Abstract
Synaptic vesikler frigöra signalsubstanser vid kemiska synapser genom en dynamisk cykel av fusion och hämtning. Övervakning synaptisk aktivitet i realtid och dissekera de olika stegen i exo-endocytos vid singel-vesikler nivå är avgörande för att förstå synaptiska funktioner i hälsa och sjukdom.
Genetiskt kodade pH-känsliga sonder direkt riktade till synaptiska vesiklar och total inre reflektion fluorescensmikroskopi (TIRFM) ger spatiotemporala upplösning som krävs för att följa vesikler dynamik. Den evanescenta fält som genereras av total intern reflektion kan endast excitera fluoroforer som placerats i ett tunt skikt (<150 nm) över glaslocket på vilka celler vidhäftar, exakt där processerna för exo-endocytos att äga rum. De resulte bilder med hög kontrast är idealiska för vesiklar spårning och kvantitativ analys av fusionshändelser.
I detta protokoll SH-SY5Y human neuroblastoma celler föreslås som en värdefull modell för att studera neurotransmittorfrisättning vid singel-vesikler nivå genom TIRFM, på grund av deras plan yta och förekomsten av spridda blåsor. Metoderna för odling SH-SY5Y som vidhäftande celler och för transfektion dem med synapto-pHluorin finns, liksom tekniken för att utföra TIRFM och bildbehandling. Slutligen är en strategi som syftar till att välja, räkna och analysera fusions händelser på hel-cell och singel-vesikler nivåer presenteras.
För att validera avbildningsförfarandet och dataanalys tillvägagångssätt, är dynamiken i pHluorin-taggade vesikler analyseras under vila och stimulerad (depolariserande kaliumkoncentrationer) förhållanden. Membrandepolarisering ökar frekvensen av fusionshändelser och orsakar en parallell höjning av nettofluorescenssignalen registreras i hela cellen. Single-vesikler analys visar modifieringar av fusions-event beteende (ökad topphöjd och bredd). Dessa data tyder thpå kalium depolarisation inte bara framkallar en massiv signalsubstans frigivning utan också ändrar mekanismen för vesikelfusion och återvinning.
Med lämplig fluorescerande sond, kan denna teknik användas i olika cellulära system att dissekera mekanismerna för konstitutiv och stimulerad sekretion.
Introduction
Kemisk synaptisk transmission mellan nervceller är en viktig mekanism för kommunikation i nervsystemet. Det bygger på frisättningen av neurotransmittorer genom en dynamisk cykel av vesikelfusion och hämtning vid presynaptiska platsen. Många av de proteiner involverade i vesikler dynamik har identifierats; dock fortfarande deras specifika bidrag till fenomenet förtydligas 1.
Vår förståelse är delvis begränsad av det faktum att de mest använda analyser för exo / endocytos är inte alltid den mest lämpliga. Flera studier relaterade till vesikelfusion och dynamik beroende elektrofysiologiska tekniker. Denna teknik ger en optimal tidsupplösning och är utmärkt för att undersöka den inledande fusion av vesiklar till plasmamembranet, men är oförmögen att upptäcka många av de bakomliggande molekylära händelser som stödjer presynaptiska funktion. Elektronmikroskopi, på andra sidan, tillhandahåller den finaste morphological beskrivning av varje singular steg, men den dynamiska aspekten av händelsen kan inte fångas, eftersom proverna måste fastställas för att analyseras.
Tillkomsten av nya optiska inspelningsteknik 2,3, i kombination med framsteg inom fluorescerande molekylära sonder utveckling 4-6, möjliggör visualisering av exocytiska processer i levande celler, vilket ger nya nivåer av information om synaptiska struktur och funktion.
Initiala studier utnyttjade aktivitetsberoende styrylfärgämnen (FM1-43 och tillhörande organiska färgämnen) 7,8. State-of-the-art avbildningstekniker använder pH-känsliga varianter av grönt fluorescerande protein (GFP) (pHluorin) bundna till luminala blåsor proteiner 9. Dessa prober är vanligen avstängd när de är närvarande i vesiklarna grund av den låga luminala pH. Efter fusion med plasmamembranet, är vesikeln inre exponeras för den neutrala extracellulära utrymmet, pH plötsligt ökar, lindrar protonberoende dämpning av pHluorin och den fluorescerande signalen visas snabbt. Eftersom denna ändring av pHluorin är snabbare än fusions händelse, genom att övervaka fluorescensökningar, kan vesikelfusion med membranet mätas och analyseras. Eftersom ytan pHluorin-märkta molekyler endocyteras, fluorescenssignalen återgår därefter till basal nivå, alltså samma konstruktion kan också användas för att övervaka vesikler återvinning 9.
Medan blås taggade pH-sensor säkerställer visualisering endast de blåsor som verkligen smälter med plasmamembranet, är avbildning vid hög rumslig och tidsmässig upplösning som krävs för att beskriva i detalj de steg som ingår i exo / endocytiska processer. Den optiska teknik som ger den nödvändiga spatio-temporal upplösning är total intern reflektion fluorescens mikroskopi (TIRFM), en tillämpning av fluorescensmikroskopi 10.
"> Total intern reflektion sker vid gränsytan mellan glaskupa-slip och provet. När ljusstrålen når skyddsglaset-slip med en infallsvinkel större än den kritiska vinkeln, är excitationsljuset överförs inte i provet, men är helt reflekteras tillbaka. Under dessa betingelser, en evanescent ljus vågformer vid gränsytan och fortplantas i mediet med mindre optisk densitet (provet). Eftersom intensiteten hos det evanescenta fältet avtar exponentiellt med avståndet från gränsytan (med ett penetrationsdjup av ca 100 nm) endast fluoroforema i närmaste närhet till cover-slip kan exciteras medan de längre bort från gränsen inte. I celler transfekterade med GFP-konstruktioner, motsvarar detta djup till proteiner som uttrycks på plasmamembranet eller vesikulära strukturer närmar det. Som fluoroforer i cellens inre inte kan exciteras, är bakgrunden fluorescens minimeras, och en bild med en mycket hög signal / bakgrund råttaio bildas 11.Flera egenskaper gör TIRFM tekniken i valet för att övervaka blåsor dynamik. Den perfekta kontrast och hög signal-till-brus-förhållande medge detektering av mycket låga signaler som härrör från enstaka vesiklar. Chip-baserad bild förvärv i varje bildruta ger den tidsupplösning som krävs för att upptäcka mycket dynamiska processer. Slutligen minimal exponering av celler för ljus på någon annan planet i provet minskar starkt fototoxicitet och möjliggör långvarig inspelning med tidsluckor 12.
