TIRFM e GFP-sonde pH-sensibile per valutare Neurotransmitter Vesicle Dynamics in cellule SH-SY5Y neuroblastoma: cell imaging e analisi dei dati
Summary
This paper provides a method for investigating neurotransmitter vesicle dynamics in neuroblastoma cells, using a synaptobrevin2-pHluorin construct and Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy. The strategy developed for image processing and data analysis is also reported.
Abstract
Vescicole sinaptiche rilasciano neurotrasmettitori alla sinapsi chimiche attraverso un ciclo dinamico di fusione e di recupero. Monitoraggio attività sinaptica in tempo reale e sezionare le diverse fasi di eso-endocitosi a livello di singolo-vescicole sono fondamentali per la comprensione funzioni sinaptiche in salute e malattia.
Geneticamente codificato sonde pH-sensibili direttamente mirate a vescicole sinaptiche e Total Internal Reflection microscopia a fluorescenza (TIRFM) forniscono la risoluzione spazio-temporale necessario per seguire la dinamica delle vescicole. Il campo evanescente generato per riflessione interna totale può eccitare solo fluorofori collocati in uno strato sottile (<150 nm) sopra il coperchio di vetro su cui le cellule aderiscono, esattamente dove i processi di eso-endocitosi avvengono. Le immagini ad alto contrasto risultanti sono ideali per le vescicole monitoraggio e l'analisi quantitativa di eventi di fusione.
In questo protocollo, SH-SY5Y umano ncellule euroblastoma sono proposti come modello utile per studiare il rilascio dei neurotrasmettitori a livello singolo vescicole da TIRFM, a causa della loro superficie piana e la presenza di vescicole dispersi. Vengono forniti i metodi per la coltivazione SH-SY5Y come cellule aderenti e per loro trasfezione con Synapto-pHluorin, così come la tecnica per effettuare TIRFM e imaging. Infine, una strategia che mira a selezionare, contare e analizzare gli eventi di fusione a livello di cellule intere e single-vescicola è presentato.
Per convalidare l'approccio di analisi procedura di imaging e di dati, le dinamiche di vescicole pHluorin-tag vengono analizzati sotto il riposo e stimolati (depolarizzante concentrazioni di potassio) condizioni. Depolarizzazione della membrana aumenta la frequenza degli eventi di fusione e provoca un aumento parallelo del segnale di fluorescenza netto constatato cellula intera. Analisi singola vescicola rivela modifiche di comportamento fusion-evento (altezza maggiore di picco e larghezza). Questi dati suggeriscono tha depolarizzazione potassio induce non solo un massiccio rilascio di neurotrasmettitore, ma modifica anche il meccanismo di fusione della vescicola e riciclaggio.
Con la sonda fluorescente caso, questa tecnica può essere impiegata in sistemi cellulari diversi per sezionare i meccanismi di secrezione costitutiva e stimolata.
Introduction
Trasmissione sinaptica chimica tra neuroni è un importante meccanismo di comunicazione nel sistema nervoso. Essa si basa sul rilascio di neurotrasmettitori attraverso un ciclo dinamico di fusione della vescicola e recupero nel sito presinaptico. Molte delle proteine coinvolte nella dinamica vescicole sono stati identificati; tuttavia, il loro contributo specifico al fenomeno resta da chiarire 1.
La nostra comprensione è in parte limitata dal fatto che i dosaggi più utilizzati per eso / endocitosi non sono sempre la più appropriata. Diversi studi relativi alla fusione delle vescicole e dinamiche si basano su tecniche elettrofisiologiche. Questa tecnica fornisce una risoluzione temporale ottimale ed è eccellente per studiare la fusione iniziale delle vescicole alla membrana plasmatica, ma è in grado di rilevare molti degli eventi molecolari alla base che supportano la funzione presinaptica. La microscopia elettronica, dall'altro lato, fornisce la migliore morphologicaDescrizione l di ogni passo singolare, ma l'aspetto dinamico della manifestazione non può essere catturato, perché i campioni devono essere fissati in modo da analizzare.
