2のCaCl 2、及び6mMのグルコース。
- 80のNaCl、50mMのKCl、1.2mMの硫酸マグネシウム、1.2mMのKH 2 PO 4でのKCl、KRH溶液10ml（pH7.4）で行う、25mMのHEPES（pH7.4に緩衝化）、2のCaCl 2、及び6mMのグルコース。
- トランスフェクトした細胞とガラスカバーを取り外し、適切なイメージングチャンバーに挿入します。チャンバーを組み立て、ガラスの中央にKRH溶液500μlを追加。
- 客観にわたってオイルを追加します。顕微鏡のステージ上イメージング室を配置し、カバーガラスの下に目標を置きます。サンプル上の安全カバーを置きます。
- 落射蛍光モードでは、カバースリップ（上面）に着目し、チャンバーの中心に配置されたトランスフェクトされた細胞を選択する。その蛍光シグナルを明確に80ミリ秒以下の露光時間を使用して記録することができますセルを選択します。
- ソフトウェア制御の下では、 ライブモードで TIRF照明に切り替える。
- TIRF構成を設定するには、サンプルカバー（ 図2B）で、客観的な外に出てくるビームの位置を確認してください。ビームは、tの中央に配置されたとき彼対物レンズ（左図2A）は 、スポット（左、 図2B）TIRFサンプルカバーの中央に表示され、セルは落射蛍光モードで画像化されている（いくつかの焦点面、高いバックグラウンド蛍光; 図2C、左） 。
- 臨界角に達するように、Y方向に集光スポットを移動させる（前方または後方; 図2B、中央 ）TIRFスライダ（ 図1C）に角度調整ねじを使用して。光が臨界角（ 図2A、右）よりも大きな角度で試料面に収束したとき、スポットが消失し、ストレート、細い、集束ラインは、サンプルカバー（右図2B）の中央には明らかである。
- を微調整するTIRF角が細胞試料（ 図2C）を使用します。ビデオで蛍光画像を見る、この段階では、エピ蛍光状の画像が表示されたままです。静かに、TIRF詐欺まで、ネジを移動ditionが達成され、細胞の唯一つの光学面が焦点（カバースリップと接触している、すなわち、原形質膜）であり、これは、高コントラスト（右図2C）と平坦な画像が得られる。
- サンプル画像
- シングルチャネルタイムラプス実験を設定します。光退色最小限に抑えるために、低露光時間と高利得を使用して画像を取り込む。 80ミリ秒 - 適切な露光時間が40との間である。 2 Hzのサンプリング周波数 - 1で画像を取得する。小胞の動態は、より高い周波数（10 Hz）の時より良く理解サンプリング場合があります。観測の定期的な時間は、通常2分である。
- TIRFMモードでKRHソリューションとレコード細胞の500μlのを追加します。これは静止状態である。時間の連続画像を保存します。
- （レーザパワー、時間暴露、フレーム番号）を安静の同じ条件下で同じ細胞とレコードに焦点を当てる。 5つのフレームの後、塩化カリウム、KRH溶液500μlを追加し、チャンバー内のKClを保つ。これが刺激された状態です。時間の連続画像を保存します。
3.画像解析とデータ処理
注：画像を分析するために、マクロは、画像解析ソフトウェアの既存の機能に基づいて、研究室で開発されてきた。同じようなマクロは、オンライン（材料および装置の表に記載されているURL）が利用可能である。
- 蛍光強度の定量化
- 映画の過程にわたって、画像の関心領域（ROI）における蛍光強度の定量化のための「シーケンス蛍光強度」マクロを使用する。
- 時系列の画像を開きます。マクロメニューに移動し、 '配列蛍光強度」を選択します。 「分析」ウィンドウで、「ROIを選択」が表示されます。
- ROIを作成するには、メニューで選択ツールのいずれかを選択します。スポット（背景ROI）なしで細胞膜の領域での3のROIを配置します。 THIを採用の"背景ROI」光退色を評価し、融合事象の分析（ 図3A）のためのしきい値を設定する。
- 退色補正、閾値判定（図3B）
- 光退色を評価するために、蛍光強度の行「バックグラウンドのROI」、（ 図3Baの ） を開きます。初期強度値（F0）（F / F0）（ 図3Bbと ）、各フレーム内の蛍光強度値を正規化する。値を平均する。
- 平均データを強調表示し、グラフのメニューオプションを使用して、ラインプロットを作成します。
- データ分析メニューから、プロット解析ダイアログを開き、「トレンドライン」を選択します。回帰のタイプを選択します。 「指数関数」回帰を設定します。次に、「チャート上の表示方程式」を選択します。グラフウィンドウでは、指数方程式は、 図3BC（、表示され、パラメータ値が自動的に割り当てられます
