Abstract
שלפוחית סינפטית לשחרר נוירוטרנסמיטרים בסינפסות כימיות דרך מחזור דינמי של היתוך ואחזור. ניטור פעילות הסינפטית בזמן אמת ולנתח את השלבים השונים של Exo-אנדוציטוזה ברמה חד-השלפוחית הם קריטיים להבנת פונקציות הסינפטי בבריאות ובחוליים.
גנטי מקודד בדיקות pH רגיש ישירות ממוקדות לשלפוחית סינפטית וסכתי פנימית השתקפות מיקרוסקופ פלואורסצנטי (TIRFM) מספקים רזולוציה המרחב ובזמן דרושה כדי לעקוב אחרי דינמיקת שלפוחית. שדה החלוף שנוצר על ידי השתקפות פנימית מוחלטת יכול רק לעורר fluorophores ממוקם בשכבה דקה (<150 ננומטר) מעל מכסה הזכוכית שבו תאים לדבוק, בדיוק איפה התהליכים של Exo-אנדוציטוזה יתקיימו. תמונות בחדות גבוהה וכתוצאה מכך מתאימות בצורה אידיאלית לשלפוחית מעקב וניתוח כמותי של אירועי היתוך.
בפרוטוקול זה, n אדם SH-SY5Yתאי euroblastoma מוצעים כמודל בעל ערך ללימוד שחרור הנוירוטרנסמיטר ברמה חד-השלפוחית על ידי TIRFM, בגלל המשטח השטוח שלהם ואת הנוכחות של שלפוחית התפזרה. השיטות לגידול SH-SY5Y כתאים חסיד ולtransfecting עם synapto-pHluorin מסופקות, כמו גם את הטכניקה לבצע TIRFM והדמיה. לבסוף, אסטרטגיה שמטרתה לבחור, לספור, ולנתח אירועי היתוך ברמות כל תא וחד-השלפוחית מוצגת.
כדי לאמת את גישת ניתוח הליך ההדמיה ונתונים, הדינמיקה של שלפוחית מתויגת pHluorin מנותחים תחת מנוחה ומגורה (depolarizing ריכוזי אשלגן) תנאים. שלילת קוטביות הממברנה מגבירה את התדירות של אירועי היתוך וגורמת להעלאה מקבילה של אות הקרינה הנקי שנרשמה בכל תא. ניתוח חד-שלפוחית מגלה שינויים של היתוך-אירוע התנהגות (גובה שיא מוגבר ורוחב). נתונים אלה מצביעים על הבשלילת קוטביות אשלגן לא רק גורם לשחרור הנוירוטרנסמיטר מאסיבי, אלא גם משנה את המנגנון של איחוי שלפוחית ומחזור.
עם הבדיקה הניאון המתאימה, טכניקה זו יכולה להיות מועסק במערכות סלולריות שונות לנתח את מנגנוני הפרשה מכוננת ומגורה.
Introduction
שידור סינפטי כימי בין תאי העצב הוא מנגנון עיקרי של תקשורת במערכת העצבים. היא מסתמכת על שחרורו של נוירוטרנסמיטורים דרך מחזור דינמי של איחוי שלפוחית ואחזור באתר presynaptic. רבים מהחלבונים מעורבים בדינמיקת שלפוחית זוהו; עם זאת, התרומה הספציפית שלהם לתופעה עדיין לא הבהירה 1.
ההבנה שלנו מוגבלת וחלקו על ידי העובדה שהמבחנים הנפוצה ביותר לexo / אנדוציטוזה לא תמיד המתאימים ביותר. מספר מחקרים הקשורים לאיחוי שלפוחית ודינמיקה מסתמכים על טכניקות אלקטרו. טכניקה זו מספקת פתרון זמני אופטימלי והוא מצוין לחקירת ההיתוך הראשוני של שלפוחית לקרום הפלזמה אבל אינה מסוגל לזהות רב של האירועים המולקולריים שבבסיס שתומכים בפונקצית presynaptic. במיקרוסקופ אלקטרונים, בצד השני, מספק morphologica הטוב ביותרl תיאור של כל צעד יחיד, אבל בהיבט הדינמי של האירוע לא יכול לנפול בפח, כי דגימות חייבות להיות קבועה כדי להיות מנותחת.
הכניסה של טכניקות חדשות הקלטה האופטית 2,3, בשילוב עם התקדמות בפיתוח בדיקות מולקולריות ניאון 4-6, מאפשרת הדמיה של תהליכי exocytic בתאים חיים, ובכך לספק רמות חדשות של מידע על המבנה והתפקוד הסינפטי.
מחקרים ראשוניים צבעים ניצלו פעילות תלויה styryl (FM1-43 וצבעים אורגניים קשורים) 7,8. מדינה-של-the-art טכניקות הדמיה להעסיק גרסאות pH רגיש של החלבון פלואורסצנטי הירוק (GFP) (pHluorin) קשורים לחלבוני שלפוחית luminal 9. בדיקות אלה הן בדרך כלל כבויים כאשר קיימים בשלפוחית בגלל pH luminal הנמוך. לאחר התמזגות עם קרום הפלזמה, הפנים השלפוחית חשופים למרחב תאי הניטרלי, pH בפתאומיות מגביר, מקל על מרווה הפרוטון-תלוי של pHluorin ואות הניאון במהירות מופיעה. כשינוי בpHluorin הוא מהיר יותר מאשר אירוע ההיתוך, על ידי ניטור הקרינה עולה, איחוי שלפוחית עם הקרום ניתן למדוד ולנתח. בגלל מולקולות מתויג pHluorin פני שטח endocytosed, אות הקרינה לאחר מכן חוזרת לרמה בסיסית, ולכן אותו המבנה עשוי לשמש גם כדי לפקח על שלפוחית מחזור 9.
בעוד pH-החיישן מתויג השלפוחית מבטיח ההדמיה רק של אלה שבאמת שלפוחית מתאחה עם קרום הפלזמה, נדרשת הדמיה ברזולוציה מרחב ובזמן גבוהה לתאר בפרטים את השלבים כרוכים בתהליכי endocytic exo /. הטכניקה האופטית המספקת רזולוציה מרחב ובזמן הדרושה היא מיקרוסקופיה הכוללת ההשתקפות הפנימית הקרינה (TIRFM), יישום של מיקרוסקופ פלואורסצנטי 10.
"> השתקפות פנימית מוחלטת מתרחשת בממשק שבין הכיסוי להחליק זכוכית והמדגם. כאשר נתיב האור מגיע לכיסוי להחליק זכוכית עם זווית אירוע גדולה יותר מהזווית הביקורתית, אור העירור אינו מועבר למדגם אך הוא משתקף לחלוטין בחזרה. בתנאים אלה, צורות גל אור חלוף בממשק ומתפשט במדיום עם פחות צפיפות אופטית (לדוגמא). כעוצמת שדה החלוף דועכת אקספוננציאלית עם מרחק מהממשק (עם עומק חדירה של כ -100 ננומטר) רק fluorophores בקרבה הקרובה ביותר לכיסוי החלקה יכולים להיות נרגשים ואילו אלה רחוקים יותר מהגבול אינם. בתאים transfected עם GFP-בונה, עומק זה מתאים לחלבונים הביעו בקרום הפלזמה או במבנים שלפוחי שמתקרב לזה. כפי שלא יכול להיות נרגשת fluorophores בפנים התא, הקרינה הרקע היא ממוזערת, ותמונה עם אות / עכברוש רקע גבוה מאודio נוצר 11.כמה מאפיינים להפוך TIRFM הטכניקה של בחירה לניטור דינמיקת שלפוחית. לעומת זאת המושלם ויחס אות לרעש הגבוה מאפשרים זיהוי של אותות נמוכים מאוד הנובעים משלפוחית אחת. רכישת תמונה מבוססת שבב בכל מסגרת מספקת רזולוציה של הזמן הנחוץ כדי לזהות תהליכים דינמיים מאוד. לבסוף, החשיפה המינימלית של תאים לאור בכל מטוס אחר במדגם מאוד מפחיתה phototoxicity ומאפשרת הקלטת הזמן לשגות לאורך זמן 12.