Dataanalys är fortfarande den mest utmanande och avgörande aspekt av denna teknik. Det enklaste sättet att övervaka vesikelfusion är att mäta ackumuleringen av reporter fluorescerande proteiner vid cellytan, över tiden 13. Som fusions ökar, netto fluorescens signalen ökar liksom. Emellertid kan denna metod underskatta processen, särskilt i stora celler och när man vilar,eftersom endocytos och Fotoblekning processer kompensera ökningen i fluorescensintensiteten på grund av vesikler exocytos. En alternativ metod är att följa varje enskild fusions event 14. Den senare metoden är mycket känslig och kan avslöja viktiga detaljer om fusionsmekanismer. Det kräver dock att manuellt val av enstaka händelser, eftersom helt automatiserade rutiner för att följa blåsor och registrera fluktuationer i deras fluorescerande signaler är inte alltid tillgängliga. Observation av vesikler dynamiken kräver provtagningsceller med hög frekvens. Detta genererar en stor mängd data som knappast kan analyseras manuellt.
Förslaget med denna uppsats är att optimera TIRFM avbildningsteknik för övervakning av basal och stimulerad frisättning av signalsubstans i SH-5YSY neuroblastomcellinjen, och beskriva, steg-för-steg, ett förfarande som utarbetats i laboratoriet för att analysera data, både på hel-cell och singel-vesikler nivåer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Cellodling och transfektion
- SH-SY5Y cellodling
OBS: Försöken har utförts med användning av den humana neuroblastom SH- SY5Y (ATCC # CRL-2266) 15. SH-SY5Y celler växer som en blandning av flytande kluster och vidhäftande celler. Följ instruktionerna som redovisas i protokollet (celltäthet, delningsförhållande, etc.) För att få celler som växer stadigt fästa vid glaskupa, vilket är avgörande för TIRFM.- Före start, under laminärt flöde biosäkerhet skåp, kontrollera den lägliga volym steril fosfatbuffertkoksaltlösning (PBS) och odlingsmedium.
- Gör 50 ml PBS med koncentrationer av 150 mM NaCl, 24 mM fosfatbuffert, pH 7,4. Filtrera lösningen.
- Gör 50 ml cellmedium från Dulbeccos modifierade Eagles medium (DMEM) med hög glukoshalt, 10% värmeinaktiverat fetalt bovint serum (FBS), penicillin (100 U / ml), streptomycin (100 | ig / ml), L-glutamin ( 2 mM) ochnatriumpyruvat (1 mM). Filtrera lösningen.
- Avlägsna komplett tillväxtmedium och tvätta cellerna med 3 ml PBS.
- Inkubera cellerna med 2 ml 0,05% trypsin-etylendiamintetraättiksyra (EDTA) (för 6 cm Petri-skål) under 5 min vid 37 ° C, 5% CO2 och lösgöra celler med användning av pipett.
- Inaktivera trypsin genom tillsats 2 ml DMEM, och samla upp celler genom centrifugering vid 300 xg under 5 minuter.
- Avlägsna supernatanten, tillsätt 1 ml DMEM till pelleten och pipettera lösningen upp och ner tillräckligt för att dispergera cellerna i en enkelcellsuspension.
- Split dem 1: 4 i en ny 6 cm diameter Petri-skål innehållande 3 ml av komplett medium. Upprätt celler i kultur i 6 cm diameter petriskålar, vid 37 ° C i en 5% CO2 inkubator. Subkultur en gång i veckan eller när de har täckt 80-90% av ytan.
- Före start, under laminärt flöde biosäkerhet skåp, kontrollera den lägliga volym steril fosfatbuffertkoksaltlösning (PBS) och odlingsmedium.
- SH-SY5Y cell plätering för avbildning
- För TIRFM experiment, tallrikceller på glas omslag. Anställ glas täcker med 0,17 ± 0,005 mm tjocklek och en 1,5255 ± 0,00015 brytningsindex. Innan du börjar, förbereda täckglas som följer:
- Rengör glaset täcker med 90% etanol, O / N.
- Skölj dem noga i destillerat vatten (tre byten av destillerat vatten). Torr täckglas i en torkugn.
- Placera täcker i glaspetriskålar och sterilisera i en förvärmd ugn vid 200 ° C under 3 h.
- Dagen före transfektion, placera varje täckglas i en 3,5 cm petriskål, tillsätt 1 ml odlingsmedium och inkubera vid 37 ° C i en 5% CO2 inkubator.
- Trypsinisera celler som beskrivs i steg 1.1.3 - 1.1.5, avbryta cellpelleten i 1 ml komplett medium och räkna. Beräkna den korrekta volymen av cellsuspension för att lägga till varje petriskål för att ge 3 x 10 5 celler / brunn. Denna densitet krävs för optimal celltillväxt och effektiv transfektion. Inkubera vid 37 ° Ci en 5% CO2 inkubator O / N.
- För TIRFM experiment, tallrikceller på glas omslag. Anställ glas täcker med 0,17 ± 0,005 mm tjocklek och en 1,5255 ± 0,00015 brytningsindex. Innan du börjar, förbereda täckglas som följer:
- SH-SY5Ytransfection av polyetylenimin (PEI)
OBS: För att visualisera synaptiska vesiklar dynamik, har pCB6 vektor innehållande synapto-pHluorin använts. Den synapto-pHluorin har tagits fram genom i ram fusion av en pH-känslig variant av det grönt fluorescerande protein (GFP) 16 och vesikulär membranprotein synaptobrevin 2. Konstruktionen har genomgått omfattande anställd för att undersöka synaptiska vesikler fastigheter inom nervceller 9.- Innan du börjar transfektion, gör 10 ml av följande lösningar. Håll lösningarna som maximal som 1 månad.