- 以下のよう各フレームの強度値に指数関数補正を適用します。
FN（補正）のFn / EXP（-n * A）=
のFn =フレームnにおいて測定された実験的な蛍光強度。 nはフレーム数、 =漂白係数（定数による退色に対する強度損失の速度を表現する。 図3BD）。 - しきい値を設定するには、正規化された補正後の「バックグラウンドROI」を開いて、平均蛍光シグナルとその標準偏差（SD）を計算する。 3 SDプラス平均値が閾値（ 図3BE）を表している。データ分析のためにこのしきい値を使用してください。
- 半自動手順を使用して、融合事象の選択
- 画像解析ソフトウェアとの時系列画像を開きます。アクティブな画像シーケンスにガウスフィルタを適用します。
- 選択を可能にするツール「オブジェクトを数える」またはマクロを使用して画像を分析画素が定義された範囲内の平均蛍光強度を持つ物体。強度が閾値関数を（関心領域を強調するために、バーメニューにセット尺度→しきい値を行く）を使用して、手動でレンジを設定します。適切な閾値は、ローカル蛍光バックグラウンドシグナル上の30％である。
- マクロは、以下の基準を満たすオブジェクトのみを選択するための「オブジェクトのフィルタ」を適用します。
- 側面のための範囲はオプション（minとmax包括的な）を適用します。アスペクトは、長軸とオブジェクトと等価楕円の短軸の間の比率を報告します。アスペクトは常に≥1。適切な値は、分= 1、MAX = 3である。
- 直径の範囲を適用します。 直径が2度の間隔が2の輪郭点を結ぶと、オブジェクトの重心を通過する時に測定された直径の平均長さをレポートします。ピクセル単位で範囲を設定します（または以下で、キャリブレーションシステムを使用している場合）。
- preliminに最適な範囲を定義する進の実験：手動で興味のあるスポットを選択し、プロットプロファイル機能を使用してそれらの直径を測定します。
- 「表示オブジェクト」を選択します。選択したオブジェクトがTIRFMの画像（ 図4B）に重畳表示されます。
- 分析ですぐに信号の著しい損失（過渡スポット）に続いて蛍光強度の（一から三フレーム）短い一過性の上昇を示してのみスポットを含めます。選択された小胞/スポット（実験のROI）の周りに放射状にROI約スポット径を作成するために円形の選択を使用する。手動でこの手順を実行します。
- のROIを選択した状態で、映画の過程で各ROIの平均蛍光強度を計算する。
- データ分析（図3C-D）
- スプレッドシートへの各「実験的なROI」で測定された蛍光変化の時間経過をエクスポート。 （ 図3DA）。初期蛍光強度（F / F0）、（ 図3dBの ）各フレームにおける強度値を正規化する。
- ステップ3.2.4（ 図3DC）で報告されているように、各フレームにおける強度値に指数関数補正を適用します。
- 融合イベントの合計数（ピーク数）を計算するために、それぞれの融合が生じる時間（ピーク幅）と蛍光ピーク（ピーク高さ及びAUC）の振幅は、スプレッドシートまたは数学パッケージを使用して、論理関数を適用する。論理式を用いて融合事象分析の例を図3DDと3DEに報告されている。
- 融合事象として小胞の原形質膜に融合し、得られたピークとして（±3SD平均背景蛍光強度）が閾値を超える蛍光強度の増加を想定している。
- 最後に、各ピークの最初のxの値との差であるピーク幅を計算する。 1 /（サンプリング周波数）のためにこの値を乗算する。この値aを考慮する小胞の再酸性化し、リサイクル（ 図3DD）の前に、原形質膜での小胞融合および接着の時間だ。
- しきい値以上の値の合計として全細胞AUCを計算します。自発（休息）への記録時間中にネット蛍光変化または誘発（誘導）シナプス活性として、この値を考慮してください。
- 各ピークの最大y値と閾値との差としてのピーク高さを計算する。融合型（同時/逐次的融合対単一または一過対フル融合）を示すものとして、この値を考慮してください。
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Representative Results
記載されTIRFイメージングとデータ分析手順は、セルラーシステムにおける小胞のダイナミクスを研究するために設計されています。この技術は、融合事象と神経伝達物質小胞ダイナミクス17シグナル伝達分子と薬剤の効果を決定するために用いることができる。 GFPタグ付き原形質膜タンパク質を用いて、TIRFM分析はグリア細胞および上皮細胞18,19にGFPタグ付きグルタミン酸輸送体の構成的輸送を特徴づけるために用いられている。