ניתוח הנתונים נשאר ההיבט המאתגר והחשוב ביותר של טכניקה זו. הדרך הפשוטה ביותר כדי לפקח על איחוי שלפוחית היא למדוד את ההצטברות של חלבוני ניאון כתב על פני התא, לאורך זמן 13. כתוצאת מגדילה היתוך, עליות אות הקרינה נטו גם כן. עם זאת, שיטה זו עשויה להקל הראש בתהליך, במיוחד בתאים גדולים ובתנאי מנוחה,בגלל תהליכי אנדוציטוזה וphotobleaching לקזז את העלייה בעוצמת הקרינה בשל exocytosis שלפוחית. שיטה חלופית היא לעקוב כל אירוע היתוך אחד 14. שיטה זו אחרונה היא מאוד רגישה ויכולה לחשוף פרטים חשובים על מנגנוני ההיתוך. עם זאת, זה דורש בחירה הידנית של אירועים בודדים, משום שנהלים באופן אוטומטי לגמרי לעקוב שלפוחית ולרשום את התנודות של אותות הניאון שלהם לא תמיד זמינים. תצפית של דינמיקת שלפוחית דורשת תאי דגימה בתדירות גבוהה. זה מייצר כמות גדולה של נתונים שבקושי ניתן לנתח באופן ידני.
הצעתו של מאמר זה היא לייעל את טכניקת ההדמיה TIRFM לניטור הבסיסית ושחרור הנוירוטרנסמיטר מגורה בשורת תאי נוירובלסטומה SH-5YSY, ולתאר, צעד-אחרת-צעד, שיטה שפותחה במעבדה לניתוח נתונים, שניהם ברמות כל תא וחד-השלפוחית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. תרבית תאים וTransfection
- תרבית תאי SH-SY5Y
הערה: הניסויים התבצעו באמצעות נוירובלסטומה אדם SH- SY5Y (ATCC # CRL-2,266) 15. תאי SH-SY5Y לגדול כתערובת של אשכולות צפים ותאים חסיד. בצע את ההוראות שדווחו בפרוטוקול (צפיפות תאים, יחס פיצול, וכו '.) יש תאים שגדלים מחובר היטב לכיסוי זכוכית, שהוא חיוני לTIRFM.- לפני שמתחיל, תחת ממשלת הבטיחות הביולוגית הזרימה למינרית, להפיק את הנפח המתאים של פתרון פוספט סטרילי חיץ מלוח (PBS) ובינוני תרבות.
- לעשות 50 מיליליטר של PBS עם ריכוזים של 150 מ"מ NaCl, חיץ פוספט 24 מ"מ, pH 7.4. סנן את הפתרון.
- לעשות 50 מיליליטר של מדיום סלולארי מבינוני השתנה Dulbecco הנשר (DMEM) עם גלוקוז גבוה, 10% בסרום שור עוברי חום מומת (FBS), פניצילין (100 U / ml), סטרפטומיצין (100 מיקרוגרם / מיליליטר), L-גלוטמין ( 2 מ"מ), ופירובט נתרן (1 מ"מ). סנן את הפתרון.
- הסר בינוני צמיחה מלאה ולשטוף את התאים עם 3 מיליליטר של PBS.
- דגירה תאים עם 2 מיליליטר של 0.05% חומצת טריפסין-ethylenediaminetetraacetic (EDTA) (6 צלחת פטרי סנטימטר) במשך 5 דקות על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 ולנתק תאים באמצעות פיפטה.
- להשבית טריפסין על ידי הוספת 2 מיליליטר של DMEM, ולאסוף תאים על ידי צנטריפוגה XG ב 300 במשך 5 דקות.
- הסר את supernatant, להוסיף 1 מיליליטר של DMEM לגלולה ופיפטה את הפתרון ואת מספיק כדי לפזר תאים לתוך השעיה תא בודדת.
- לפצל אותם 1: 4 בצלחת חדשה בקוטר 6 סנטימטר פטרי המכילה 3 מיליליטר של מדיום שלם. לשמור על תאים בתרבית בצלחות פטרי בקוטר 6 סנטימטר, על 37 מעלות צלזיוס בחממה של 5% CO 2. תת-תרבות אחת לשבוע או כאשר הם כיסו 80-90% מהשטח.
- לפני שמתחיל, תחת ממשלת הבטיחות הביולוגית הזרימה למינרית, להפיק את הנפח המתאים של פתרון פוספט סטרילי חיץ מלוח (PBS) ובינוני תרבות.
- ציפוי תא SH-SY5Y הדמיה
- בניסויים TIRFM, צלחתתאים על גבי מכסה זכוכית. זכוכית להעסיק מכסה עם 0.17 ± 0.005 מ"מ עובי ומקדמת שבירה 1.5255 ± .00015. לפני שמתחיל, להכין coverslips הזכוכית כדלקמן:
- זכוכית נקייה מכסה עם 90% אתנול, O / N.
- יש לשטוף אותם ביסודיות במים מזוקקים (שלושה שינויים של מים מזוקקים). זכוכית יבש מכסה בתנור ייבוש.
- המקום מכסה בצלחות פטרי מזכוכית ולעקר בתנור שחומם מראש על 200 מעלות צלזיוס במשך 3 שעות.
- היום לפני transfection, במקום כל coverslip בצלחת פטרי 3.5 סנטימטר, להוסיף 1 מיליליטר של מדיום התרבות לדגור על 37 מעלות צלזיוס בחממה של 5% CO 2.
- Trypsinize תאים כמתואר בשלבי 1.1.3 - 1.1.5, להשעות את התא גלולה ב 1 מיליליטר של מדיום מלא ולספור. חשב את הנפח הנכון של השעיה תא להוסיף לכל צלחת פטרי להניב 3 x 10 5 תאים / טוב. צפיפות זו נדרשת לצמיחת תאים אופטימלית ויעיל transfection. לדגור על 37 מעלות צלזיוסבחממה של 5% CO 2 O / N.
- בניסויים TIRFM, צלחתתאים על גבי מכסה זכוכית. זכוכית להעסיק מכסה עם 0.17 ± 0.005 מ"מ עובי ומקדמת שבירה 1.5255 ± .00015. לפני שמתחיל, להכין coverslips הזכוכית כדלקמן:
- SH-SY5Ytransfection ידי polyethylenimine (PEI)
הערה: כדי להמחיש את דינמיקת שלפוחית סינפטית, בו נעשה שימוש וקטור pCB6 מכיל synapto-pHluorin. Synapto-pHluorin כבר נוצר על ידי במסגרת היתוך של גרסת pH רגיש של החלבון פלואורסצנטי הירוק (GFP) 16 וחלבון קרום לפוחי synaptobrevin 2. המבנה כבר מועסק בהרחבה לחקור תכונות שלפוחית הסינפטית בתוך הנוירונים 9.- לפני שמתחיל transfection, להפוך את 10 מיליליטר של הפתרונות הבאים. שמור את הפתרונות כמקסימאליים כחודש 1.