- Gör en 150 mM NaCl-lösning. Justera till pH 5,5 med 0,01 N HCl.
- Gör en PEI-lösning vid 10% polyetylenimin (PEI, 25 kd linjär) i 150 mM NaCl-lösning. PH hos lösningen stiger till 8,8. Justera pH till 7,8 med 0,01 N HCl.
- 24 timmar efter plätering, avlägsna mediet och uppdatera med 1.5 mlkomplett medium. Håll cellerna vid 37 ° C, i en 5% CO2 inkubator.
- Under laminära flödes biosäkerhet skåp, i ett 1,5 ml mikrofugrör, tillsätt 3 | ig av plasmid-DNA till 25 | il av 150 mM NaCl-lösning och 100 pl av PEI-lösning per 3,5 cm petriskål.
- Vortexa i 10 sek, sedan inkubera DNA / PEI blandningen under 30 min vid RT.
- Försiktigt lägga DNA / PEI blandningen till petriskål med täck med celler och försiktigt skaka till lika fördela reagens i petriskålen.
- Efter 4 h ändra medium och inkubera cellerna O / N vid 37 ° C i en 5% CO2 inkubator. Utför imaging experiment 24-48 timmar efter transfektion.
- Innan du börjar transfektion, gör 10 ml av följande lösningar. Håll lösningarna som maximal som 1 månad.
2. cell imaging av Total Internal Reflection Fluorescensmikroskopi (TIRFM)
- Imaging set-up
- Utför TIRF avbildning med uppställningen som beskrivs i figur 1. Den består av en motordriven inverteradmikroskop (Figur 1, infälld A), laserkällan (figur 1, infälld B) och TIRF-reglaget (Figur 1, infälld C). Nå TIRFM belysning genom en hög numerisk apertur (NA 1.45 Alpha Plan-Fluar) 100X olja, immersionsobjektiv.
- För TIRFM belysning, anställa en multi-line (458/488/514 nm) 100 mW argonjonlaser. Med hjälp av en monoläge fiber, införa linjärt polariserat laserljus i strålgången, via reglaget TIRF. Sätt i TIRF reglaget till den lysande fältbländaren plan reflekterade ljus strålens väg.
- För brett fält belysning, anslut mikroskop för att en konventionell kvicksilver kort båglampa HBO vitt ljus. En polarisationsbevarande dubbel prisma i reglaget säkerställer samtidig kombination av TIRF belysning och vitt ljus.
- Filtrera laserljuset med ett excitationsfilter (bandbredd 488/10 nm) monterat på ett filterhjul, införes i laserbanan. Anställen hög hastighet, programvarustyrt, slutare för att medge snabb styrning av laserbelysning. För pHluorin analys montera ett band pass 525/50 nm emissionsfilter. Fånga digitala bilder (512 x 512 pixlar) på en kyld Snabb CCD-kamera med bild ProPlus programmet.
- Att uppnå TIRF belysning (Figur 2)
- Slå på lasrarna, datorn, kameran, filterhjulet, och slutaren styrenheter; då, vänta 20 min innan experimentet som lasrarna behöver värmas upp och stabiliseras.
- Innan avbildning, gör lämpligt volymen av följande lösningar.
- Gör 50 ml av Krebs (KRH) lösning vid 125 mM NaCl, 5 mM KCl, 1,2 mM MgSO4, 1,2 mM KH 2 PO 4, 25 mM 4- (2-hydroxietyl) piperazin-1-etansulfonsyra (HEPES) (buffrad till pH 7,4), 2 mM CaCl2, och 6 mM glukos.
- Gör 10 ml KCl-KRH-lösning (pH 7,4) vid 80 mM NaCl, 50 mM KCl, 1,2 mM MgSO4, 1,2 mM KH 2 PO 4, 25 mM HEPES (buffrad till pH 7,4), 2 mM CaCl2, och 6 mM glukos.
- Ta bort skyddsglaset med transfekterade celler och infoga den i rätt avbildning kammaren. Montera kammaren och tillsätt 500 ul av KRH lösning i centrum av glaset.
- Lägg olja över målet. Placera avbildning kammare på scenen av mikroskopet och placera målet under glaset täckglas. Placera säkra locket över provet.
- I epifluorescens läget, fokusera på täck (övre ytan) och välj transfekterade celler placeras i kammaren centrum. Markera cellerna vars fluorescerande signalen tydligt kan spelas in med en exponeringstid under 80 ms.
- Under programkontroll, byta till TIRF belysning i liveläge.
- För att ställa in TIRF konfigurationen, kontrollera läget av balken som framträder ur målet, på provlocket (Figur 2B). När strålen är placerad i centrum av tHan objektiv (Figur 2A, vänster), är en plats synlig i mitten av TIRF urvalet täcker (Figur 2B, vänster) och cellen avbildas i epifluorescens läge (flera fokus plan, hög bakgrundsfluorescens, figur 2C, vänster) .
- För att nå den kritiska vinkeln, flytta den fokuserade punkten i Y-riktningen (framåt eller bakåt, fig 2B, mitten) med vinkeljusteskruven på TIRF reglaget (Figur 1C). När strålen konvergerar på provplanet i en vinkel större än den kritiska vinkeln (Figur 2A, höger), försvinner platsen och en rak, tunn, fokuserad linje är tydlig i mitten av provlocket (Figur 2B, höger).
- Att finjustera TIRF vinkeln använder cellprovet (figur 2C). Titta på fluorescens bild på videon, i detta skede, är en epifluorescence liknande bild fortfarande synliga. Försiktigt, flytta skruven tills TIRF consättning uppnås: endast en optisk plan av cellen är i fokus (dvs plasmamembranet i kontakt med täck-slip), resulterar detta i en plan bild med hög kontrast (Figur 2C, till höger).