報告された撮像手順及びデータ分析戦略を検証するために、融合事象は、基礎の下に記録され、synapto-pHluorinでトランスフェクトしたSH-SY5Y神経芽細胞腫細胞において、（カリウム誘発性脱分極）の条件を刺激した。 （ ビデオ1、2、それぞれ）。二つの異なる分析が実行される：全細胞（ 図4）と単一小胞の分析（ 図5）。
全細胞分析MEA細胞における融合事象と刺激によって誘導された結果として正味の蛍光変化の総数をスレス。 図4では、synapto-pHluorinトランスフェクトした細胞が休息に計上され、同じ実験プロトコル（長時間露光、レーザパワー、等）を使用して、条件（KClの刺激）を刺激した。 図4（a）は synapto-pHluorinは上に散在する蛍光涙点に蓄積することを示している細胞膜。文献に記載されるように、微弱な蛍光シグナルは、原形質膜9にも存在する。この信号は、画像化される細胞を同定するために有用である。 図4Bに、紙（セクション3.3）に記載した自動手順で選択されたスポットは、 図4Aに報告されたTIRFMイメージに重畳されている。 図4Cは、安静時の条件の下で選択されたスポットの正規化された蛍光強度プロファイルを示す。これらのプロファイルは、同じような蛍光のint型の個々のピークの存在を明らかにensity記録中の種々の時点で出てくると、おそらく時折膜と融合した小胞に対応する。 図4Dは、KClの刺激の効果を示す。予想されたように、25のKClとの脱分極は、迅速な応答を誘発し、いくつかの非常に明るい蛍光涙点は、細胞膜で表示されます（ ビデオ2）。これらの涙は、形質膜の下に存在するシナプス小胞の「容易に剥離可能な「プールに対応しています。個々のスポットに対応して測定された蛍光変化の時間経過分析は、分泌刺激（ 図4Dおよび4F）の適用後に突然出現する可変蛍光強度のピークの存在を示す。記録期間中、全細胞分析の結果を図4E-Hで報告されている。 KClの刺激は（融合イベントの数が急速に著しい増加（休息条件の上2.5倍の増加）を引き起こすこのように大規模な神経伝達物質の放出を示す図4E-F）で処理し、得られた蛍光強度の変化（静止状態にわたって9.3倍の増加）（ 図4G-H）。
シングルピーク分析は、単一融合事象（ 図5）の特徴付けを可能にする。 図5Aは、シーケンシャルを示す 安静時の条件の下で記録された代表「実験的なROI」の画像。特定のハイライトsynapto-pHluorinは、TIRFゾーンの下膜と融合小胞のラベル。二つのフレームの後、蛍光シグナルが可能性小胞の取得および再酸性化を示し、消えます。関心領域の正規化された蛍光プロフィール（ 図5B）は、TIRFゾーン内のスポットの出現に対応して蛍光シグナルの増加を測定する。逆に、蛍光がスポット消失した後に基礎レベルに戻ります（単一のピーク平均幅1.91±0.32秒。平均ピーク高さ0.042±0.005正規化された蛍光強度）。 図5C及び5Dは、KClの刺激と対応する正規化された蛍光強度プロファイルの下に記録された「実験的なROI」の連続した画像を表示します。のKCl脱分極後にTIRFゾーン内と外小胞の動きの増加に注意してください。
40融合事象が選択され、安静に分析し、条件を刺激する。以下のパラメータを測定する：平均ピークAUC、ピーク幅と高さを。ピーク幅を再酸性化やリサイクル、 図5Gの前に小胞融合、アタッチメントとエンドサイトーシスの時間を指定します。ピーク高さは、小胞融合、 図5Fによって誘発される蛍光強度の変化を測定する。これらのパラメータの変化は、異なるエキソサイトーシス機構を示している。シングルピーク分析は、KClを脱分極が修飾することが明らかになった原形質膜への小胞の融合のモード。実際、平均ピーク面積対応のあるt検定、 図によって（静止状態の上3.8±0.2倍に増加し、t検定によるP <0.01、 図5E）、ピーク高さ（2.75±0.03倍に増加し、P <0.01で増加5F）及びt検定によって幅（2.6±0.5倍の増加、P <0.05。 図5G）は 、刺激された条件下で検出される。いくつかの説明は、これらの結果のために想定することができる。可能性はKClを脱分極は細胞の制約領域での小胞の同時および/または連続的な融合を引き起こすことである。別の説明は、強力な脱分極が過渡融合対完全融合を好むということです。基底条件下では、一般的なメカニズムは一時融合です：融合孔を形成、小胞が増加し、蛍光シグナルのpHが表示されますが、気孔はすぐに閉じて、このように急速な再酸性化とリサイクルを可能にします。下刺激された条件は、小胞は完全に原形質膜、ピーク高さとより長い期間を必要とすることが膜小胞コンポーネントの再捕捉、再酸性化やリサイクル等の幅の増加と融合する。同様の結果は、最近の内分泌β細胞20におけるシナプスのような微小胞のエキソサイトーシスを解析して得られた。