- הפוך פתרון mM NaCl 150. התאם לpH 5.5 עם 0.01 N HCl.
- הפוך פתרון PEI בpolyethylenimine 10% (PEI; 25 ליניארי KDA) ב -150 פתרון mM NaCl. PH של תמיסה עולה ל -8.8. התאם ל- pH 7.8 עם 0.01 N HCl.
- 24 שעות לאחר ציפוי, להסיר את המדיום ולרענן עם 1.5 מיליליטר שלבינוני מלא. שמור את התאים על 37 מעלות צלזיוס, בשיעור של 5% CO 2 באינקובטור.
- מתחת לארון הבטיחות הביולוגי הזרימה למינרית, בצינור 1.5 מיליליטר microfuge, להוסיף 3 מיקרוגרם של ה- DNA פלסמיד ל -25 μl של 150 מ"מ NaCl פתרון ופתרון PEI ל3.5 סנטימטר צלחת פטרי 100 μl.
- וורטקס למשך 10 שניות, ואז דגירה את תערובת DNA / PEI למשך 30 דקות ב RT.
- להוסיף בזהירות את תערובת DNA / PEI לצלחת פטרי המכילה coverslips עם תאים ובעדינות לנער להפיץ באופן שווה מגיב בצלחת פטרי.
- לאחר 4 שעות לשנות את מדיום דגירה התאים O / N ב 37 מעלות צלזיוס בחממה של 5% CO 2. לבצע ניסויי הדמיה 24-48 שעות לאחר transfection.
- לפני שמתחיל transfection, להפוך את 10 מיליליטר של הפתרונות הבאים. שמור את הפתרונות כמקסימאליים כחודש 1.
2. תא הדמיה על ידי סכתי פנימית השתקפות מיקרוסקופ פלואורסצנטי (TIRFM)
- הגדרת הדמיה
- לבצע הדמיה TIRF עם ההגדרה מתוארת באיור 1. היא כוללת ממונעת הפוכהמיקרוסקופ (איור 1, הבלעה), מקור הלייזר (איור 1, הבלעה B) וTIRF-המחוון (איור 1, C הבלעה). להגיע תאורת TIRFM דרך צמצם מספרי גבוה שמן 100X, מטרת טבילה (1.45 אלפא תכנית-Fluar NA).
- לתאורת TIRFM, להעסיק רב-קו (458/488/514 ננומטר) לייזר ארגון-יון 100 mW. שימוש בסיבי מצב מונו, להציג את אור הלייזר המקוטב באופן ליניארי לנתיב הקרן, באמצעות מחוון TIRF. הכנס את מחוון TIRF לתוך מטוס סרעפת שדה הזוהר של נתיב הקרן משתקף האור.
- לתאורת שדה רחבה, להתחבר למיקרוסקופ אור לבן מנורת כספית קצרה-קשת קונבנציונלית HBO. פריזמה כפולה שמירה-קיטוב במחוון מבטיחה שילוב בו-זמני של תאורת TIRF ואור לבן.
- סנן את אור הלייזר עם מסנן עירור (להקת רוחב 488/10 ננומטר) רכוב על גלגל לסנן, הציג לתוך נתיב הלייזר. מעסיקבמהירות גבוהה, בשליטת תוכנת תריס כדי לאפשר שליטה מהירה של תאורת לייזר. לניתוח pHluorin, הר להקה לעבור 525/50 ננומטר מסנן פליטה. צלם תמונות דיגיטליות (512 x 512 פיקסלים) על מצלמת CCD המהיר מקוררת עם תוכנת ProPlus תמונה.
- השגת הארת TIRF (איור 2)
- הפעל את הלייזרים, מחשב, המצלמה, הגלגל לסנן, ובקרי התריס; לאחר מכן, לחכות 20 דקות לפני תחילת הניסוי כלייזרים צריכים להתחמם ולייצב.
- לפני ההדמיה, להפיק את הנפח המתאים מהפתרונות הבאים.
- לעשות 50 מיליליטר של קרבס פתרון (KRH) ב 125 מ"מ NaCl, 5 מ"מ KCl, 1.2 מ"מ MgSO4, 1.2 מ"מ KH 2 PO 4, 25 מ"מ 4 piperazine-1-ethanesulfonic חומצה (2-Hydroxyethyl) (HEPES) (שנאגרו ל pH 7.4), 2 מ"מ CaCl 2, ו -6 גלוקוז מ"מ.
- הפוך 10 מיליליטר של תמיסת KCl-KRH (pH 7.4) בשעה 80 מ"מ NaCl, 50 מ"מ KCl, 1.2 מ"מ MgSO4, 1.2 מ"מ KH 2 PO 4, 25 מ"מ HEPES (שנאגרו ל- pH 7.4), 2 מ"מ CaCl 2, ו -6 גלוקוז מ"מ.
- הסר את מכסה הזכוכית עם תאי transfected ולהכניס אותו לחדר ההדמיה המתאים. להרכיב את התא ולהוסיף 500 μl של פתרון KRH במרכז הזכוכית.
- להוסיף שמן מעל המטרה. הנח את תא ההדמיה על הבמה של המיקרוסקופ ולמקם את המטרה תחת coverslip הזכוכית. מקם את הכיסוי הבטוח על המדגם.
- במצב epifluorescence, להתמקד בcoverslip (המשטח עליון) ולבחור תאי transfected ממוקמים במרכז החדר. בחרו את תאים שניאון אות בבירור שהוקלט באמצעות זמן חשיפה מתחת ל -80 אלפיות שניים.
- בשליטת תוכנה, לעבור לתאורת TIRF במצב חי.
- כדי להגדיר את תצורת TIRF, לבדוק את המיקום של הקרן שנובעת מתוך המטרה, על עטיפת המדגם (איור 2). כאשר הקרן ממוקמת במרכזה של tהוא עדשה אובייקטיבית (איור 2 א, משמאל), מקום גלוי במרכז כיסוי מדגם TIRF (איור 2, משמאל) והתא הוא הדמיה במצב epifluorescence (מספר מישורי פוקוס, הקרינה רקע גבוהה; איור 2 ג, משמאל) .
- כדי להגיע לזווית הקריטית, להזיז את הנקודה הממוקדת בכיוון Y (קדימה או אחורה; איור 2, מרכז) באמצעות בורג כוונון זווית על מחוון TIRF (איור 1 ג). כאשר הקרן מתכנסת במטוס המדגם בזווית גדולה יותר מהזווית הביקורתית (איור 2 א, מימין), המקום נעלם וקו ישר, דק, התמקד ניכר באמצע כיסוי המדגם (איור 2, מימין).
- כדי לכוונן את זווית TIRF להשתמש במדגם התא (איור 2 ג). צפה בתמונת הקרינה בווידאו, בשלב זה, תמונה כמו epifluorescence-עדיין גלויה. בעדינות, להעביר את הבורג עד con TIRFהתנאי של מושגת: מטוס אופטי רק אחד של התא הוא בפוקוס (כלומר, קרום הפלזמה במגע עם כיסוי החלקה), זה גורם לתמונה שטוחה עם ניגודיות גבוהה (איור 2 ג, מימין).