L'avvento di nuove tecniche di registrazione ottica 2,3, in combinazione con i progressi nella fluorescente sviluppo sonde molecolari 4-6, consente la visualizzazione dei processi di esocitosi in cellule vive, fornendo così nuovi livelli di informazioni sulla struttura e la funzione sinaptica.
Gli studi iniziali sfruttati coloranti attività-dipendente stirilici (FM1-43 e coloranti organici relativi) 7,8. State-of-the-art tecniche di imaging utilizzano varianti pH-sensibili della proteina verde fluorescente (GFP) (pHluorin) legato alle vescicole luminali proteine 9. Queste sonde sono normalmente spenti quando presenti nelle vescicole a causa del basso pH luminale. Dopo la fusione con la membrana plasmatica, l'interno della vescicola è esposta allo spazio extracellulare neutra, il pH aumenta bruscamente, allevia la tempra protone-dipendente di pHluorin e appare rapidamente il segnale fluorescente. Come la variazione pHluorin è più veloce l'evento di fusione, monitorando aumenti fluorescenza, vescicole fusione con la membrana può essere misurato e analizzato. Poiché molecole pHluorin-tag superficie sono endocitosi, il segnale di fluorescenza successivamente ritorna al livello basale, quindi lo stesso costrutto può anche essere usato per monitorare riciclo 9 vescicole.
Mentre il pH-sensore vescicole-tagged assicura la visualizzazione solo di quelle che in realtà vescicole si fondono con la membrana plasmatica, imaging ad alta risoluzione spaziale e temporale è richiesto di descrivere in dettaglio i passi necessari nei processi endocitiche eso /. La tecnica ottico che fornisce la risoluzione spazio-temporale necessaria è riflessione interna totale microscopia a fluorescenza (TIRFM), un'applicazione di microscopia a fluorescenza 10.
"> Riflessione interna totale si verifica all'interfaccia tra il vetro di copertura antiscivolo e il campione. Quando il percorso luce raggiunge il vetro di copertura antiscivolo con un angolo di incidenza maggiore dell'angolo critico, la luce di eccitazione non è trasmesso nel campione, ma è completamente riflessa. In queste condizioni, un evanescenti forme d'onda della luce all'interfaccia e si propaga nel mezzo con meno densità ottica (campione). Come l'intensità del campo evanescente decade esponenzialmente con la distanza dall'interfaccia (con una profondità di penetrazione circa 100 nm) solo i fluorofori in vicinanza vicina alla copertura antiscivolo può essere eccitato mentre quelli più lontani dal confine no. In cellule trasfettate con GFP-costrutti, questa profondità corrisponde a proteine espresse sulla membrana plasmatica o in strutture vescicolari avvicinandosi. Come fluorofori nell'interno delle cellule non possono essere eccitati, la fluorescenza di fondo è ridotto al minimo, e l'immagine con un segnale alto / sfondo ratio si forma 11.Diverse caratteristiche rendono TIRFM la tecnica di scelta per il monitoraggio vescicole dinamica. Il contrasto perfetta e l'alto rapporto segnale-rumore rapporto permettono di rilevare segnali molto bassi derivanti dalle singole vescicole. Basato su chip di acquisizione delle immagini in ogni fotogramma fornisce la risoluzione temporale necessario per rilevare i processi altamente dinamici. Infine, l'esposizione minima di cellule a luce in qualsiasi altro aereo nel campione riduce fortemente fototossicità e consente la registrazione lungo time-lapse durata 12.