セットアップ図1. TIRF顕微鏡。TIRF顕微鏡システムの概略図と画像（挿入図）。セットアップは、アクシオオブザーバーZ1電動倒立顕微鏡（A）、マルチライン100 mWのアルゴンイオンレーザー（B）及びTIRFスライダ（C）を含む。レーザー光（緑色のライン）および白色光（黄線）が示されている。細胞を、100×油浸対物レンズを用いて画像化される。デジタル画像を冷却RetigaSRVファストCCDカメラでキャプチャされている。参照焦点講師モジュール、発光（10分の488 nm）を励起（バンドパス50分の525 nm）のフィルタ、コリメータ（L1）及び（L2）レンズが示されている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
客観、カバースリップ、サンプルとレーザー光（青線）の位置を示すTIRFMの構成（A）の回路図漫画の取得図2。 左、励起ビームは、カバースリップ·サンプル·インタフェースを介して直接移動する。サンプルは落射蛍光モードと励起される。サンプルとセンター 、励起ビームを形成する入射角が臨界角よりも小さい光が可変角度で試料を照明する。 右 、励起ビームはincidを形成する臨界角より大きい角度ENT、光が完了バック対物レンズに反射し、エバネッセント場は、サンプル中を伝搬する。サンプルカバーと励起光（青色の円）の位置を示す（B）漫画、すなわちTIRF照明（ 右 ）に向かって（ 左 ）落射蛍光からの移行中に、対物レンズから出射する。 （C）ライブSH-SY5Y細胞におけるエピ蛍光（ 左）とTIRFM synapto-pHluorin蛍光（ 右）画像。スケールバー：10μmで、この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3.データ処理と分析。ライブSH-SYでsynapto-pHluorin蛍光の（A）TIRFMイメージ5Y細胞。緑色の四角形は、代表的な「バックグラウンドROI」を示す。スケールバーは10μm。 （B）背景ROIのためのワークフローを提案した。上から下へ：。。。。、背景ROIで測定された蛍光強度変化の時間経過を、初期蛍光値（F / F0）の蛍光変化b の正規化、指数回帰のCアプリケーションと; d補正光退色のための、 E。しきい値評価（透明グレーの四角）。ライブSH-SY5Y細胞におけるsynapto-pHluorin蛍光の（C）TIRFM画像。白い四角は、代表的な「実験的なROI」を示している。スケールバーは10μm。 （D）は、実験的なROIのためのワークフローを提案した。上から下へ：蛍光強度変化の時間経過を、初期蛍光値（F / F0）のBデータ正規化するステップと、c。。。 ;論理的な機能のデ·アプリケーションはピーク数、AUC、幅と高さを検出する。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図4.全細胞分析。ライブSH-SY5Y細胞におけるsynapto-pHluorin蛍光の（A）TIRFMイメージ。細胞は、休憩の下で記録され、（1 Hzでサンプリングされた）（25のKClアプリケーション）の条件を刺激する。スケールバー：10μmである。自動手順によって同定した（B）のスポットはTIRFM画像に重畳（緑色）を示している。静止条件下で全細胞自動手順によって選択されたスポット（C）正規化された蛍光強度プロファイル（F / F0）。 （D）Normaliz刺激された条件下で、選択のスポット編蛍光強度プロファイル（F / F0）。トレース上のバーは、KClのアプリケーションを示している。 （EH）イベントと（青）及び刺激（赤）条件休止条件下で全細胞に記録された蛍光強度変化の数。 （E）ヒストグラムは、セルに記録融合事象の総数を示す。 （F）融合事象の時間的分布。 （G）細胞全体（総AUC）で発生するpHluorin蛍光強度の変化を示すヒストグラム。 （H）時間の関数としての累積pHluorin蛍光強度の変化を示す曲線が。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
synapto-pHluorinを表現するビデオ2. SH-SY5Y細胞は、（1 Hzでサンプリングされた）刺激を受けた条件で記録されている。KClを灌流が示されている。 このビデオを見るにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