- הדמיה לדוגמא
- הגדר את ניסוי הזמן לשגות ערוץ אחד. כדי למזער photobleaching, ללכוד את התמונה באמצעות זמן חשיפה נמוך ורווח גבוה. זמני חשיפה מתאימים הם בין 40-80 msec. לרכוש תמונות של 1 - תדר דגימת הרץ 2. קינטיקה שלפוחית עשויה להיות דגימה מוערכת טוב יותר בתדירות גבוהה יותר (10 הרץ). הזמן הקבוע של התבוננות הוא בדרך כלל 2 דקות.
- הוסף 500 μl של תאי פתרון ושיא KRH במצב TIRFM. זהו מצב המנוחה. שמור את התמונות רציפות הזמן.
- להתמקד באותו התא ושיא באותם תנאים של מנוחה (כוח לייזר, זמן חשיפה, מספר מסגרת). לאחר חמש מסגרות, להוסיף 500 μl של פתרון KCl-KRH ולשמור KCl בתא.זהו תנאי המגורה; שמור את התמונות רציפות הזמן.
3. ניתוח תמונה ועיבוד נתונים
הערה: כדי לנתח תמונות, פקודות מאקרו פותחו במעבדה, המבוססת על פונקציות קיימות של תוכנת ניתוח תמונה; פקודות מאקרו דומים זמינות באופן מקוון (URL הניתן בטבלה של חומרים וציוד).
- כימות עוצמת הקרינה
- להשתמש במאקרו "עוצמת הקרינה רצף" לכימות עוצמת הקרינה באזור של עניין (ROI) של התמונה, במהלך הסרט.
- פתח את התמונות בזמן רציף. לכו לתפריט מאקרו ובחר 'עוצמת הקרינה רצף ". בחלון 'ניתוח' מופיע "בחר את ההחזר על ההשקעה".
- בחר באחד מכלי הבחירה בתפריט כדי ליצור את ההחזר על ההשקעה. מניחים 3 ROIs באזורים של קרום התא ללא כתמים (ROI רקע). להעסיק this "ROI רקע" כדי להעריך את photobleaching וכדי לקבוע את הסף לניתוח אירוע היתוך (איור 3 א).
- תיקון Photobleaching ונחישות סף (איור 3)
- כדי להעריך את photobleaching, לפתוח את שורות הקרינה בעוצמה "ROIs רקע", (איור 3Ba). לנרמל את ערכי עוצמת הקרינה בכל מסגרת לערך העצמה הראשונית (F0) (F / F0) (איור 3Bb). ממוצע הערכים.
- סמן את הנתונים הממוצע וליצור עלילת קו באמצעות אפשרויות תפריט תרשים.
- מתפריט ניתוח נתונים, בחר "קו מגמה" כדי לפתוח את הדו-שיח ניתוח עלילה. בחר את הסוג של רגרסיה. רגרסיה להגדיר "מעריכי". לאחר מכן בחר "משוואת תצוגה בתרשים". בחלון הגרף, המשוואה מעריכית מופיעה וערכי הפרמטרים באופן אוטומטי שהוקצו, (איור 3Bc
- החל תיקון מעריכי לערכי העצמה בכל מסגרת כדלקמן:
Fn (מתוקן) = Fn / exp (-n *)
Fn = עוצמת הקרינה שנמדדה בניסוי המסגרת n; n = מספר המסגרות; = גורם הלבנה (קבוע המבטא את שיעור הפסד עוצמה בשל photobleaching; איור 3Bd). - כדי להגדיר את הסף, לפתוח "ROI רקע" מנורמל ותיקן, לחשב את אות הקרינה הממוצעת וסטייתה הסטנדרטי (SD). הערך הממוצע בתוספת 3 SD מייצג את הסף (איור 3Be). השתמש סף זה לניתוח נתונים.
- מבחר של אירועי היתוך באמצעות הליך אוטומטי
- פתח את התמונות בזמן רציף עם תוכנת ניתוח תמונה. החל מסנן גאוס לתמונה ברצף הפעיל.
- ניתוח תמונות באמצעות הכלי "לספור אובייקטים" או מאקרו שמאפשר הבחירהשל אובייקט פיקסלים שיש לי עוצמת הקרינה ממוצעת בטווח מוגדר. הגדר את עוצמת מגוון ידני, באמצעות פונקצית הסף (ללכת לתפריט הבר, סף → המידה שנקבע על מנת להדגיש את תחום עניין). סף נאות הוא 30% בהשוואה לאות רקע הניאון המקומי.
- החל מאקרו "מסנני אובייקטים" כדי לבחור אובייקטים רק עמידה בקריטריונים הבאים:
- להחיל אפשרות טווחים (מינימום ומקסימום כולל) להיבט. היבט מדווח היחס בין הציר המרכזי והציר המשני של האליפסה שווה הערך לאובייקט. ההיבט תמיד ≥1. ערכים נאותים דקות = 1, מקסימום = 3.
- החל טווחים לקוטר. קוטר מדווח אורך הממוצע של הקטרים הנמדדים בשני מרווחי תואר הצטרפות שתי נקודות מתאר ועוברים דרך centroid של האובייקט. הגדר את הטווח בפיקסלים (או במיקרומטר, אם משתמש במערכת מכוילת).
- הגדר את הטווח האופטימלי בpreliminניסויים האר"י: לבחור באופן ידני את הנקודות של עניין ולאחר מכן למדוד הקוטר שלהם באמצעות פונקצית פרופיל עלילה.
- בחר באפשרות "תצוגת אובייקטים": אובייקטים שנבחרו יופיעו על גבי לתמונת TIRFM (איור 4).
- לכלול בניתוח רק את נקודות שמראות קצרות (1-3 מסגרות) עלייה חולפת בעוצמת הקרינה, ומייד אחרי הפסד ניכר של אות (כתמים חולפים). להעסיק את הבחירה העגולה כדי ליצור את ההחזר על ההשקעה בקוטר כ מנקודה רדיאלית סביב השלפוחית / הכתמים שנבחרו (ROIs ניסוי). לבצע שלב זה באופן ידני.
- עם ROIs נבחר, לחשב את עוצמת הקרינה הממוצעת של כל ROI במהלך הסרט.
- ניתוח נתונים (איור 3 ג-ד)
- לייצא את הזמן במהלך שינויי הקרינה נמדדים בכל אחד "החזר על השקעה ניסיונית" לגיליון אלקטרוני; (איור 3Da). לנרמל את ערך העצמה בכל מסגרת לעוצמת הקרינה הראשונית (F / F0), (איור 3dB).
- החל תיקון מעריכי לערכי העצמה בכל מסגרת, כפי שדווח בשלב 3.2.4 (איור 3Dc).
- כדי לחשב את המספר הכולל של אירועי היתוך (מספר שיא), זמן בכל היתוך מתרחש (רוחב שיא) ואת המשרעת של שיא ניאון (גובה שיא וAUC) להחיל פונקציות לוגיות באמצעות חבילות גיליון אלקטרוני או מתמטיקה. דוגמא לניתוח אירוע היתוך באמצעות נוסחות לוגיות מדווחת באיור 3DD ו3De.
- תניח הגידול של עוצמת הקרינה העולה על הסף (עוצמת הקרינה רקע הממוצעת ± 3SD) כאיחוי שלפוחית קרום הפלזמה ושיא כאירוע היתוך וכתוצאה מכך.