L'analisi dei dati rimane l'aspetto più impegnativo e cruciale di questa tecnica. Il modo più semplice per monitorare fusione della vescicola è quello di misurare l'accumulo di proteine reporter fluorescente sulla superficie cellulare, nel tempo 13. Con l'aumento della fusione, gli aumenti netti segnali di fluorescenza così. Tuttavia, questo metodo può sottostimare il processo, in particolare in grandi cellule ed in condizioni di riposo,perché i processi endocitosi e photobleaching compensare l'aumento di intensità di fluorescenza a causa vescicole esocitosi. Un metodo alternativo è quello di seguire ogni singolo evento di fusione 14. Quest'ultimo metodo è molto sensibile e può rivelare importanti dettagli circa i meccanismi di fusione. Tuttavia, esso richiede la selezione manuale di singoli eventi, perché procedure completamente automatizzate per seguire vescicole e di registrare la fluttuazione dei loro segnali fluorescenti non sono sempre disponibili. Osservazione delle dinamiche vescicole richiede celle di campionamento ad alta frequenza. Ciò genera una grande quantità di dati che può difficilmente essere analizzati manualmente.
La proposta di questo lavoro è quello di ottimizzare la tecnica di imaging TIRFM per monitorare il basale e rilascio di neurotrasmettitore stimolato nella linea cellulare di neuroblastoma SH-5YSY, e di descrivere, passo-passo, una procedura definita in laboratorio per analizzare i dati, sia a livelli di cellule intere e single-vescicole.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo articolo presenta un protocollo di immagine e analizzare vescicole dinamica in cellule secernenti, utilizzando vettori cDNA codificati fluorescenti e TIRFM. Gli elementi chiave del successo di imaging da TIRFM sono la selezione del modello di cellulare e trasfezione delle cellule con indicatori ottici geneticamente codificate di rilascio delle vescicole e riciclo.
TIRFM è ideale per le cellule in crescita aderenti a una copertura in vetro e sufficientemente piatto per permettere la v…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori desiderano ringraziare l'Università degli Studi di Milano per il sostegno a Eliana Di Cairano (borsa di studio post-dottorato) e Stefania Moretti (Ph.D. fellowship). Questo lavoro è stato sostenuto dal Programma di Ricerca dell'Università di PUR CP
Vorremmo ringraziare il Prof. Jeremy M. Henley, Facoltà di Biochimica, Università di Bristol, Regno Unito, per il pHluorin costruire e Dr. Francesco Dotti per l'assistenza nell'analisi dei dati, e di Silvia Marsicano per l'assistenza tecnica.
Materials
| Equipment | ||||
| Axio Observer Z1 | Zeiss | 491912-9850-000 | inverted microscope http://www.zeiss.com/microscopy/en_de/products/light-microscopes/axio-observer-for-biology.html#introduction |
|
| Multiline Argon Laser Lasos 77 | Lasos | 00000-1312-752 | multi-line (458/488/514 nm), 100mW argon-ion laser http://www.lasos.com/products/argon-ion-laser |
|
| Laser TIRF slider | Zeiss | 423681-9901-000 | http://www.zeiss.com/microscopy/en_de/products/imaging-systems/single-molecular-imaging-laser-tirf-3.html | |
| 100x Objective | Zeiss | 421190-9900-000 | Oil, NA 1.45 Alpha-Plan https://www.micro-shop.zeiss.com/?l=en&p=us&f=o&a=v&m=a&id=421 190-9900-000&ss=1 |
|
| CCD Camera RetigaSRV Fast 1394 | QImaging | http://www.qimaging.com/products/datasheets/Retiga-SRV.pdf | ||
| LAMBDA 10-3 optical filter changer with SmartShutter | Sutter Instrument Company | http://www.sutter.com/IMAGING/lambda103.html | ||
| Software | ||||
| Image ProPlus 6.3 Software | Media Cybernetics | spot selection, ROI selection, fluorescence intensity determination http://www.mediacy.com/index.aspx?page=IPP |
||
| Excel | Microsoft | photobleaching correction, whole-cell and single-vesicle analyses http://office.microsoft.com/it-it/excel/ |
||
| GraphPad Prism 4.00 | GraphPad Software, Inc. | statistical analysis http://www.graphpad.com/scientific-software/prism/ |
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