本論文では、画像へのプロトコルを提示し、蛍光cDNAコードベクトルとTIRFMを使用して、分泌する細胞内小胞のダイナミクスを分析する。 TIRFMによる成功したイメージングの重要な要素は、小胞のリリースとリサイクルの遺伝的に符号化された光の指標と細胞モデルと細胞トランスフェクションの選択である。
TIRFMは、膜融合事象の安定した可視化を可能にするために、ガラスカバーに付着し、十分に平坦に成長する細胞のために理想的に適している。それらの輸送、融合、およびエンドサイトーシスを撮像し、単一小胞レベルで定量することができるように、小胞は、理想的には、細胞内に分散されるべきである。残念ながら、神経細胞は、これらの基準を満たしていない：それらは、頻繁に互いの上に交差する神経突起を不規則な形状を有しており、融合が優勢に小さな領域（活性領域）に集中している小胞。これらの領域のためのニューロンの初代培養物においてTIRFMによってベシクルのダイナミクスを研究することは非常に困難である。
異なるトランスフェクション試薬および手順の可用性がSH-SY5Y中で、さらには主要な神経細胞培養中でトランスフェクション、ほぼ標準的な手順になりますが、注意が分析し、TIRFMデータを解釈、記録するときに注意する必要があります。 TIRFMは、生細胞内膜またはその近傍で起こるプロセスに関する情報の収集を容易にし、または提出されたエバネッセント出入りタグ付きタンパク質に由来する蛍光シグナルの変化を検出することにより、個々の分子事象の分析を可能にする。しかし、いくつかの要因は必ずしもエキソ/エンドサイトーシスのイベントを暗示することなく、このゾーンの蛍光シグナルを変更することができ、これは取るされなければならないnは考慮にデータを記録し、分析する。これらの中でも特にエバネッセント場とフォア修正の下で焦点面に関するものを記録中の細胞の形態変化は、ある。
形態変化
TIRF技術の高解像度は、ガラス界面11から100nmの深さで、エバネッセントフィールド内のフルオロフォアの励起に依存する。これは、非常に薄い領域であると知覚形態学修飾は、焦点が合ってセル面を変更することが期待される。これは特に、いくつかのプロセスを提示し、顕著な波打ちを示し、神経細胞および細胞に適用されます。これらの細胞では、記録時のカバースリップと接触して膜面積は不規則であり、迅速に変更することができ、したがって、エキソサイトーシスの不正確な評価を生じさせる。このため、可能な限り、それは調査の細胞モデルを選択することが重要である。セルmovemeを制限するには国税庁は、細胞外マトリックスタンパク質またはポリ-1-リジンコーティングガラスカバーに役立つことができる。しかし、人はこれらの基板は、細胞の挙動と小胞ダイナミクスを変更することができることを心に留めておく必要があります。
記録中の形態学的修飾の他の可能な源は、細胞刺激、溶液の添加、温度変化である。大規模な小胞の放出（ すなわち、塩化カリウム脱分極）を誘導することができるの刺激は、多くの場合、明らかにTIRFゾーンの下で細胞表面を修飾する細胞収縮を引き起こす。これは予備実験で正確に刺激の種類、濃度、及び印加時間を選択することが重要である。
ピペットと浴中の溶液の単純な導入は、独立して、組成物の、剪断応力により細胞形態の変形を引き起こすことがある。このアーティファクトを解決するために、ノイズを低減する可能性が真空ポンプに接続された灌流システムを使用して、好ましくは、培地を加える。
蛍光色素分子
蛍光シグナルの変化は、また、記録時に蛍光体の変形に起因し得る。最も重要なのは、23を光退色されている。光退色はフォアの光子誘導分解である。これは、一般的に時間をかけて観察試料の蛍光と調光の永久的な損失を引き起こす。 TIRFMでは、唯一のフルオロフォアは、エバネッセント場の起点に対して閉じ光退色することができ、それらは、このフィールドに存在するため、GFPタグ付きの膜タンパク質を退色される。蛍光発光強度のフェーディングの防止は非常に高品質の画像を得ることが重要であり、定量的な蛍光顕微鏡のために必須である。妥当な近似では、一定の環境下で所定の分子のために、光退色は、時間と励起源への暴露のサイクルに依存します。多くの場合において、光退色を制御記録23を実行することによって、その評価及びその補正が容易になり、単純な指数関数的減衰関数に従う。異なる補正式/マクロは（材料や機器の表を参照）オンラインで入手できます。プロトコルでシンプルexponentiら機能が使用されている。