- חשב את רוחב השיא כהבדל בין האחרון וערך x הראשון של כל שיא. להכפיל ערך זה ל1 / (תדר דגימה). שקול ערך זהזה הזמן של איחוי שלפוחית והידבקות בקרום הפלזמה לפני שלפוחית מחדש החמצה ומחזור (איור 3DD).
- לחשב AUC כל התא כסכום של ערכים על סף. שקול ערך זה כשינוי נטו ניאון בזמן ההקלטה בשל הספונטנית (מנוחה) או פעילות הסינפטית עוררה (מגורה).
- לחשב את גובה השיא כהפרש בין ערך y המקסימאלי של כל שיא והסף. שקול ערך זה מעיד כפי שמסוג פיוז'ן (Fusion הבודד לעומת בו זמנית / רציף או חולף לעומת היתוך מלא).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
נהלי ניתוח ההדמיה TIRF ונתונים שתוארו נועדו ללמוד דינמיקת שלפוחית במערכות סלולריות. טכניקה זו יכולה לשמש כדי לקבוע את ההשפעות של מולקולות איתות וסמים על אירועי היתוך ודינמיקת שלפוחית הנוירוטרנסמיטר 17. שימוש בחלבוני קרום פלזמה מתויג GFP, ניתוח TIRFM כבר מועסק לאפיין הסחר המכונן של מובילים מתויג GFP גלוטמט בגליה ותאי האפיתל 18,19.
כדי לאמת את אסטרטגית הליך ההדמיה וניתוח הנתונים שדווחה, אירועי היתוך נרשמים תחת בסיסי ומגורה תנאים (שלילת קוטביות הנוצר על-אשלגן), בתאי נוירובלסטומה SH-SY5Y transfected עם synapto-pHluorin. (וידאו 1, 2, בהתאמה). שני ניתוחים שונים מבוצעים: כל תא (איור 4) וניתוחים חד-שלפוחית (איור 5).
mea ניתוח תא שלםsures המספר הכולל של אירועי היתוך בתא ושינויי הקרינה נטו וכתוצאה מכך נגרמים על ידי גירוי. באיור 4, תאי transfected synapto-pHluorin נרשמים תחת מנוחה ומגורה תנאים (גירוי KCl), תוך שימוש באותו פרוטוקול הניסוי (זמן חשיפה, כוח הלייזר, וכו '). איור 4 א מראה כי synapto-pHluorin מצטבר בpuncta הניאון פזורים ב תא קרום. כפי שמתואר בספרות, אות ניאון קלושה נוכחת גם בקרום הפלזמה 9; אות זה היא שימושי כדי לזהות תאים להיות צילם. באיור 4, כתמים שנבחרו על ידי ההליך האוטומטי שתואר בעיתון (הסעיף 3.3) הם על גבי לתמונת TIRFM דיווחה באיור 4 א. איור 4C מראה את פרופילי עוצמת ניאון המנורמל של כתמים שנבחרו בתנאי מנוחה. פרופילים אלה לחשוף את הנוכחות של פסגות בודדות של int ניאון דומהensity שיוצאים בזמנים שונים במהלך ההקלטה וכנראה מתאים לשלפוחית שלעתים להתמזג עם הקרום. איור 4D מראה את ההשפעות של גירוי KCl. כצפוי, שלילת קוטביות עם 25 מ"מ KCl מעוררת תגובה מהירה וכמה puncta ניאון בהיר מאוד להופיע בקרום התא (וידאו 2). puncta אלה מתאים לבריכה 'releasable בקלות "של שלפוחית סינפטית הנוכחית מתחת קרום הפלזמה. ניתוח מהלך הזמן של שינויי ניאון נמדדו בהתכתבות של מקומות מסוימים מעיד על הקיום של פסגות, של עוצמת הקרינה משתנה, המופיעים פתאום אחרי היישום של גירוי ההפרשה (איור 4D ו4F). תוצאות של ניתוח תא כולו בזמן ההקלטה, מדווחות באיור 4E-H. גירוי KCl גורם לעלייה מהירה מסומנת במספר אירועי היתוך (גידול של פי 2.5 על תנאי מנוחה) (4E-F איור) ובשינויי עוצמת הקרינה וכתוצאה מכך (גידול של פי 9.3 על תנאי מנוחה) (איור 4G-H), ובכך מצביע על שחרור הנוירוטרנסמיטר מאסיבי.
ניתוח חד-שיא מאפשר האפיון של אירועים חד-היתוך (איור 5). איור 5 א 'מציג את רציף תמונות של "החזר על השקעה ניסיונית" נציג נרשם בתנאי מנוחה. בפרט מדגיש synapto-pHluorin כותרת שלפוחית שמתאחה עם הקרום מתחת לאזור TIRF. לאחר שתי מסגרות, אות הניאון נעלמה, המציין אחזור שלפוחית סבירה ומחדש החמצה. פרופיל הקרינה המנורמל של האזור של עניין (איור 5) מודד עלייה באות הניאון בהתכתבות של מראה המקום באזור TIRF. לעומת זאת, הקרינה חוזרת לרמת בסיס לאחר היעלמות מקום (שיא יחיד1.91 ± 0.32 שניות רוחב ממוצעת; שיא ממוצע גובה 0.042 ± 0.005 עוצמת הקרינה מנורמלת). איור 5 ג ו5D להראות תמונות רציפות של "החזר על השקעה ניסיונית" נרשמה תחת גירוי KCl ופרופיל עוצמת הקרינה המנורמל המקבילה. שים לב לגידול בתנועה של שלפוחית ולצאת את אזור TIRF לאחר שלילת קוטביות KCl.
40 אירועי היתוך נבחרים ונותחו במנוחה ומגורה תנאים. הפרמטרים הבאים נמדדים: AUC ממוצע שיא, שיא רוחב וגובה. רוחב שיא מציין את הזמן של איחוי שלפוחית, התקשרות ואנדוציטוזה לפני מחדש החמצה ומחזור, איור 5G. גובה שיא מודד את שינויי עוצמת הקרינה הנגרמים על ידי איחוי שלפוחית, איור 5F. שינויים בפרמטרים אלו מצביעים על מנגנוני exocytosis שונים. ניתוח חד-שיא מגלה כי שלילת קוטביות KCl משנהמצב של איחוי שלפוחית קרום הפלזמה. ואכן, להגדיל באזור השיא הממוצע (עלייה של 3.8 ± 0.2 לקפל על תנאי מנוחה, P <0.01 על ידי מבחן t מזווג, איור 5E), גובה שיא (גידול של פי 2.75 ± 0.03, P <0.01 על ידי לזווג מבחן t, איור 5F) והרוחב (גידול של פי 2.6 ± 0.5, P <0.05 על ידי מבחן t מזווג. איור 5G) מזוהים בתנאים מאולצים. כמה הסברים ניתן בחזון לתוצאות אלו. אפשרות היא ששלילת קוטביות KCl גורמת היתוך בו זמנית ו / או רציף של שלפוחית באזור מוגבל של התאים. הסבר חלופי הוא ששלילת קוטביות חזקה מעדיפה היתוך מלא לעומת היתוך חולף. בתנאים בסיסיים, המנגנון הרווח הוא היתוך חולף: צורות נקבוביות היתוך, pH בעליות השלפוחית ואות הניאון מופיעה, אבל מייד סוגר הנקבובית, ובכך מאפשר מחדש החמצה ומחזור מהירים. תחתתנאי מגורה, שלפוחית נתיכים לחלוטין עם קרום הפלזמה, גובה השיא וגידול ברוחב כלכבוש מחדש של רכיבי שלפוחית קרום, מחדש החמצה ומחזור עשוי לדרוש תקופה ארוכה יותר. תוצאה דומה הושגה לאחרונה ניתוח exocytosis microvesicle כמו הסינפטי-בβ-תאים האנדוקרינית 20.