- Prov avbildning
- Ställ enkanals time-lapse experiment. För att minimera fotoblekning, fånga bilden med låga exponeringstiden och hög förstärkning. Lämpliga exponeringstider är mellan 40-80 ms. Hämta bilder på 1 - 2 Hz samplingsfrekvens. Vesikler kinetik kan vara bättre uppskattad provtagning vid högre frekvens (10 Hz). Den ordinarie tid för observation är oftast 2 min.
- Lägg 500 l av KRH lösning och rekordceller i TIRFM läge. Detta är vilotillståndet. Spara tid sekventiella bilder.
- Fokus på samma cell och spela på samma villkor för vilande (laser power, tidsexponering, ramnummer). Efter fem ramar, tillsätt 500 ìl av KCl-KRH lösning och hålla KCl i kammaren.Detta är den stimulerade tillståndet; spara tid sekventiella bilder.
3. Bildanalys och databehandling
OBS: För att analysera bilder, har makron utvecklats i labbet, baserat på befintliga funktioner i bildanalys programvara; liknande makron finns tillgängliga på nätet (URL i tabell av material och utrustning).
- Fluorescensintensitet kvantifiering
- Använd en "Sekvens fluorescensintensitet" macro för fluorescensintensitet kvantifiering i ett område av intresse (ROI) på bilden, under loppet av filmen.
- Öppna de tids sekventiella bilder. Gå till makromenyn och välj "Sekvens fluorescensintensitet". I "Analys" fönstret visas "välj ROI".
- Välj ett av markeringsverktygen i menyn för att skapa ROI. Placera 3 ROI i regioner av cellmembranet utan fläckar (bakgrunds ROI). Anställ this "bakgrunds ROI" att utvärdera fotoblekning och ställa tröskeln för fusionshändelseanalys (Figur 3A).
- Fotoblekning korrigering och tröskelbestämning (Figur 3B)
- För att utvärdera fotoblekning, öppnar fluorescensintensiteten raderna "bakgrunds ROI", (Figur 3ba). Normalisera fluorescens intensitetsvärdena i varje ram till det ursprungliga intensitetsvärdet (F0) (F / F0) (Figur 3BB). Medelvärdet värdena.
- Markera de genomsnittliga data och skapa en linjediagram med hjälp av sjökort menyalternativ.
- Från dataanalys menyn, välj "trendlinje" för att öppna dialogrutan tomten analysen. Välj typ av regression. Ställ "exponentiell" regression. Välj sedan "display ekvationen på sjökortet". I grafen fönstret visas den exponentiella ekvationen och parametervärden tilldelas automatiskt, (figur 3BC
- Applicera den exponentiella korrigering till intensitetsvärdena i varje ram som följer:
Fn (korrigerad) = Fn / exp (-n * a)
Fn = experimentell fluorescensintensitet mätt vid ram n; n = antal ramar; a = blekningsfaktor (konstant uttrycker graden av intensitet förlust på grund av fotoblekning; Figur 3BD). - För att ställa in tröskeln, öppna en normaliserad och korrigeras "bakgrund ROI", beräkna medelfluorescenssignalen och dess standardavvikelse (SD). Medelvärdet plus 3 SD representerar tröskeln (Figur 3BE). Använd denna tröskel för dataanalys.
- Val av fusionshändelser med hjälp av en halvautomatisk förfarande
- Öppna de tids sekventiella bilder med bildanalys mjukvara. Applicera en Gaussfiltret till den aktiva bildsekvensen.
- Analysera bilder med hjälp av funktionen "räkna föremål" eller ett makro som gör att urvaletav ett objekt vars pixlar har genomsnittliga fluorescensintensiteten inom ett definierat område. Ställ intensiteten range manuellt med hjälp av tröskelfunktionen (gå till baren menyn för att ställa in mått → tröskel markera intresseområde). En adekvat tröskeln är 30% över det lokala fluorescerande bakgrundssignalen.
- Applicera ett makro "Filter objekt" för att välja endast föremål som uppfyller följande kriterier:
- Applicera alternativet intervall (min och max inklusive) för aspekten. Aspect rapporterar förhållandet mellan storaxeln och lillaxeln hos ellipsen motsvarande objektet. Aspect är alltid ≥1. Tillräckliga värden är min = 1, max = 3.
- Ansök intervall för diameter. Diameter rapporterar den genomsnittliga längden av diametrarna uppmätt på två graders intervall sammanfogning två konturpunkter och passerar genom tyngdpunkten för det objektet. Ställ intervallet i pixlar (eller i pm, om du använder en kalibrerad systemet).
- Definiera det optimala intervallet i preliminordinära experiment: välj manuellt fläckarna av intresse och sedan mäta deras diameter med hjälp av tomten profilfunktionen.
- Välj "visningsobjekt": markerade objekten visas lagras till TIRFM bilden (Figur 4B).
- Inkludera i analysen endast de fläckar som visar en kort (2:59 ramar) gående ökning av fluorescensintensitet, omedelbart följt av en markant förlust av signal (transienta fläckar). Anställ den runda valet att skapa en ROI ungefär en plats diameter radiellt runt de valda vesikel / fläckar (experimentell ROI). Utför detta steg manuellt.
- Med ROI valt beräkna den genomsnittliga fluorescensintensiteten hos varje ROI under loppet av filmen.
- Dataanalys (Figur 3C-D)
- Exportera tidsförloppet för fluorescens förändringar uppmätts i varje "experimentell ROI" till ett kalkylblad; (Figur 3DA). Normalisera intensitetsvärdet i varje ram till den ursprungliga fluorescensintensitet (F / F0), (Figur 3 dB).
- Applicera den exponentiella korrigering intensitetsvärdena i varje bildruta som rapporterats i steg 3.2.4 (Figur 3Dc).
- För att beräkna det totala antalet fusionshändelser (topp nummer), den tid varje fusion inträffar (toppbredd) och amplituden av fluorescerande topp (topphöjd och AUC) tillämpa logiska funktioner med hjälp kalkylblad eller matte paket. Ett exempel på fusionshändelseanalys med hjälp logiska formler redovisas i figur 3Dd och 3DE.