光退色を克服するためのいくつかの戦略があります。良い戦略は、高い光安定性を持つ蛍光団を使用して、例えば、ソースに光退色を防ぐためです。残念ながら、今は、DNAにコードされたプローブの選択はまだ限られている。この場合、光退色に起因する活性の損失は、画像取得中に最小限に抑えることができ、入力光とサンプリング周波数の光子エネルギーを光暴露時間スパンを最適化することができる。
pH感受性プローブを用いた際に、記録時のフルオロフォア修飾のさらなる供給源は、培地中のpHシフトである。記録チャンバーの液量は、通常、非常に低く、薬物適用、細胞活性および代謝、特に細胞とカバースリップの表面との間の小さな体積で、培地のpHを変更することができる。これは、次に、このようにしてオーバー/アンダー推定胞の再を引き起こし、pHluorin蛍光シグナルを変化させるリース。例えば、強い刺激は、細胞質ゾルのカルシウム依存性の酸性化につながる可能性があり、したがって、蛍光シグナル24で誇張された増加をもたらす、細胞外空間にアルカリ化を反映した。
この問題を回避するには、緩衝溶液を使用して、予備実験で確立されたプロトコルによって導入される可能性のpHの変更を監視する。誘発小胞の放出をより正確に推定するためのデータを分析する際に、融合事象なしに、細胞表面の領域で蛍光シグナルを監視し、調整係数として、この領域内の蛍光シグナルの修飾を使用する。
結論として、小胞融合および動態を監視し、分析するための方法が記載されている。この技術は、タンパク質の役割とそのpathogeniを明らかにするために、エキソ/エンドサイトーシスの様々なステップを視覚化し、切開する異なる細胞型（神経細胞および内分泌細胞）で使用することができC変異体小胞の動態の調節および構成的および調節性エキソサイトーシスを標的とする薬剤の作用機序を明らかに。
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Acknowledgments
著者は、Elianaのディカイラーノ（ポスドクフェローシップ）とステファニアモレッティ（博士フェローシップ）への援助をUniversitàデッリ大学地区ミラノを承認したいと思います。この作品は、CPに大学の研究プログラムPURによってサポートされていました
私たちは、技術支援のためにpHluorinための教授ジェレミーM.ヘンリー、生化学、ブリストル大学の大学院、イギリス、構築し、博士Dottiフランチェスコデータ分析をアシストするために、そしてシルビアMarsicanoに感謝したいと思います。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Axio Observer Z1 |  Zeiss |
491912-9850-000 | inverted microscope |
| Multiline Argon Laser Lasos 77 | Lasos |
00000-1312-752 | multi-line (458/488/514 nm), 100 mW argon-ion laser |
| Laser TIRF slider | Zeiss |
423681-9901-000 | |
| 100X Objective | Zeiss |
421190-9900-000 | Oil, NA 1.45 Alpha-Plan |
| CCD Camera RetigaSRV Fast 1394 | QImaging |
||
| LAMBDA 10-3 optical filter changer with SmartShutter | Sutter Instrument Company |
||
| Software | |||
| Image ProPlus 6.3 Software | Media Cybernetics |
spot selection, ROI selection, fluorescence intensity determination | |
| Excel | Microsoft |
photobleaching correction, whole-cell and single-vesicle analyses | |
| GraphPad Prism 4.00 | GraphPad Software, Inc. |
statistical analysis | |
References
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