מיקרוסקופ 1. TIRF איור להגדיר. מבט סכמטי ותמונה (הבלעה) של מערכת מיקרוסקופ TIRF. הקים כולל את ממונע מיקרוסקופ Axio אובזרוור Z1 ההפוך (), רב-קו 100 לייזר ארגון יון mW (B) וTIRF-מחוון (C). אור הלייזר (קו ירוק) ואור לבן (קו צהוב) מוצגים. תאים הם צילמו באמצעות מטרת טבילת 100 × נפט. תמונות דיגיטליות שנתפסו על מצלמת CCD המהיר RetigaSRV מקורר. נ"צמודול לקטור, הפליטה (488/10 ננומטר) והעירור (ננומטר 525/50 לעבור להקה) מסננים, collimator (L1) והתמקדות עדשה (L2) מצוינות. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2. קבלת תצורת TIRFM. הקריקטורה סכמטי הממחיש את המטרה, את כיסוי החלקה, מדגם ואת המיקום של קרן הלייזר (קו כחול) (א). שמאל, קרן העירור נוסע ישירות דרך ממשק הכיסוי להחליק על מדגם . המדגם הוא נרגש כמו במצב epifluorescence. מרכז, צורות קרן עירור עם מדגם זווית אירוע נמוך מהזווית הביקורתית, האור מאיר את המדגם בזווית משתנה. נכון, קרן העירור יוצרת incidזווית ent גדולה מהזווית הקריטית, האור הושלם מוחזרת לעדשה האובייקטיבית, ושדה חלוף מתפשט במדגם. (ב) קריקטורה המציגה את כיסוי מדגם ואת המיקום של קורה העירור (העיגול הכחול), שנובעת מתוך המטרה, במעבר מepifluorescence (משמאל) לכיוון תאורת TIRF (מימין). epifluorescence (C) (משמאל) וTIRFM (מימין) תמונות של הקרינה synapto-pHluorin בתא SH-SY5Y חי. בר סולם:. 10 מיקרומטר אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3. עיבוד נתונים וניתוח. (א) תמונת TIRFM של הקרינה synapto-pHluorin בSH-"י חיתא 5Y. הכיכר הירוקה מציינת "ROI רקע" נציג. סרגל 10 מיקרומטר. עבודה מוצעת להחזר על השקעת רקע (B). מלמעלה למטה:.... כמובן זמן של שינויי עוצמת הקרינה שנמדדו בROI הרקע; ב הנורמליזציה של שינויי הקרינה לערך הקרינה הראשוני (F / F0); ג יישום של רגרסיה מעריכי; ד תיקון לphotobleaching, דואר. הערכת סף (ריבוע אפור שקוף). (C) TIRFM תמונה של הקרינה synapto-pHluorin בתא SH-SY5Y חי. הלבן המרובע מציין "החזר על השקעה ניסיונית" נציג. סרגל 10 מיקרומטר. זרימת עבודה (D) הצעה להחזר על השקעה ניסיונית. מלמעלה למטה:.. במהלך שינויי עוצמת הקרינה זמן; ב נורמליזציה נתונים לשווי הקרינה הראשוני (F / F0); ג. photobleaching;. דה יישום של פונקציות לוגיות לאיתור מספר השיא, AUC, רוחב וגובה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4. ניתוח תא שלם. (א) תמונת TIRFM של הקרינה synapto-pHluorin בתא SH-SY5Y חי. תאים נרשמים תחת מנוחה ומגורה תנאים (25 יישום מ"מ KCl) (נדגם ברץ 1). בר סולם: 10 מיקרומטר. כתמים (B) שזוהו על ידי ההליך האוטומטי מוצגים (צבע ירוק) על גבי תמונת TIRFM. פרופילים (C) מנורמלים עוצמת הקרינה (F / F0) של כתמים שנבחרו על ידי ההליך האוטומטי בכל התא בתנאי מנוחה. (ד) Normalizפרופילי ed עוצמת הקרינה (F / F0) של כתמים שנבחרו בתנאי מגורה. בר על העקבות מצביע יישום KCl. (EH) מספר אירועים ולשינויי עוצמת הקרינה שנרשמו בכל התא במנוחה (כחול) ותנאי מגורה (אדום). Histograms (E) המציג את המספר הכולל של אירועי היתוך נרשמו בתא. (F) הפצה זמנית של אירועי היתוך. (G) Histograms המייצג שינויים בעוצמת הקרינה pHluorin המתרחשים בכל התא (AUC סה"כ). Curves (H) המראה את עוצמת הקרינה pHluorin שינויים מצטברים כפונקציה של זמן. לוחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
2. תאי וידאו SH-SY5Y להביע synapto-pHluorin נרשמים בתנאי מגורה (נדגם ברץ 1). זלוף KCl מצויינים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מאמר זה מציג פרוטוקול לתמונה ולנתח את דינמיקת שלפוחית בתאי מפרישים, באמצעות וקטורים בקידוד cDNA ניאון וTIRFM. מרכיבים עיקריים של הדמיה מוצלחת על ידי TIRFM הם הבחירה של המודל הסלולרי וtransfection תא עם אינדיקטורים אופטיים גנטי מקודדים של שחרור שלפוחית ומחזור.
TIRFM הוא אידיאלי עבור תאי גידול חסיד לכיסוי זכוכית ושטוח מספיק כדי לאפשר הדמיה יציבה של קרומים ואירועי היתוך. אידיאלי צריכה להיות מפוזרת שלפוחית בתא, כך שהסחר, פיוז'ן ואנדוציטוזה ניתן הדמיה ולכמת ברמה חד-שלפוחית. לרוע המזל, תאי עצב אינו עומדים בקריטריונים הבאים: יש להם צורות חריגות, neurites אשר לעתים קרובות לחצות אחד את השני, ושלפוחיות היתוך מרוכז אופן שכיח באזורים קטנים (אזורים פעילים). לאזורים אלה הוא קשה מאוד ללמוד דינמיקת שלפוחית על ידי TIRFM בתרבויות עיקריות של תאי עצב.
class = "jove_content"> אנו מדגימים בפעם הראשונה ששורת תאי נוירובלסטומה אדם SH-SY5Y יכולה להיות מודל חלופי בעל ערך לחקור שחרור הנוירוטרנסמיטר תחת מנוחה ומגורה תנאים, על ידי TIRFM. יש קו זה תא פנוטיפ עצבי עם גוף סלולארי ודקים תהליכים, בעל אנזימים לסינתזת מוליך עצבי, חלבונים של המכונות הסינפטי, והפרשה מוסדרת. יתר על כן, זה יכול להיות מובחן לפנוטיפ עצבי תפקודי בוגר בנוכחות של סוכנים שונים, כוללים חומצה רטינואית, אסטרים phorbol, וdibutyryl AMP המחזורי 21,22. תאים שטוחים מספיק כדי לאפשר הדמיה יציבה של קרומים ואירועי היתוך במצב TIRFM (במיוחד בגוף התא) ושלפוחית מפוזרות יחסית. ולבסוף, ניתן transfected תאים בקלות עם חלבוני קידוד פלסמיד שכותרת GFP או תגי חלבון pH רגיש באמצעות ריאגנטים transfection שונים. בפרוטוקול זה, PEI נעשה שימוש כדי transfectהתאים. מגיב זה מהווה את הבסיס של רוב סוכני transfection הזמינים מסחרי ולבד פועל כוקטור transfection חסכוני מאוד. 20% יעילות של transfection צפוי תוך שימוש בפרוטוקול לעיל דיווח שהוא מתאים להדמית תא בודדת.