- Antag en ökning av fluorescensintensitet som överstiger tröskelvärdet (genomsnittliga bakgrundsfluorescensintensitet ± 3SD) som vesikelfusion till plasmamembranet och resulterande topp som en fusionshändelse.
- Beräkna toppbredden som skillnaden mellan den sista och den första x-värde för varje topp. Multiplicera detta värde för 1 / (samplingsfrekvens). Tänk på detta värde as tid vesikelfusion och vidhäftning vid plasmamembranet innan vesikler åter försurning och återvinning (figur 3Dd).
- Beräkna hela-cell AUC som en summa av värden över tröskeln. Tänk på detta värde som netto fluorescerande förändring under inspelningstiden på grund av den spontana (vilande) eller framkallade (stimulerad) synaptisk aktivitet.
- Beräkna topphöjden som skillnaden mellan den maximala y-värdet för varje topp och tröskeln. Tänk på detta värde som en indikation på vilken typ fusion (singel kontra simultan / sekventiell fusion eller transitorisk vs. fullständig fusion).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De TIRF avbildning och dataanalys förfaranden som beskrivs är utformade för att studera blåsor dynamik i cellulära system. Denna teknik kan användas för att bestämma effekterna av signalmolekyler och droger på fusions händelser och signalsubstans vesikler dynamik 17. Använda GFP-märkta plasmamembranproteiner, har TIRFM analys använts för att karaktärisera den konstitutiva handel med GFP-märkta glutamattransportörer i gliaceller och epitelceller 18,19.
För att validera avbildningsförfarandet och dataanalys strategi rapporteras, är fusionshändelser bokförs under basal och stimulerad villkor (kalium-inducerad depolarisering), i SH-SY5Y neuroblastomaceller transfekterade med synapto-pHluorin. (Video 1, 2, respektive). Två olika analyser utförs: hel-cell (Figur 4) och enkel vesikler analyser (Figur 5).
Hela cellanalys meader det totala antalet fusions händelser i cellen och de resulterande netto fluorescens förändringar inducerade genom stimulering. I figur 4, är synapto-pHluorin transfekterade celler registrerats under vila och stimulerade förhållanden (KCl stimulering), med samma försöksprotokoll (exponeringstid, lasereffekt, etc). Figur 4A visar att synapto-pHluorin ackumuleras i fluorescerande puncta utspridda på cellmembranet. Såsom beskrivs i litteraturen, är en svag fluorescerande signal också närvarande vid plasmamembranet 9; denna signal är användbara för att identifiera celler som skall avbildas. I figur 4B är fläckar som valts ut av den automatiska förfarande som beskrivs i tidningen (avsnitt 3.3) lagrad till TIRFM bilden redovisas i figur 4A. Figur 4C visar de normaliserade fluorescerande intensitetsprofiler av utvalda fläckar under vila förhållanden. Dessa profiler avslöja förekomsten av enskilda toppar av liknande fluorescerande intensity som kommer ut vid olika tidpunkter under inspelningen och förmodligen motsvarar vesiklar som ibland smälter med membranet. Figur 4D visar effekterna av KCl-stimulering. Som väntat, depolarisation med 25 mM KCl framkallar ett snabbt svar och flera mycket ljusa fluorescerande puncta visas på cellmembranet (Video 2). Dessa puncta motsvara det "lätt lösgörbara" pool av synaptiska vesiklar är närvarande under plasmamembranet. Tiden kursanalys av fluorescerande förändringar uppmätts i överensstämmelse med enskilda platser indikerar närvaron av toppar, av varierande fluorescensintensitet, som verkar plötsligt efter tillämpning av de sekretoriska stimuli (Figur 4D och 4F). Resultat av hela cellanalys under tiden för inspelningen redovisas i Figur 4E-H. KCl stimulering orsakar en snabb markant ökning av antalet fusionshändelser (2,5-faldig ökning jämfört vilande villkor) (Figur 4E-F) och i de resulterande fluorescensintensiteten förändringar (9,3-faldig ökning jämfört vilande villkor) (Figur 4G-H), vilket indikerar massiv frisättning av signalsubstans.
Single-toppanalys tillåter karakterisering av singel-fusionshändelser (Figur 5). Figur 5A visar den sekventiella bilder av ett representativt "experimentell ROI" registrerats under vila förhållanden. Den särskilda belyser en synapto-pHluorin märkt vesikel som säkringar med membranet under TIRF zonen. Efter två ramar, försvinner den fluorescerande signalen, indikerar sannolikt vesikler hämtning och åter försurning. Den normaliserade fluorescensprofilen för regionen av intresse (figur 5B) mäter en ökning i den fluorescerande signalen i motsvarighet till fläcken framträdande i TIRF zonen. Omvänt återgår fluorescens till basnivån efter spot försvinnande (enkel toppgenomsnittlig bredd 1,91 ± 0,32 sek; genomsnittliga topphöjden 0,042 ± 0,005 normaliserade fluorescensintensitet). Figur 5C och 5D visar sekventiella bilder av en "experimentell ROI" bokförs under KCl stimulering och motsvarande normaliserade fluorescensintensiteten profil. Notera den ökade rörligheten för blåsor i och ur TIRF zonen efter KCl depolarisering.