בעוד הזמינות של חומרים כימיים transfection שונים ונהלים עושה transfection כמעט הליך סטנדרטי בSH-SY5Y וגם בתרבויות עצביות עיקריות, יש לנקוט בזהירות בעת הקלטה, ניתוח ופרשנות נתוני TIRFM. TIRFM מאפשר איסוף מידע בנוגע לתהליכים המתרחשים בבית או ליד הקרום בתאים חיים, ומאפשר הניתוח של אירועים מולקולריים בודדים באמצעות זיהוי של שינויים באות הניאון נגזרים מחלבונים מתויגים הנעים פנימה או החוצה החולף הוגש. עם זאת, מספר גורמים יכולים לשנות את אותות הניאון באזור זה, בלי בהכרח רומז / אירועי endocytic exo, וזה חייב להיות לקחתn בחשבון בעת הקלטה וניתוח נתונים. בין אלה שינויים מורפולוגיים בתאים, במיוחד אלה הנוגעים למטוס בפוקוס תחת שינויי השדה וfluorophore החולפים במהלך ההקלטה הם.
שינויים מורפולוגיים
ברזולוציה הגבוהה של טכניקת TIRF מסתמכת על העירור של fluorophores בתוך שדה החלוף, עם העומק של 100 ננומטר מממשק הזכוכית 11. זהו אזור מאוד דק ושינויים מורפולוגיים בלתי נתפסים צפויים לשנות את מטוס התא בפוקוס. זה חל בעיקר על תאי עצב ותאים שמציגים כמה תהליכים ולהציג עלעול בולט. בתאים אלה, אזור הקרום במגע עם הכיסוי להחליק במהלך ההקלטה הוא לא סדיר ובמהירות יכול לשנות, ובכך גורם הערכה מדויקת של exocytosis. מסיבה זו, במידת האפשר, חשוב לבחור את המודל הסלולרי של חקירה. כדי להגביל moveme תא NTS יכול להיות מועיל לזכוכית מכסה מעיל עם חלבוני מטריצה תאיים או poly-L- ליזין. עם זאת, יש לזכור כי מצעים אלה עשויים לשנות את דינמיקת התנהגות תא ושלפוחית.
מקורות אפשריים אחרים של שינויים מורפולוגיים בזמן ההקלטה הם גירוי תא, תוספת של פתרונות, ושינויי טמפרטורה. גירויים יכול לגרום לשחרור מסיבי שלפוחית (כלומר, שלילת קוטביות KCl) לעתים קרובות לגרום להתכווצות תאים אשר ללא ספק משנה את פני השטח של התאים מתחת לאזור TIRF. לכן חשוב לבחור בצורה מדויקת את זמן סוג, ריכוז, ויישום של הגירוי בניסויים ראשוניים.
ההקדמה הפשוטה של פתרונות לאמבטיה עם טפטפת, באופן בלתי תלויה בהרכב, עשויה לגרום לשינוי של מורפולוגיה של תאים על ידי מאמץ גזירה. כדי לפתור חפץ זה, להוסיף בינוני רצוי באמצעות מערכת זלוף, אולי קשורה למשאבת ואקום כדי להפחית את הרעש.
= "Jove_content"> המורפולוגיה של תאים והתפקוד רגישים במיוחד לשינויים בטמפרטורה בשל סביבה ניסיונית, בנוסף בינוני ותאורת לייזר אינטנסיבית. בקרת הטמפרטורה בLive- תא ההדמיה מושגת בדרך כלל באמצעות חממות; (שלב העליון) קטן וחממות גדולות (קאמרית) זמינים. , האחרון לשעבר שימושיים במיוחד ומתאימים גם לתצפית של תרביות תאים מבטיח טמפרטורה קבועה של כל המכשירים בתוך האינקובטור, כולל חלק גדול ממיקרוסקופ, וכך לצמצם את סחף המיקוד כתוצאה משיפוע הטמפרטורה. בהעדר מערכת רגולציה טמפרטורה, זה קריטי לאזן תאים, חדר הדמיה לחיות תאים, ופתרונות לRT ולהימנע מניסויי הדמיה לטווח ארוך.
Fluorophore
שינוי של אותות ניאון יכול להיות גם בשל שינוי של fluorophore במהלך הקלטה. החשוב ביותר הוא photobleaching 23. Photobleaching הוא הפירוק מושרה הפוטון של fluorophore. זה בדרך כלל גורם לאובדן קבוע של הקרינה ועמעום של המדגם נצפה על פני זמן. בTIRFM, רק fluorophores סגורה למקורו של שדה החלוף ניתן photobleached וחלבוני קרום GFP מתויג הם photobleached כי הם מתגוררים בתחום זה. מניעת הדהייה של עוצמת פליטת הקרינה היא מאוד חשובה כדי להשיג תמונות באיכות גבוהה, וחובה למיקרוסקופ פלואורסצנטי כמותיים. עם קירוב סביר, למולקולת נתונה בסביבה קבועה, photobleaching תלוי בזמן ובמחזור של חשיפה למקור העירור. במקרים רבים, photobleaching כדלקמן פונקציה פשוטה מעריכי ריקבון, מה שהופך את הערכתה ותיקונה קל יותר על ידי ביצוע הקלטות שליטת 23. נוסחות תיקון שונות / פקודות מאקרו זמין באופן מקוון (ראה טבלה של חומרים וציוד); בפרוטוקול exponenti פשוטנעשתה שימוש בפונקצית אל.
ישנן מספר אסטרטגיות כדי להתגבר photobleaching. אסטרטגיה טובה היא למנוע photobleaching במקור, למשל, באמצעות fluorophores גבוהה photostability. לרוע המזל, ברגע זה ממש, הבחירה של בדיקות בקידוד DNA עדיין מוגבלת. במקרה זה, הפסד של פעילות שנגרם על ידי photobleaching ניתן למזער במהלך רכישת הדמיה, אופטימיזציה של פרק הזמן של חשיפה לאור, אנרגיית הפוטון של אור הקלט ואת התדירות של דגימה.
בעת שימוש בבדיקות pH רגיש, מקור נוסף של שינוי fluorophore במהלך ההקלטה הוא שינוי pH בטווח הבינוני. נפח הנוזל של חדר ההקלטה הוא בדרך כלל נמוך מאוד ויישום סמים, פעילות תא וחילוף חומרים עלולות לשנות את ה- pH של המדיום, במיוחד בהיקף הזעיר בין התא ואת פני השטח של coverslip. זה בתורו, משנה את אות ניאון pHluorin, ובכך גורם מעל / מתחת-אומדן של שלפוחית מחדשחכירה. לדוגמא, גירויים חזקים עלולים להוביל להחמצת סידן תלוי של cytosol ושיקוף alkalization במרחב החוץ תאי, ובכך וכתוצאה מכך עלייה מוגזמת באות ניאון 24.