40 fusionshändelser väljs och analyseras i vila och stimulerade förhållanden. Följande parametrar mäts: genomsnittlig topp AUC, topp bredd och höjd. Peak bredd anger tiden för vesikelfusion, kvarstad och endocytos innan du försurning och återvinning, figur 5G. Topphöjd mäter fluorescensintensiteten förändringar som vesikelfusion, figur 5F. Förändringar i dessa parametrar är tecken på olika exocytos mekanismer. Single-peak analys visar att KCl depolarisering modifierarsättet vesikelfusion till plasmamembranet. Faktum öka den genomsnittliga topparean (3,8 ± 0,2 faldig ökning jämfört vila villkor, P <0,01 med parat t-test, figur 5E), topphöjd (2,75 ± 0,03 faldig ökning, P <0,01 med parat t-test, figur 5F) och bredd (2,6 ± 0,5 faldig ökning, P <0,05 med parat t-test. Figur 5G) upptäcks i stimulerade förhållanden. Flera förklaringar kan förutses för dessa resultat. En möjlighet är att KCl depolarisering förorsakar den samtidiga och / eller sekventiella fusion av vesiklar i en begränsad region av cellerna. En alternativ förklaring är att en stark depolarisation gynnar fullt fusion kontra gående fusion. Under basala förhållanden, är den rådande mekanismen en övergående fusion: en fusion pore former, pH i vesikler ökar och den fluorescerande signalen visas, men pore stängs omedelbart, vilket möjliggör snabb åter försurning och återvinning. Understimulerade förhållanden, vesikler helt säkringar med plasmamembranet, topp höjd och bredd ökning som sker återvinning av membranvesikel komponenter, åter försurning och återvinning kan kräva en längre period. Ett liknande resultat har nyligen erhållits analysera synaptic liknande mikrovesikel exocytos i endokrina β-celler 20.
Figur 1. TIRF mikroskop inrättas. Schematisk bild och bild (infälld) i TIRF mikroskopsystem. Den inrättades innefattar Axio Observer Z1 motoriserade inverterat mikroskop (A), en multi-line 100 mW argonjonlaser (B) och en TIRF-reglaget (C). Laserljuset (grön linje) och vitt ljus (gul linje) visas. Celler avbildas med en 100 × oljeimmersionsobjektiv. Digitala bilder är tagna på en kyld RetigaSRV Snabb CCD-kamera. Den reflector modul, utsläpp (488/10 nm) och excitation (bandpass 525/50 nm) filter, kollimatorn (L1) och fokusering (L2) lins anges. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Att få TIRFM konfiguration. (A) Schematisk tecknad illustrerar målet, locket-slip, provet och läget för laserstrålen (blå linje). Vänster, reser excitationsstrålen direkt genom locket-slip-prov gränssnitt . Provet är glada som i epifluorescens läge. Center, excitationsstrålen bildar med provet en infallsvinkel lägre än den kritiska vinkeln, tänds ljuset provet vid en variabel vinkel. Höger, bildar excitationsstrålen en incident vinkel större än den kritiska vinkeln, ljuset är klar reflekteras tillbaka in i objektivlinsen, och ett evanescent fält fortplantas i provet. (B) Cartoon visar provluckan och position excitationsstrålen (blå cirkel), visar sig att ur målet, under övergången från epifluorescence (vänster) mot TIRF belysning (höger). (C) epifluorescence (vänster) och TIRFM (höger) bilder av synapto-pHluorin fluorescens i en live SH-SY5Y cell. Skala bar:. 10 um klicka Vänligen här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Databearbetning och analys. (A) TIRFM bild av synapto-pHluorin fluorescens i en live SH-SY5Y cell. Den gröna fyrkanten visar en representativ "bakgrunds ROI". Scale bar 10 ^ m. (B) Föreslagen arbetsflöde för bakgrunds ROI. Från toppen till botten:.... Ett tidsförlopp för fluorescensintensitet förändringar uppmätts i bakgrunden ROI, b normalisering av fluorescens förändringar till den ursprungliga fluorescensvärdet (F / F0); c tillämpning av exponentiell regression; d korrigering för fotoblekning, e. tröskelutvärdering (transparent grå fyrkant). (C) TIRFM bild av synapto-pHluorin fluorescens i en live SH-SY5Y cell. Den vit kvadrat indikerar en representativ "experimentell ROI". Scale bar 10 ^ m. (D) Föreslagen arbetsflöde för experimentell ROI. Från toppen till botten:.. Ett tidsförlopp av fluorescensintensitetsförändringar, b uppgifter normalisering till det ursprungliga fluorescensvärdet (F / F0); c. korrigering,. de tillämpning av logiska funktioner för att upptäcka högsta antalet, AUC, bredd och höjd. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Hela cellanalys. (A) TIRFM bild av synapto-pHluorin fluorescens i en live SH-SY5Y cell. Celler redovisas under vila och stimulerad (25 mM KCl applikations) förhållanden (samplade vid 1 Hz). Skala bar: 10 pm. (B) fläckar identifierade den som erbjuder visas lagrade (grön färg) på TIRFM bilden. (C) Normaliserade fluorescens intensitetsprofiler (F / F0) av platser som valts ut av det automatiska förfarandet i hela cellen under vila förhållanden. (D) Normalized fluorescens intensitetsprofiler (F / F0) av utvalda fläckar under stimulerade betingelser. Baren över spåren tyder KCl ansökan. (EH) Antal händelser och fluorescensintensitet förändringar redovisade i hela cellen under vila (blå) och stimulerade (röd) förhållanden. (E) Histogram visande det totala antalet fusions händelser som registrerats i cellen. (F) tidsmässiga fördelningen av fusionshändelser. (G) Histogram som representerar förändringar i pHluorin fluorescensintensitet som förekommer i hela celler (total AUC). (H) Kurvor som visar de kumulativa pHluorin fluorescensintensiteten ändras som en funktion av tiden. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Video 2. SH-SY5Y celler som uttrycker synapto-pHluorin redovisas under stimulerade betingelser (samplade vid 1 Hz). KCl perfusion indikeras. Klicka här för att se filmen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denna uppsats presenterar ett protokoll till bilden och analysera blåsor dynamik i utsöndrande celler, med hjälp av fluorescerande cDNA-kodade vektorer och TIRFM. Viktiga delar av framgångsrik avbildning av TIRFM är valet av den cellulära modellen och celltransfektion med genetiskt kodade optiska indikatorer på vesikler release och återvinning.
TIRFM är idealisk för celler som växer anhängare till en glaskupa och tillräckligt platta för att möjliggöra en stabil visualisering av membran och fusionshändelser. Blåsor bör helst spridas i cellen så att deras handel, fusion och endocytos kan avbildas och kvantifieras vid singel-vesikler nivå. Tyvärr har nervceller inte uppfyller dessa kriterier: de har oregelbundna former, neuriter som ofta korsar över varandra, och blåsor fusion prevalently koncentrerad i små regioner (aktiva zoner). För dessa regioner är mycket svårt att studera vesikler dynamiken från TIRFM i primärkulturer av nervceller.
Medan tillgången på olika transfektionsreagenser och förfaranden gör transfektion nästan ett standardförfarande i SH-SY5Y och även i primära neuronala kulturer, måste man vara försiktig när du spelar in, analysera och tolka TIRFM uppgifter. TIRFM underlättar insamling av information om processer som sker vid eller nära membranet i levande celler, och möjliggör analys av enskilda molekylära händelser genom detektering av förändringar i den fluorescerande signalen som härrör från taggade proteiner som flyttar in eller ut den försvinnande arkiveras. Däremot kan flera faktorer modifiera de fluorescerande signaler i denna zon, utan att nödvändigtvis innebär exo / endocytiska händelser, och detta måste tan hänsyn till när du spelar in och analysera data. Bland dessa finns morfologiska förändringar i cellen, särskilt i fråga planet i fokus under evanescentfältet och fluoroforenheter ändringar under inspelning.
Morfologiska förändringar
Den höga upplösningen på TIRF tekniken bygger på excitation av fluoroforer inom försvinnande fältet, med djup 100 nm från glasgränssnittet 11. Detta är en mycket tunn zon och omärkliga morfologiska förändringar väntas förändra cellplanet i fokus. Detta gäller särskilt nervceller och celler som presenterar flera processer och uppvisar uttalad ruffling. I dessa celler är membranarean i kontakt med täckglas under inspelning oregelbunden och kan snabbt förändras, vilket orsakar felaktig utvärdering av exocytos. Av denna anledning, när så är möjligt, är det viktigt att välja den cellulära modellen utredning. För att begränsa cell movements kan vara till hjälp för att belägga glas täcket med extracellulära matrisproteiner eller poly-L-lysin. Men man måste komma ihåg att dessa substrat kan modifiera cellbeteende och vesikel dynamik.
Andra möjliga källor till morfologiska förändringar under inspelning är cellstimulering, tillsättning av lösningar, och temperaturförändringar. Stimuli kunna framkalla massiva blåsor frisättning (dvs, KCl depolarisering) orsakar ofta cell krympning som uppenbarligen ändrar cellytan under TIRF zonen. Det är därför viktigt att noggrant välja den typ, koncentration och appliceringstid av stimulus i preliminära experiment.
Den enkla införandet av lösningar in i badet med en pipett, oberoende av kompositionen, kan orsaka modifikation av cellmorfologi av skjuvspänning. För att lösa detta artefakt, lägga medel helst med hjälp av ett perfusionssystem, eventuellt i samband med en vakuumpump för att minska buller.
Fluorofor
Ändring av fluorescerande signaler kan också bero på en modifiering av fluoroforen under inspelning. Det viktigaste är fotoblekning 23. Fotoblekning är fotonen-inducerad nedbrytning av en fluorofor. Det orsakar i allmänhet en permanent förlust av fluorescens och nedtoning av den observerade provet över tiden. I TIRFM, bara fluoroforer stängd för ursprung gående fältet kan photobleached och GFP-märkta membranproteiner är photobleached eftersom de bor i detta område. Förebyggande av blekning av fluorescensemissionsintensiteten är mycket viktigt att få högkvalitativa bilder, och obligatoriska för kvantitativ fluorescensmikroskopi. Med en rimlig approximation, för en given molekyl i ett konstant miljö, fotoblekning beror på tiden och cykeln för exponering för exciteringskällan. I många fall, följer fotoblekning en enkel exponentiell avklingning funktion, som gör sin bedömning och rättelse lättare genom att utföra kontroll inspelningar 23. Olika korrigerings formler / makron finns tillgängliga på nätet (se tabell av material och utrustning); i protokollet en enkel exponential-funktion har använts.
Det finns flera strategier för att övervinna fotoblekning. En bra strategi är att förhindra fotoblekning vid källan, exempelvis med användning av fluoroforer med hög fotostabilitet. Tyvärr, just nu, valet av DNA-kodade sonder är fortfarande begränsad. I detta fall, förlust av aktivitet som orsakas av fotoblekning kan minimeras under avbildning förvärv, optimera tidsspann ljusexponering, fotonenergin hos ingångs ljus och provtagningsfrekvens.
Vid användning av pH-känsliga sonder, är ytterligare en källa till fluoroforen modifiering under inspelningen av pH-ändring i mediet. Den vätskevolym av inspelningen kammaren är vanligtvis mycket låg och läkemedelsapplicering, kan cellaktivitet och metabolism modifiering av pH för mediet, i synnerhet i den lilla volymen mellan cellen och ytan av täckglas. Detta i sin tur ändrar pHluorin fluorescerande signal, vilket orsakar över / under-uppskattning av vesikler rehyra. Exempelvis kan starka stimuleringar leda till en kalciumberoende surgörning av cytosolen och speglade alkalisering i det extracellulära utrymmet, vilket sålunda resulterar i en överdriven ökning i fluorescenssignalen 24.
För att undvika detta problem, använd alltid buffrade lösningar och övervaka möjliga pH ändringar som införts av fastställt protokoll, i preliminära experiment. För en mer exakt uppskattning av framkallad vesikler release, när man analyserar data övervaka fluorescenssignalen i ett område av cellytan utan fusionshändelser, och använder modifieringar av den fluorescerande signalen inom denna region som justeringsfaktor.