כדי להימנע מבעיה זו, תמיד להשתמש בפתרונות שנאגרו ולעקוב אחר שינויים אפשריים pH הוצגו על ידי הפרוטוקול הוקם, בניסויים ראשוניים. להערכה מדויקת יותר של שחרור שלפוחית עורר, בעת ניתוח נתונים, מעקב אחר אותות הקרינה באזור של השטח פני התא ללא אירועי היתוך, ולהשתמש בשינויים של אות הניאון בתוך האזור הזה כגורם התאמה.
לסיכום, שיטה לניטור וניתוח איחוי שלפוחית ודינמיקה שתוארה. טכניקה זו ניתן להשתמש בסוגים שונים של תאים (תאי עצב ותאים האנדוקרינית) כדי לחזות ולנתח את השלבים השונים של exo / אנדוציטוזה, כדי לחשוף את תפקידם של חלבונים וpathogeniמוטציות ג ברגולציה של דינמיקת שלפוחית ולחשוף את מנגנוני פעולה של תרופות המכוונות לexocytosis המכונן ומוסדר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
המחברים מבקשים להודות Università degli Studi di Milano לתמיכה לאליאנה Di Cairano (מלגת פוסט-דוקטורט) וסטפניה Moretti (מלגת דוקטורט). עבודה זו נתמכה על ידי המחקר באוניברסיטת תכנית PUR לCP
ברצוננו להודות לפרופ 'ג'רמי מ' הנלי, בית הספר לביוכימיה באוניברסיטת בריסטול, בריטניה, לpHluorin לבנות וד"ר דוטי פרנצ'סקו לסיוע בניתוח נתונים, וסילביה Marsicano לקבלת סיוע טכני.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Axio Observer Z1 |  Zeiss |
491912-9850-000 | inverted microscope |
| Multiline Argon Laser Lasos 77 | Lasos |
00000-1312-752 | multi-line (458/488/514 nm), 100 mW argon-ion laser |
| Laser TIRF slider | Zeiss |
423681-9901-000 | |
| 100X Objective | Zeiss |
421190-9900-000 | Oil, NA 1.45 Alpha-Plan |
| CCD Camera RetigaSRV Fast 1394 | QImaging |
||
| LAMBDA 10-3 optical filter changer with SmartShutter | Sutter Instrument Company |
||
| Software | |||
| Image ProPlus 6.3 Software | Media Cybernetics |
spot selection, ROI selection, fluorescence intensity determination | |
| Excel | Microsoft |
photobleaching correction, whole-cell and single-vesicle analyses | |
| GraphPad Prism 4.00 | GraphPad Software, Inc. |
statistical analysis | |
References
- Sudhof, T. C. The synaptic vesicle cycle. Annu. Rev. Neurosci. 27, 509-547 (1146).
- Denk, W., Svoboda, K. Photon upmanship: why multiphoton imaging is more than a gimmick. Neuron. 18 (3), 351-357 (1997).
- Helmchen, F., Svoboda, K., Denk, W., Tank, D. W. In vivo dendritic calcium dynamics in deep-layer cortical pyramidal neurons. Nat Neurosci. 2 (11), 989-996 (1999).
- Tsien, R. Y. The green fluorescent protein. Annu Rev Biochem. 67, 509-544 (1998).
- Matz, M. V., et al. Fluorescent proteins from non bioluminescent Anthozoa species. Nat Biotechnol. 17 (10), 969-9673 (1999).
- Ribchester, R. R., Mao, F., Betz, W. J. Optical measurements of activity-dependent membrane recycling in motor nerve terminals of mammalian skeletal muscle. Proc Biol Sci. 255 (1342), 61-66 (1994).
- Polo-Parada, L., Bose, C. M., Landmesser, L. T. Alterations in transmission, vesicle dynamics, and transmitter release machinery at NCAM-deficient neuromuscular junctions. Neuron. 32 (5), 815-828 (2001).
- Gaffield, M. A., Betz, W. J. Imaging synaptic vesicle exocytosis and endocytosis with FM dyes. Nat Protoc. 1 (6), 2916-2921 (2006).
- Miesenböck, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
- Axelrod, D. Total internal reflection fluorescence microscopy. Methods Cell. Biol. 89, 169-221 (2008).
- Sankaranarayanan, S., De Angelis, D., Rothman, J. E., Ryan, T. A. The Use of pHluorins for Optical Measurements of Presynaptic Activity. Biophys. J. 79, 2199-2208 (2000).
- Mattheyses, A. L., Simon, S. M., Rappoport, J. Z. Imaging with total internal reflection fluorescence microscopy for the cell biologist. J. Cell Sci. 123, 3621-3628 (2010).
- Wyatt, R. M. Balice-Gordon R.J. Heterogeneity in Synaptic Vesicle Release at Neuromuscular Synapses of Mice Expressing SynaptopHluorin. J. Neurosci. 28 (1), 325-335 (2008).
- Tsuboi, T., Rutter, G. A. Multiple forms of "kiss-and-run" exocytosis revealed by evanescent wave microscopy. Curr Biol. 13, 563-567 (2003).
- Miloso, M., et al. Retinoic Acid-Induced Neuritogenesis of Human Neuroblastoma SH-SY5Y Cells Is ERK Independent and PKC Dependent. J. Neurosci. Res. 75, 241-252 (2004).
- Jaskolski, F., Mayo-Martin, B., Jane, D., Henley, J. M. Dynamin-dependent Membrane Drift Recruits AMPA Receptors to Dendritic Spines. J Biol Chem. 284 (18), 12491-12503 (2009).
- Treccani, G., et al. Stress and corticosterone rapidly increase the readily releasable pool of glutamate vesicles in synaptic terminals of prefrontal and frontal cortex. Mol Psychiatry. 19 (4), 433-443 (1038).
- D'Amico, A., et al. The surface density of the glutamate transporter EAAC1 is controlled by interactions with PDZK1 and AP2 adaptor complexes. Traffic. 11 (11), 1455-1470 (2010).
- Perego, C., Di Cairano, E. S., Ballabio, M., Magnaghi, V. Neurosteroid allopregnanolone regulates EAAC1-mediated glutamate uptake and triggers actin changes in Schwann cells. J Cell Physiol. 227 (4), 1740-1751 (2012).
- Bergeron, A., Pucci, L., Bezzi, P., Regazzi, R. Analysis of synaptic-like microvesicles exocytosis of B-cells using a live imaging technique. PlosOne. 9, e87758 (2014).
- Encinas, M., et al. Sequential treatment of SH-Sy5Y cells with retinoic acid and brain-derived neurotrophic factor gives rise to fully differentiated, neutrophic factor-dependent, human neuron-like cells. J. Neurochem. 75 (3), 991-1003 (2000).
- Kume, T., et al. Dibutyryl cyclic AMP induces differentiation of human neuroblastoma SH-SY5Y cells into a noradrenergic phenotype. Neurosci Lett. 443 (3), 199-203 (2008).
- Diaspro, A., Chirico, G., Usai, C., Ramoino, P., Dobrucki, J. Photobleaching. Handbook of Biological Confocal Microscopy. Pawley, J. B. , Springer-Verlag New York, Inc.. New York. 690-699 (2006).
- Rossano, A. J., Chouhan, A. K., Macleod, G. M. Genetically encoded pH-indicators reveal activity-dependent cytosolic acidification of Drosophila motor nerve termini in vivo. J Physiol. 591 (7), 1691-1706 (2013).