Sammanfattningsvis har en metod för att övervaka och analysera vesikelfusion och dynamik beskrivits. Denna teknik kan användas i olika celltyper (neuroner och endokrina celler) för att visualisera och dissekera de olika stegen av exo / endocytos, för att avslöja den roll av proteiner och deras pathogenic mutanter i regleringen av vesikler dynamik och att avslöja de verkningsmekanismer för läkemedel riktade konstitutiv och reglerad exocytos.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Författarna vill tacka för Università degli Studi di Milano för stöd till Eliana Di Cairano (Postdoktor) och Stefania Moretti (Ph.D. gemenskap). Detta arbete stöddes av University Research Program PUR till CP
Vi vill tacka professor Jeremy M. Henley, School of Biochemistry, University of Bristol, Storbritannien, för pHluorin konstruera och Dr. Dotti Francesco för hjälp med dataanalys och Silvia Marsicano för tekniskt stöd.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Axio Observer Z1 |  Zeiss |
491912-9850-000 | inverted microscope |
| Multiline Argon Laser Lasos 77 | Lasos |
00000-1312-752 | multi-line (458/488/514 nm), 100 mW argon-ion laser |
| Laser TIRF slider | Zeiss |
423681-9901-000 | |
| 100X Objective | Zeiss |
421190-9900-000 | Oil, NA 1.45 Alpha-Plan |
| CCD Camera RetigaSRV Fast 1394 | QImaging |
||
| LAMBDA 10-3 optical filter changer with SmartShutter | Sutter Instrument Company |
||
| Software | |||
| Image ProPlus 6.3 Software | Media Cybernetics |
spot selection, ROI selection, fluorescence intensity determination | |
| Excel | Microsoft |
photobleaching correction, whole-cell and single-vesicle analyses | |
| GraphPad Prism 4.00 | GraphPad Software, Inc. |
statistical analysis | |
References
- Sudhof, T. C.
- Denk, W., Svoboda, K. Photon upmanship: why multiphoton imaging is more than a gimmick. Neuron. 18 (3), 351-357 (1997).
- Helmchen, F., Svoboda, K., Denk, W., Tank, D. W. In vivo dendritic calcium dynamics in deep-layer cortical pyramidal neurons. Nat Neurosci. 2 (11), 989-996 (1999).
- Tsien, R. Y.
- Matz, M. V., et al. Fluorescent proteins from non bioluminescent Anthozoa species. Nat Biotechnol. 17 (10), 969-9673 (1999).
- Ribchester, R. R., Mao, F., Betz, W. J. Optical measurements of activity-dependent membrane recycling in motor nerve terminals of mammalian skeletal muscle. Proc Biol Sci. 255 (1342), 61-66 (1994).
- Polo-Parada, L., Bose, C. M., Landmesser, L. T. Alterations in transmission, vesicle dynamics, and transmitter release machinery at NCAM-deficient neuromuscular junctions. Neuron. 32 (5), 815-828 (2001).
- Gaffield, M. A., Betz, W. J. Imaging synaptic vesicle exocytosis and endocytosis with FM dyes. Nat Protoc. 1 (6), 2916-2921 (2006).
- Miesenböck, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
- Axelrod, D. Total internal reflection fluorescence microscopy. Methods Cell. Biol. 89, 169-221 (2008).
- Sankaranarayanan, S., De Angelis, D., Rothman, J. E., Ryan, T. A. The Use of pHluorins for Optical Measurements of Presynaptic Activity. Biophys. J. 79, 2199-2208 (2000).
- Mattheyses, A. L., Simon, S. M., Rappoport, J. Z. Imaging with total internal reflection fluorescence microscopy for the cell biologist. J. Cell Sci. 123, 3621-3628 (2010).
- Wyatt, R. M. Balice-Gordon R.J. Heterogeneity in Synaptic Vesicle Release at Neuromuscular Synapses of Mice Expressing SynaptopHluorin. J. Neurosci. 28 (1), 325-335 (2008).
- Tsuboi, T., Rutter, G. A. Multiple forms of "kiss-and-run" exocytosis revealed by evanescent wave microscopy. Curr Biol. 13, 563-567 (2003).
- Miloso, M., et al. Retinoic Acid-Induced Neuritogenesis of Human Neuroblastoma SH-SY5Y Cells Is ERK Independent and PKC Dependent. J. Neurosci. Res. 75, 241-252 (2004).
- Jaskolski, F., Mayo-Martin, B., Jane, D., Henley, J. M. Dynamin-dependent Membrane Drift Recruits AMPA Receptors to Dendritic Spines. J Biol Chem. 284 (18), 12491-12503 (2009).
- Treccani, G., et al. Stress and corticosterone rapidly increase the readily releasable pool of glutamate vesicles in synaptic terminals of prefrontal and frontal cortex. Mol Psychiatry. 19 (4), 433-443 (1038).
- D'Amico, A., et al. The surface density of the glutamate transporter EAAC1 is controlled by interactions with PDZK1 and AP2 adaptor complexes. Traffic. 11 (11), 1455-1470 (2010).
- Perego, C., Di Cairano, E. S., Ballabio, M., Magnaghi, V. Neurosteroid allopregnanolone regulates EAAC1-mediated glutamate uptake and triggers actin changes in Schwann cells. J Cell Physiol. 227 (4), 1740-1751 (2012).
- Bergeron, A., Pucci, L., Bezzi, P., Regazzi, R. Analysis of synaptic-like microvesicles exocytosis of B-cells using a live imaging technique. PlosOne. 9, e87758 (2014).
- Encinas, M., et al. Sequential treatment of SH-Sy5Y cells with retinoic acid and brain-derived neurotrophic factor gives rise to fully differentiated, neutrophic factor-dependent, human neuron-like cells. J. Neurochem. 75 (3), 991-1003 (2000).
- Kume, T., et al. Dibutyryl cyclic AMP induces differentiation of human neuroblastoma SH-SY5Y cells into a noradrenergic phenotype. Neurosci Lett. 443 (3), 199-203 (2008).
- Diaspro, A., Chirico, G., Usai, C., Ramoino, P., Dobrucki, J. Photobleaching. Handbook of Biological Confocal Microscopy. Pawley, J. B. , Springer-Verlag New York, Inc.. New York. 690-699 (2006).
- Rossano, A. J., Chouhan, A. K., Macleod, G. M. Genetically encoded pH-indicators reveal activity-dependent cytosolic acidification of Drosophila motor nerve termini in vivo. J Physiol. 591 (7), 1691-1706 (2013).
